CN105199981A

CN105199981A - 食碱戈登氏菌yc-rl2及其应用

Info

Publication number: CN105199981A
Application number: CN201510587539.6A
Authority: CN
Inventors: 闫艳春; 任磊; 贾阳; 乔铖
Original assignee: Graduate School of CAAS
Current assignee: Graduate School of CAAS
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2015-09-15
Publication date: 2015-12-30
Anticipated expiration: 2035-09-15
Also published as: CN105199981B

Abstract

本发明提供一种能够降解多种邻苯二甲酸酯类物质的食碱戈登氏菌(Gardenia？alkanivorans)YC-RL2，其保藏编号为CGMCC？No.10992。该菌能够在5天内将无机盐培养基中含有的100mg/L邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)100％降解，同时还可以降解邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)。本发明的食碱戈登氏菌株YC-RL2能够应用于邻苯二甲酸酯类污染物的降解，同时对于上述污染物导致的环境污染的生物修复处理具有良好的应用潜质，具有较好的经济价值和应用前景。

Description

食碱戈登氏菌YC-RL2及其应用

技术领域

本发明涉及微生物学及生物降解领域，具体地说，涉及食碱戈登氏菌YC-RL2及其应用。

背景技术

邻苯二甲酸酯(PhthalateAcidEsters，简称PAEs)是一类重要的工业原料，被广泛用于塑料、农药、化妆品、油漆、橡胶等行业，它具有致癌致畸致突变和生殖发育毒性等多种毒性，可通过多种途径进入环境，由此引起的环境问题得到世界的普遍关注。由于人类对邻苯二甲酸酯的大量使用，使它们通过不同的途径进入大气、土壤、水环境，对生物圈造成了不同程度的污染。PAEs与我们的日常生活密切相关，可以通过呼吸、饮食、饮水和皮肤接触进入人体，对人体的健康产生不同程度的危害。常见的有邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)和邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)。最近研究指出PAEs具有环境激素的作用，它能干扰生物和人类的内分泌系统，引起精子数量减少、精子形成中止、生殖能力下降、后代数量减少、子宫粘膜组织增生等。DEHP是一种常见的PAEs，广泛用于食品包装材料、容器、医疗器械以及儿童玩具等领域，也是目前世界上应用广泛和生产量大的人工合成的有机污染物之一。DEHP为无色透明油状液体，具有较高的流动性、低水溶性以及低挥发性，其水解反应很慢。DEHP能够对机体造成生殖毒性、发育毒性、神经毒性、多器官癌变等多种损伤。

PAEs在环境中可通过非生物和生物两种途径进行降解，前者包括光解和水解，后者主要是微生物降解，大多数情况下前者降解速率远低于后者，因此微生物降解是PAEs在自然环境中的主要降解途径。目前，国内外的研究主要集中在从活性污泥中筛选高效降解菌株对单一种类PAEs的生物降解。

有关食碱戈登氏菌的报道相对较少，已知的戈登氏菌属在自然生态系统分布广泛，如土壤、水、河口泥沙等，在人类活动系统中，包括产油水井、污水污泥以及临床病例中都有存在。食碱戈登氏菌是从受污染土壤中首次分离得到的，根据其代谢底物的特点可被应用到有机污染物的生物降解和被污染环境的生物修复。

近年来，研究人员对污染物的生物降解进行了广泛细致的研究，并取得了许多成果。然而，微生物在工业废水中污染物的生物降解研究相对较少，主要是工业废水恶劣的条件所制约，如高盐度、极端pH、溶氧量低等。因此，提供一种在高盐浓度、高pH、温度范围广泛条件下对多种邻苯二甲酸酯类物质具有降解能力的菌株对于治理环境污染具有重要的经济价值和现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株降解底物谱广的食碱戈登氏菌YC-RL2及其应用。

为了实现本发明目的，本发明从山东省菏泽市东明县油田附近土壤中分离到一株能够降解多种邻苯二甲酸酯的细菌。该菌可将无机盐离子培养基中各100mg/L的邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)降解，对菌株进行连续转接测定降解能力，表明该菌降解能力稳定。在电镜下观察(图1)，该菌为短杆状，无鞭毛，无芽孢。菌落呈圆形，边缘光滑，表面突起，产生红色素(图2)。菌株革兰氏染色、过氧化氢酶活性及脲酶反应均为阳性；氧化酶活性和吲哚反应为阴性。基于形态特征及生理生化特征，将该菌株鉴定为食碱戈登氏菌(Gardeniaalkanivorans)，命名为YC-RL2。该菌株于2015年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.10992。

