CN113583908B - 一株可降解油污的除油菌株Alcaligenes sp.及其应用 - Google Patents

一株可降解油污的除油菌株Alcaligenes sp.及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株可降解油污的除油菌株Alcaligenes sp.及其应用，属于微生物技术领域，本发明通过对石油污染土壤中的微生物进行富集、分离、纯化和筛选，获得针对油污具有高降解效率的除油菌种。该菌株为产碱杆菌(Alcaligenes sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021721，保藏日期为2021年06月15日。该菌种可适用于厨余油污的降解处理，且可广泛应用于机械、石油、化工等领域的除油去污。本除油菌种无毒、无刺激性、无腐蚀性，近乎无味，属绿色高效环保产品。

Description

一株可降解油污的除油菌株Alcaligenes sp.及其应用
技术领域
本发明涉及一株可降解油污的除油菌株Alcaligenes sp.及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
石油是一种黏稠的、深褐色液体，由不同碳氢化合物混合组成，包括多种芳香烃、烷烃以及环烷烃。石油类复杂混合物组分中包含芳香族化合物、饱和烃、树脂、沥青质，同时还含有硫、氮、磷、钒等多种元素。在工业社会，石油几乎主导了整个工业的生产，石油以及附加产业在国民经济中占有很高的比率，在工农业生产商具有广泛的用途。
食用油，也称为“食油”，是指在制作食品过程中使用的，动物或者植物油脂。常温下为液态。由于原料来源、加工工艺以及品质等原因，常见的食用油多为植物油脂，包括菜籽油、花生油等。
在餐饮行业与工业等领域，往往会出现大量难以清洗的油污，人们对油污清理主要有采用汽油、煤油、苯、酮、酸、碱等物质以及商品除油剂等。目前，除油剂是通过采用有机溶剂、表面活性剂或热碱溶液去除油污。但目前市面上的商品除油剂往往对环境污染较为严重，或是具有较为强烈的腐蚀性，或是使用清洗后水体难以处理，使得使用的成本高昂。
厨余垃圾，是指居民日常生活及食品加工、饮食服务、单位供餐等活动中产生的垃圾，包括丢弃不用的菜叶、剩菜、剩饭、果皮、蛋壳、茶渣、骨头等，其主要来源为家庭厨房、餐厅、饭店、食堂、市场及其他与食品加工有关的行业；具有易腐烂、热值低、有机质含量丰富等特点，常规的填埋和焚烧难以妥善处理，更容易引发环境污染，并存在一定的安全隐患。采用生物菌降解技术处理厨余垃圾，将大部分厨余垃圾降解掉，少量转化为有机肥进行回收利用，实现厨余垃圾的就地减量化、无害化处理和资源化利用。而剩饭剩菜的厨余垃圾中含有大量的食用油油脂，物理方法回收油脂存在油水分离不彻底等问题，不利于有机肥的回收利用，但是目前专门用于油脂降解的菌株少之又少，并且降解能力也普遍不高。
因此，目前从事该领域的技术人员致力于追寻一种解决去除油污的同时，无毒、无味、无刺激性、无腐蚀且所需成本低廉的方法及产品。
发明内容
针对目前缺少一种安全高效的去除油污的方法及相应的产品，本发明提供了一株产碱杆菌(Alcaligenes sp.)，所述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021721，保藏日期为2021年06月15日。
在本发明的一种实施方式中，所述菌株的筛选方法：将10g含油污染土样以20mL蒸馏水稀释，取5mL土样溶液加入50mL MSM培养基的锥形瓶中于中性环境、25～30℃条件下富集培养5天。转接至新鲜MSM培养基，重复转接后将培养液稀释并涂布在以石油萃取液为唯一碳源的无机盐固体培养基上。将平板上长出的菌落进行复筛，复筛长出的菌落进行划线分离，得到能以石油为唯一碳源生长的菌株，将该菌株命名为P3，其16S rRNA序列如SEQ IDNO.1所示，并于NCBI中进行BLAST比对，结果显示，该菌株与产碱杆菌属的相似度为99.79％，将与其相似度高的菌株构建系统进化树(具体可见图1)，将其命名为产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3。
本发明还提供了一种含有上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3的微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中，微生物菌剂中，所述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3的含量为：OD600≥0.01。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为固体、液体或粉末。
