CN102102088A - 一种石油烃类污染物降解菌剂的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用甘薯淀粉废水生产巨大芽孢杆菌石油烃高效降解菌剂的方法，属于环境生物技术领域。石油烃降解株菌采用的是一株分离石油污染土壤的芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，其菌剂的生产方法包括5个步骤：培养基配制、菌种活化、液体种子制备、液态发酵、菌剂制备，以甘薯淀粉废水提供发酵培养基的主要碳源和水，以玉米秸秆为微生物的载体，制备固体菌剂。本发明技术方案不仅为高浓度甘薯淀粉废水的资源化利用提供了一条新途径，而且生产的石油烃降解菌剂能高效原位修复石油污染的土壤，保护生态环境。

Description

一种石油烃类污染物降解菌剂的生产方法

技术领域：

本发明属于环境保护技术领域，涉及一种适用于石油污染土壤修复的微生物菌剂的制备方法。

背景技术：

在石油开采和油井施工作业过程中，易造成石油烃泄漏，污染土壤。盐碱土壤本身土壤理化性质差，石油污染进一步恶化了土壤的理化性质，干扰土壤物质循环。此外，石油中含有的多环芳烃等污染物具有“三致”效应，具有较高的生态风险，对人类健康具有潜在威胁。因此，石油污染土壤的修复是一项紧迫任务。

目前，石油污染土壤的修复方法主要有：萃取法、淋洗法、堆肥法、植物修复法、微生物修复法等。微生物由于具有繁殖能力强、适应性强、降解谱广等优点，常用于清除有机污染物；从土壤环境中筛选出来的土著石油降解菌也常用于石油污染土壤的修复。例如：中国专利(2004100380539)公开了一株可以降解石油烃的短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis HTCGMCC No.1142；中国专利(200710059755.9)公开了一株低温解烃的极小单胞菌Pusillimonassp.T7-7。除此以外，目前报道的可以降解石油烃、修复石油污染土壤的微生物还有：假单胞菌(Pseudomonas sp.)、棒杆菌(Corynebacterium sp.)、微球菌(Micrococcus sp.)、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、无色杆菌(Achromobacter sp.)、诺卡氏菌(Nocardiasp.)，等等。从土壤中分离筛选高效石油烃降解菌，特别是适应特定土壤环境的降解菌，仍是石油污染土壤修复的研究热点之一。

甘薯易腐烂，不宜长期存放。甘薯的深加工，可以解决因贮存鲜薯不当而导致大量烂薯的现象，甘薯精制淀粉经过不同深度的加工，可生产出数百种有价值的产品，增值10-30倍左右。但是，目前的加工工艺，每生产1吨甘薯淀粉大约产出6-10吨高浓度有机废水，这些废水的COD值高达10000mg/L以上，主要含有溶解性淀粉、蛋白质、果胶、有机酸及少量的油脂，易腐败发酵，使水质发黑发臭，排入河流会消耗水中的溶解氧，促进藻类及水生植物繁殖，量大时河流严重缺氧，发生厌氧腐败，散发恶臭，鱼、虾、贝类等水生动物可能会因此而窒息死亡。而采用一般污水处理工艺将如此高浓度的废水处理达标，消耗惊人。从另一个角度考虑，甘薯淀粉废水中的有机质(包括：蛋白质、果胶、糖类等)是微生物生长的良好营养底物，可以做成微生物培养基，发酵生产微生物产品。

本专利发明了一种用甘薯淀粉废水为主要原料，生产石油烃类污染物降解菌剂的方法，采用的菌株是从石油污染土壤中分离出的一株高效降解石油烃类污染物的巨大芽孢杆菌。目前尚未发现文献报道用甘薯淀粉废水生产石油烃类污染物降解菌剂的生产方法。

发明内容：

针对目前石油污染土壤修复中的问题，本发明提供一种适用于强化修复石油污染土壤的微生物菌剂的低成本生产方法。

本发明所使用的菌株是由发明人从石油污染的土壤中分离筛选出来的1株高效降解石油烃的细菌，于2010年10月25日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的分类命名：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，菌株编号：P9菌株，保藏编号：CGMCCNo..4270。

本发明所述的菌剂的生产方法如下：

1、培养基配制：

1)菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨2g，酵母膏1g，氯化钠5g，琼脂20g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；