本发明还提供含有所述食碱戈登氏菌YC-RL2的菌剂。

本发明还提供由所述食碱戈登氏菌YC-RL2或所述菌剂制备的生物清洁剂。

本发明还提供所述食碱戈登氏菌YC-RL2、所述菌剂或所述生物清洁剂在有机污染物生物降解中的应用。

其中，所述有机污染物为邻苯二甲酸酯类物质。所述邻苯二甲酸酯类物质包括邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯等。

本发明还提供所述食碱戈登氏菌YC-RL2、所述菌剂或所述生物清洁剂在邻苯二甲酸酯类环境污染的生物修复中的应用。

所述邻苯二甲酸酯类包括但不限于邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯。

本发明进一步提供所述食碱戈登氏菌YC-RL2在制备邻苯二甲酸酯类物质的生物降解剂中的应用。

本发明的食碱戈登氏菌YC-RL2能够在5天内100％降解无机盐培养基中含有的浓度为100mg/L的DEHP，并能够降解DCHP、DMP、DEP和DBP。YC-RL2对上述底物具有较高的浓度耐受，在浓度为400-1000mg/L时，5天内降解率均在60％以上。

另外，本发明的食碱戈登氏菌YC-RL2对环境温度具有较宽范围的耐受能力，在10-40℃之间都能高效降解DCHP、DMP、DEP和DBP；对环境盐离子浓度也具有较高的耐受能力，在NaCl浓度为0-10％时，可生长并降解上述底物，5天内对上述底物(各100mg/L)的降解率均大于50％；同时，对碱性环境也具有较强的耐受能力，可耐受的pH范围为pH6-11，5天内对上述底物(各100mg/L)的降解率均大于50％。

本发明提供的食碱戈登氏菌YC-RL2及其菌剂在使用过程中无污染，无公害，能够应用于多种邻苯二甲酸酯类环境污染的生物修复及具有较高盐浓度、高pH生产废水的处理，可在较低和较高温度下进行生物修复，可广泛应用于环境土壤清洁领域及工业废水的清洁处理，具有较好的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为本发明食碱戈登氏菌YC-RL2在电镜下的形态结构图。

图2为本发明食碱戈登氏菌YC-RL2在LB固体培养基上的菌落形态。

图3为本发明食碱戈登氏菌YC-RL2的系统发育树。

图4为本发明实施例2中HPLC法检测食碱戈登氏菌YC-RL2对浓度分别为100mg/L的DEHP、DCHP、DBP、DMP和DEP的降解能力。

图5为本发明实施例2中DEHP、DCHP、DBP、DMP和DEP浓度与315nm处吸收峰面积关系标准曲线图。

图6为本发明实施例2中食碱戈登氏菌YC-RL2对不同浓度底物的降解率。

图7为本发明实施例2中食碱戈登氏菌YC-RL2在不同温度条件下对各底物的降解率。

图8为本发明实施例2中食碱戈登氏菌YC-RL2在不同pH条件下对各底物的降解率。

图9为本发明实施例2中食碱戈登氏菌YC-RL2在不同盐浓度条件下对各底物的降解率。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本申请使用的无机盐培养基组成如下：1.0g/LNH₄NO₃，0.5g/LNaCl，0.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.5g/LKH₂PO₄，1.5g/LK₂HPO₄和0.005g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。

斜面培养基组成如下：10.0g/L蛋白胨，5.0g/LNaCl，10.0g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。

平板固体培养基为相应的培养基中加入1.5％的琼脂。

实施例1食碱戈登氏菌YC-RL2的分离和鉴定

1、菌株的分离

从山东省菏泽市东明县受石油污染物的农田土壤中采集活性污泥样品。在无菌操作条件下，将5g活性污泥样品接种到用50mL含100mg/LDEHP的无机盐离子培养基中，在30℃，180rpm条件下培养。每培养7天后，取1mL转接至新鲜无机盐培养基中，连续转接3次。

将驯化后的菌液划线到含有100mg/LDEHP的无机盐培养基平板上，30℃培养箱中培养3天。挑取在平板上的单菌落转接到含浓度为100mg/LDEHP的无机盐培中培养7天。重复三次，直至分离获得纯化的菌株，将菌株命名为YC-RL2。