本发明还提供了一种可降解油污的产品，所述产品中含有上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为含有上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3的化学品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为含有上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3的日化产品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为含有上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3的微生物洗涤剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为含有上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3的表面活性剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为含有上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3的厨余垃圾降解剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，所述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3的含量为：OD600≥0.01。
本发明还提供了一种降解油污的方法，所述方法为，将上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3，或上述微生物制剂，或上述产品添加至含有油污的环境中，进行降解反应。
在本发明的一种实施方式中，所述含有油污的环境是指，含有食用油油污的环境，含有石油油污的环境或含有油污的厨余垃圾环境。
在本发明的一种实施方式中，所述食用油包括但不限于菜籽油、花生油、火麻油、玉米油、橄榄油、山茶油、棕榈油、葵花子油、大豆油、芝麻油、亚麻籽油(胡麻油)、葡萄籽油、核桃油、牡丹籽油。
在本发明的一种实施方式中，所述食用油还包括调和油，所述调和油一般选用精炼大豆油、菜籽油、花生油、葵花籽油、棉籽油等为主要原料，还可配有精炼过的米糠油、玉米胚油、油茶籽油、红花籽油、小麦胚油等特种油酯。
在本发明的一种实施方式中，所述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3在含有油污的环境中的添加量为：OD600≥0.01。
在本发明的一种实施方式中，所述降解反应的降解条件为：常温有氧状态，如30℃、200rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
(1)制备食用油萃取液
向25mL食用油中加入50mL乙酸乙酯，于30℃、200rpm的恒温摇床中萃取1h后所获得的液体即为食用油萃取液；
(2)活化菌株
方法为：挑取产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3单菌落至含有1％(v/v)食用油萃取液的MSM液体培养基后，置于30℃恒温摇床中以200rpm的转速振荡培养至OD600为1.0；制备得到活化后的菌液；
(3)将活化后得到的菌液1mL转接至添加含有1％(v/v)食用油萃取液的新鲜MSM液体培养基中，重新置于30℃恒温摇床中以200rpm的转速振荡进行传代培养直至菌液生长量达到OD600为1.0，以上操作重复3次；
(4)取步骤(3)得到的菌液1mL，于新鲜的含有1％(v/v)食用油萃取液的50mL MSM培养基中，30℃、200rpm条件下培养12h，取该培养液作为种子液；
(5)将种子液离心，收集菌体，将菌体用MSM培养基重悬至OD＝1.0后，取100μL产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3重悬后的种子液接种于10mL MSM培养基中，加入食用油萃取液1％(v/v)作为唯一碳源，置于30℃恒温摇床中以200rpm的转速振荡培养。
在不同时间进行取样，加入等体积的乙酸乙酯萃取，将有机相取400μL进行GCMS检测(检测油脂中所含长链烷烃的含量)，将水相取1mL用分光光度计测量OD600。
本发明还提供了一种降解厨余垃圾中油污的方法，所述方法为，将上述产碱杆菌，或上述微生物制剂，或上述产品添加至含有油污的厨余垃圾环境中，进行降解反应。