2)菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨2g，酵母膏2g，氯化钠5g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；

3)种子培养基(液体，10L)：石油污染的土壤(即油泥，石油烃含量2％以上)1kg，加甘薯淀粉废水至10L，pH 7.0-7.5；

4)发酵培养基(液体，200L)：石油污染的土壤(即油泥，石油烃含量2％以上)10kg，加甘薯淀粉废水至200L，pH 7.0-7.5；

以上培养基均在115℃-121℃灭菌15-30min。

2、菌种活化：挑取石油烃降解菌接种至菌种保藏培养基平板，划线分离纯化，于30℃培养至有明显的单菌落生长，挑取单菌落接种于菌种活化培养基中，于30℃，150-200r/min摇床振荡培养12-36h；

3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种石油烃降解菌，于30℃，通空气培养12-36h，得到液体种子。

4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种石油烃降解菌液体种子，于30℃，通空气培养18-60h，得到活菌体培养物。

5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，按照重量比为1∶1与粉碎的玉米秸秆混合均匀，静态通风至含水量30％，包装，保存于干燥阴凉处。

具体实施方式：

由本发明技术方案生产的石油烃降解菌剂能够有效降解土壤中的石油烃类污染物。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1：石油烃降解菌剂生产

1、培养基配制：

1)菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨2g，酵母膏1g，氯化钠5g，琼脂20g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.2；

2)菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨2g，酵母膏2g，氯化钠5g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.2；

3)种子培养基(液体，10L)：石油污染的土壤(即油泥，石油烃含量2％以上)1kg，加甘薯淀粉废水至10L，pH 7.2；

4)发酵培养基(液体，200L)：石油污染的土壤(即油泥，石油烃含量2％以上)10kg，加甘薯淀粉废水至200L，pH 7.2；

以上培养基均在115℃灭菌20min。

2、菌种活化：挑取石油烃降解菌接种至菌种保藏培养基平板，划线分离纯化，于30℃培养至有明显的单菌落生长，挑取单菌落接种于菌种活化培养基中，于30℃，150-200r/min摇床振荡培养24h；

3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照10％的接种量接种石油烃降解菌，于30℃，通空气培养24h，得到液体种子。

4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照10％的接种量接种石油烃降解菌液体种子，于30℃，通空气培养24h，得到活菌体培养物。

5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，按照重量比为1∶1与粉碎的玉米秸秆混合均匀，静态通风至含水量30％，包装，保存于干燥阴凉处。

实施例2：石油烃降解菌剂对石油污染土壤的修复效果

按重量比为3％的施加量将制备得到的石油烃降解菌剂加入石油污染土壤中，混合均匀。每隔7天，翻1次，1个月后，测定土壤中污染物的含量。烷烃含量由3950mg/kg降至1270mg/kg，下降了68％；芳香烃含量由786mg/g降至391mg/kg，下降了50％。

Claims (1)

1.一种利用甘薯淀粉废水生产巨大芽孢杆菌石油烃降解菌剂的方法，其特征在于：发酵培养基以甘薯淀粉废水为主要原料，生产步骤包括：

(1)培养基配制：

1)菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨2g，酵母膏1g，氯化钠5g，琼脂20g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；

2)菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨2g，酵母膏2g，氯化钠5g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；

3)种子培养基(液体，10L)：石油污染的土壤(即油泥，石油烃含量2％以上)1kg，加甘薯淀粉废水至l0L，pH 7.0-7.5；

4)发酵培养基(液体，200L)：石油污染的土壤(即油泥，石油烃含量2％以上)10kg，加甘薯淀粉废水至200L，pH 7.0-7.5；

以上培养基均在115℃-121℃灭菌15-30min。

(2)菌种活化：挑取石油烃降解菌接种至菌种保藏培养基平板，划线分离纯化，于30℃培养至有明显的单菌落生长，挑取单菌落接种于菌种活化培养基中，于30℃，150-200r/min摇床振荡培养12-36h；

(3)液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种石油烃降解菌，于30℃，通空气培养12-36h，得到液体种子。

(4)液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种石油烃降解菌液体种子，于30℃，通空气培养18-60h，得到活菌体培养物。

(5)菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，按照重量比为1∶1与粉碎的玉米秸秆混合均匀，静态通风至含水量30％，包装，保存于干燥阴凉处。