2、菌株的形态学特征

该菌为革兰氏染色为阳性短杆菌，菌体直或微弯、无鞭毛，无芽孢(图1)；在LB培养基上菌落为黄色，湿软，圆形凸起，边缘规整，不透明，表面光滑(图2)。

3、菌株生理生化特性

菌株革兰氏染色、过氧化氢酶活性及脲酶反应均为阳性；氧化酶活性和吲哚反应为阴性。

4、16SrDNA鉴定

将菌株YC-RL2接种到LB培养基中，30℃、180rpm条件下过夜培养，取1mL菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，得到的基因DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测，-20℃保存备用。

设计用于扩增16SrDNA序列的一对通用引物：27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，用菌株YC-RL2的基因组DNA作为模板，加入PremixTaq^TM，进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA纯化回收试剂盒纯化，连接到pGM-T载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，在37℃下培养12h，挑取白色菌落至液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，送上海生工生物公司进行测序。将测序结果(GenBank：KR819396)在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行Blast比对分析，并利用MEGA软件(版本:6.0)构建系统发育树(图3)。

综合菌体形态、生理生化特性、16SrDNA基因序列，菌株YC-RL2被鉴定为食碱戈登氏菌(Gardeniaalkanivorans)。

实施例2食碱戈登氏菌YC-RL2的降解性能试验

1、食碱戈登氏菌YC-RL2对邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)的降解

气相色谱法(HPLC)检测食碱戈登氏菌YC-RL2分别对无机盐培养基中DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP的降解作用，以及对DEHP的浓度耐受。

将菌株YC-RL2接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到分别含DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP各100mg/L的无机盐培养基中，作为处理组，以未接种菌株的含DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP各100mg/L混合物的无机盐培养基作为对照组，对照组与处理组各设三个重复。将对照组与处理组在30℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养，培5天停止培养并测定每种物质的浓度。

向取得的样品中加入等体积正己烷，超声波充分振荡抽提10min，静置1小时，取上层有机溶剂，将有机溶剂挥发干后，用等体积的甲醇重溶，然后用0.22μm的有机系滤膜过滤，进行HPLC分析。

HPLC分析条件为：Agilent1200高效液相色谱仪，色谱柱：Eclipse-C18(150mm×4.6mm×5μm)，流动相为甲醇:乙腈:水＝45:40:15(v/v)，进样量2μL，流速1.0mL/min，使用DAD检测器进行检测，检测波长为315nm，DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP的保留时间分别为3.463min、7.232min、27.163min、22.194min和15.375min(图4)。利用DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP的标准品绘制浓度与315nm处吸收峰面积之间的标准曲线(图5)。

降解率的计算：根据不同底物的标准曲线计算每种底物每天在无机盐培养基中的残留浓度，再根据降解率计算公式得到菌株YC-RL2对底物的降解率(表1)。

降解率％＝(对照组中底物的终浓度-处理组中底物的终浓度)/对照组中底物的终浓度×100％

自然降解率％＝(底物初始浓度-对照组中底物浓度)/底物初始浓度×100％

表1菌株YC-RL2对各种底物的降解率与底物的自然降解率

2、食碱戈登氏菌YC-RL2对不同浓度DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP的耐受

分别以DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中，设置400mg/L、500mg/L、700mg/L、1000mg/L、1500mg/L和2000mg/L共6个浓度，随后将菌株YC-RL2接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。同时，以含相应浓度底物的无机盐离子培养基不接菌作为对照组。培养5天后，测定各处理底物的浓度。

从图6可以看出，经过5天培养后，底物浓度200-700mg/L时被100％降解，随着底物浓度升高降解率逐渐降低。

3、食碱戈登氏菌YC-RL2对温度的耐受能力

将菌株YC-RL2接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种无机盐离子培养基中，分别以DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中(浓度各自为100mg/L)，分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养。以未接种菌株的并分别加入DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP至浓度为100mg/L的相同培养基作为对照组，同样在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃下，180rpm摇床振荡避光培养。培养5天后测定DEHP浓度。

结果如图7所示，食碱戈登氏菌YC-RL2降解底物的最适温度是30℃，在10-50℃均可降解DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP。在较高的温度下(50℃)，对各底物的降解效率均低于60％。在10-40℃条件下，对各底物的降解效率均大于60％。