本发明还提供了上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3，或上述微生物制剂在制备可降解油污的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为含有上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3的化学品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为含有上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3的日化产品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为含有上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3的微生物洗涤剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为含有上述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3的表面活性剂。
有益效果
(1)本发明提供了一株筛选到的新菌株Alcaligenes sp.P3，它能够利用石油与食用油作为唯一碳源生长，并对其进行降解，实现高效的油污降解。
(2)本发明提供了一种能够高效降解油污的新菌株——产碱杆菌P3(Alcaligenessp.P3)，可通过MSM无机盐培养基，以食用油作为唯一碳源生长并实现对其的降解，可以在含有1％(v/v)食用油萃取液的MSM培养基中144小时降解约60％的食用油。
生物材料保藏
一株产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3，分类学命名为Alcaligenes sp.P3，已于2021年06月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021721，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1：产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3菌株16S rRNA序列分析比对后构建的系统发育树。
图2：产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3在添加食用油的无机盐液体培养基中的生长情况。
图3：产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3在添加食用油的无机盐液体培养基中对底物的降解剩余率。
具体实施方式
结合附图和具体情况对本发明的具体实施方式做详细说明，使其技术内容更加清楚和便于理解，并不是对本发明的限制。
下述实施例中所采用的金龙鱼食用调和油，成分为：大豆油、菜籽油、花生油、葵花籽油、稻米油、玉米油、芝麻油和胡麻油，购自天猫金龙鱼官方旗舰店。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
MSM液体培养基(1L)：K2HPO4·3H2O 6.8g，KH2PO4 3.7g，MgSO4 0.1g，Na2SO4 1.0g和0.5mL金属离子缓冲液；其中，所述金属离子缓冲液(1L)配方是：FeCl2·4H2O 0.3g，MnCl2·4H2O 0.02g，H3BO3 0.0124g，CuCl2·2H2O 0.0034g，CoCl2·6H2O 0.038g，ZnCl20.014g和Na2MoO4·2H2O 0.04g，溶于0.1M的盐酸溶液中。
MSM固体培养基(1L)：是在MSM液体培养基中加入1.5％的琼脂粉制成的。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
油脂的检测：
以油脂中携带的长链烷烃作为标准参考，油脂中含有多种烃类物质，长链烷烃相较于短链烷烃更加稳定，同时所选取的C19/C20/C24在测定样品过程中色谱峰面积较大，较为明显，且在所有样品测定过程中均能够稳定存在；本实验中主要以C19H40作为标准，检测方法为：GC-MS检测条件为气相色谱(Agilent 6850/5975C)，使用氦气作为载气，检测程序最初设置为70℃，保持时间5min，后以15℃/min的速度升至240℃，接下来以20℃/min的速度升至300℃，进样体积为2μL。
C19H40含量的计算方法：采用面积归一化法进行计算，方法为：C19H40峰面积比率(％)＝C19H40面积/总面积(所测定峰图的总面积)。
食用油的降解剩余率：
食用油的降解剩余率的计算，本发明以食用油当中的C19H40作为标准参考，计算该物质的降解剩余率，方法如下：
降解剩余率(％)＝C19H40降解后的峰面积比率/C19H40降解前的峰面积比率×100％。
实施例1：产碱杆菌Alcaligenes sp.P3的分离、鉴定
具体步骤如下：
1、菌株的筛选和分离
(1)采取样品
土壤样品来源：黑龙江大庆油田附近石油化工污染地区。
(2)菌株的筛选和分离
石油萃取液的制备：向50g石油污染土样加入150mL乙酸乙酯，于30℃、200rpm的恒温摇床中萃取1h后所获得的上层红褐色液体。
取10g石油污染土样，加入20mL蒸馏水后涡旋振荡。充分混匀后取土样溶液5mL加入到盛有50mLMSM培养基的250mL三角瓶中，置于30℃恒温摇床中以200rpm的转速振荡进行富集培养。5天后，取1mL培养物接入新鲜的含有1％(v/v)石油萃取液的MSM培养基中，以石油萃取液作为唯一碳源，筛选生长与降解性能良好的菌株。重复上述操作，将新的培养样品置于30℃恒温摇床中以200rpm的转速振荡，连续传代，进行选择性培养。
将传代4次后的培养物用生理盐水分别稀释105、106、107倍，取100μL稀释后的培养物分别涂布在表面涂有20μL石油萃取液的20mL MSM固体平板上，将平板放置在恒温培养箱内，在30℃条件下培养，直至长出形态分明的单菌落。
观察单菌落的形态，选取不同种形态的单菌落，挑取至盛有5mL MSM培养基的摇管中，加入1％(v/v)石油萃取液，将摇管放入30℃恒温摇床中以200rpm的转速振荡培养。选取生长状态较好的培养物，用接种环蘸取后再次在表面涂有20μL石油萃取液的20mL MSM固体平板上划线，重复数次以上步骤。
2、菌株的鉴定
菌株为革兰氏阴性菌，喜好氧气，能够以石油与食用油作为唯一碳氮源生长。
用16S rRNA通用引物(27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’及1492R5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’)进行扩增并测序，将扩增结果送至公司进行测序。使用NCBI数据库中的核苷酸BLAST(BLASTn)在BLAST中检索菌株的16S rRNA序列使用MEGA7的邻接(NJ)方法建立的系统发育树。如图1所示，菌株和产碱杆菌属亲缘关系最近。结合以上的生理生化的菌学特征和进化树分析，将其鉴定为产碱杆菌，命名为产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3。
实施例2：产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3在食用油环境下的生长情况及其对食用油的降解能力
本实施例中采用的食用油是调和油，金龙鱼食用调和油中含有多种其余降解实验过程中的植物油(配料为：大豆油、菜籽油、花生油、葵花籽油、稻米油、玉米油、胡麻油和芝麻油)，因此，调和油具有代表性。
1、食用油萃取液
向25mL食用油中加入50mL乙酸乙酯，于30℃、200rpm的恒温摇床中萃取1h后得到的液体，为食用油萃取液。
2、种子液制备
挑取产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3单菌落至50mL MSM液体培养基中，并加入1％(v/v)食用油萃取液作为唯一碳源，置于30℃恒温摇床中以200rpm的转速振荡培养，直至菌液生长量达到OD600为1.0；
取菌液1mL加入到新鲜的含有1％(v/v)食用油萃取液的50mL MSM培养基中，重新置于30℃恒温摇床中以200rpm的转速振荡进行传代培养直至菌液生长量达到OD600为1.0，以上操作重复3次。
取重复传代后的菌液1mL于新鲜的含有1％(v/v)食用油萃取液的50mL MSM培养基中，30℃、200rpm条件下培养12h，取该培养液作为种子液。
2、生长降解体系配制
将步骤1制备得到的种子液离心，收集菌体，将菌体用MSM培养基重悬至OD＝1.0后，取100μL产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3重悬后的种子液接种于10mL MSM培养基中，加入食用油萃取液1％(v/v)作为唯一碳源，置于30℃恒温摇床中以200rpm的转速振荡培养。
定时取出含10mL培养物的三角瓶，萃取培养物中油组分(萃取条件：等体积加入乙酸乙酯，于30℃、200rpm的恒温摇床中萃取1h后所获得的液体)，通过GC-MS测定油组分含量(检测油脂中长链烷烃C19H40的含量)，并且分光光度计测定OD600；
不同时间培养得到的培养物中的C19H40含量及OD600值的检测结果如表1所示：
表1：不同时间培养得到的培养物中的C19H40含量及OD600值
天数(d) C19H40(％)实验组 OD600实验组
0 4.1451 0.007667
2 7.124 0.471
4 8.499 1.075
6 3.0665 0.895
8 3.0692 0.899667
由表1可知，随着培养时间的增加，食用油的含量逐渐降低，其中第2天和第4天的数据增加是由于油脂在空气中会有一定程度的氧化和分解，同时由于GC-MS检测精度极高，对于数据微小变化过于敏感，因此出现先升后降的趋势，但是总体上看，本发明的菌株对于油脂具有降解能力。
3、生长情况检测与降解能力测定
分别取用步骤2中0～8d的培养液，加入等体积乙酸乙酯，摇床振荡1h，6,000rpm离心10min。将上层有机相取400μL用0.22μm滤膜过滤后作为样品，使用GCMS通过检测油组分含量即，通过检测油脂中长链烷烃C19H40的含量，计算降解剩余率。
以添加食用油萃取液的MSM培养基为空白对照组(降解剩余率为100％)，降解剩余率通过实验组与空白组差值进行计算，菌株不同时间的降解剩余率结果如表2及图3所示：
表2：菌株不同时间的降解剩余率及OD600值
天数(d) 降解剩余率(％)
0 100
2 113.1449
4 131.549
6 41.6743
8 22.4057
如图2所示，通过分光光度计检测水相中菌液的浓度，绘制Alcaligenes sp.P3生长曲线图。产碱杆菌P3在食用油环境中培养4天后可达到稳定期。
如图3所示，通过GCMS检测有机相中食用油各组分含量，通过Area-NormalizationMethod处理数据后，绘制相应降解曲线图。数据之所以是先升后降，是因为食用油的主要成分中包含多种脂肪酸，与空气等作用会发生氧化，使得组分的含量有所变化。
由表2可知，通过与对照组进行比对，产碱杆菌P3在食用油环境中培养8天后对食用油的降解率可高达78％。
实施例3：产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3对食用油的降解能力
具体实施方式同实施例2，区别在于，将食用油更改为葵花籽油，采用产碱杆菌(Alcaligenes sp.)P3对葵花籽油进行降解，结果如表3所示：
表3：培养不同时间对葵花籽油的降解率
天数(d) 降解剩余率(％) OD600
0 100 0.002
1 97.6189 1.904
2 81.6936 2.274
4 79.2381 2.125
6 59.461 1.995
8 61.0952 2.235
由表3可知，随着培养时间的增加，葵花籽油的含量随着菌株的生长而逐步降低，该菌株对于葵花籽油的降解率在第6天就能达到将近40％，也证明了该菌株对于油脂是具有相应的降解能力的。而此处，组分含量变化既有自身反应导致的上升和菌株对其降解导致的下降，由于葵花籽油的分解反应产生的小于菌株降解及GC-MS检测灵敏度的影响，此处的降解剩余率呈下降趋势。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 东朝科技发展（上海）有限公司
<120> 一株可降解油污的除油菌株Alcaligenes sp. 及其应用
<130> BAA210994A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1441
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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agtccggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat 1320
cagaatgtcg cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga 1380
gtgggtttca ccagaagtag gtagcctaac cgtaaggagg gcgctaccac gtgattaccg 1440
g 1441

Claims (9)

1.一株产碱杆菌（Alcaligenes sp.），其特征在于，所述产碱杆菌（Alcaligenes sp.）保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2021721，保藏日期为2021年06月15日。
2.含有权利要求1所述的产碱杆菌的微生物制剂。
3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，微生物制剂中，所述产碱杆菌的含量为：OD600 ≥ 0.01。
4.一种可降解植物油的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的产碱杆菌。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品为日化产品、微生物洗涤剂或厨余垃圾降解剂。
6.如权利要求4或5所述的产品，其特征在于，所述产品中，产碱杆菌的含量为：OD600 ≥0.01。
7.一种降解植物油的方法，其特征在于，将权利要求1所述的产碱杆菌，或权利要求2或3所述的微生物制剂，或权利要求4~6任一所述的产品添加至含有植物油的环境中，进行降解反应。
8.一种降解厨余垃圾中油污的方法，其特征在于，将权利要求1所述的产碱杆菌，或权利要求2或3所述的微生物制剂，或权利要求4~6任一所述的产品添加至含有油污的厨余垃圾环境中，进行降解反应。
9.权利要求1所述的产碱杆菌，或权利要求2或3所述的微生物制剂在制备可降解植物油的产品中的应用。
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