4、食碱戈登氏菌YC-RL2对pH耐受能力

分别配制不同pH(5-12)的无机盐离子培养基，灭菌备用。向配制的无机盐离子培养基中同时加入DEHP至底物浓度100mg/L。将菌株YC-RL2接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中，分别以DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中(浓度各自为100mg/L)，作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。

以未接种菌株不同pH的同时分别加入DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP至浓度为100mg/L的相同培养基作为对照组，同样在30℃下，180rpm摇床振荡避光培养。培养5天后测定DEHP浓度。

结果如图8所示，pH影响食碱戈登氏菌YC-RL2对底物的降解。当pH值从5.0增加到7.0，底物的降解率也逐渐由29％增加到100％。在pH值为7.0-11.0时，YC-RL2对底物的降解效率由100％逐渐降低至35％，当pH为12.0时，底物基本无降解。

5、食碱戈登氏菌YC-RL2对盐浓度耐受能力

分别配制不同NaCl浓度(0～100g/L)的无机盐离子培养基，灭菌备用。向配制的无机盐离子培养基中分别以DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP作为唯一碳源至浓度各自为100mg/L。将菌株YC-RL2接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。

以未接种菌株的不同NaCl浓度分别加入DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP至浓度为100mg/L的相同培养基作为对照组，同样在30℃下，180rpm摇床振荡避光培养。培养5天后测定DEHP浓度。食碱戈登氏菌YC-RL2能够在盐浓0-10％条件下对DEHP降解率均在60％以上，当盐度大于10％，降解率显著下降，低于50％，结果如图9所示。

实施例3食碱戈登氏菌YC-RL2在污染土壤的生物修复中的应用

本实施例中使用的土壤取自中国农业科学院西门花园土壤。将食碱戈登氏菌YC-RL2在LB液体培养基中培养至对数期(OD₆₀₀＝0.8，菌体浓度约为2×10⁸CFU/mL)，向土壤中加入制备的菌液至终浓度分别为1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶和5×10⁶CFU/g土壤(每个处理为100g土壤)，并向土壤中分别加入DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP至各浓度分别为100mg/kg，作为处理组；同时，以相同条件下加入相同浓度污染物且不接菌的土壤作为对照组，将最终获得的培养体系(处理组与对照组)充分混匀。将样品在恒温恒湿培养箱中，于30℃条件下，湿度维持20％进行培养，在培养的第10日取样测定各种底物的浓度。对照组与处理组中每个处理均设3个重复。

取样方法：每个处理组分别取10g土壤，加入20mL正己烷，在摇床中剧烈震荡1小时，4℃静置过夜，取2mL过无水Na₂SO₄柱子收集流出正己烷溶液，以氮气吹扫使正己烷完全挥发，加入甲醇使溶质复溶并经0.22μm的有机相滤膜进行过滤，此样品用于DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP浓度检测。根据最终测定处理组与对照组中底物的浓度计算食碱戈登氏菌YC-RL2在土壤中对底物的降解率。

食碱戈登氏菌YC-RL2对污染土壤中底物的降解率如表2所示，随着加入菌体量的增加各种底物的降解率逐渐提高，当接菌量达到5×10⁵CFU/g土壤时，各底物的降解率基本达到最大值。

表2食碱戈登氏菌YC-RL2对污染土壤中底物的降解率

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.食碱戈登氏菌(Gardeniaalkanivorans)YC-RL2，其保藏编号为CGMCCNo.10992。

2.含有权利要求1所述食碱戈登氏菌YC-RL2的菌剂。

3.由权利要求1所述食碱戈登氏菌YC-RL2或权利要求2所述菌剂制备的生物清洁剂。

4.权利要求1所述食碱戈登氏菌YC-RL2、权利要求2所述菌剂或权利要求3所述生物清洁剂在有机污染物生物降解中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述有机污染物为邻苯二甲酸酯类物质。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类物质包括邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯。

7.权利要求1所述食碱戈登氏菌YC-RL2、权利要求2所述菌剂或权利要求3所述生物清洁剂在邻苯二甲酸酯类环境污染的生物修复中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类包括邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯。

9.权利要求1所述食碱戈登氏菌YC-RL2在制备邻苯二甲酸酯类物质的生物降解剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类物质包括邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯。