CN103898000A - 一种石油降解菌剂的液态发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种石油降解菌剂的液态发酵方法；将琼氏不动杆菌接种在种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；将液体种子接入发酵培养基中，通气量为1:1，搅拌转速为100rpm，接种量为10％，罐压0.01-0.02MPa；发酵罐培养4小时起，每2小时进行取样，对样品进行染色，使用生物显微镜的油镜进行观察，同时使用细菌计数器对菌体密度进行检测；发酵8-14小时后可得到菌体密度大于1*109cfu的石油降解活菌制剂；本方法通过油脂类碳源和快速碳源相结合来提高菌体得率和提高菌株降油特性，相对于固体发酵来讲，发酵周期缩短了约60—84小时。
Description
技术领域
本发明涉及一种石油降解活菌制剂的液态发酵方法。
背景技术
发酵是微生物在一定培养环境中生长并形成代谢产物的过程。19世纪已经出现生产酵母菌体的工业发酵过程，并采用了通气和补料的技术；20世纪70年代出现了微生物单细胞蛋白的生产。含油污泥生物降解需要大量的微生物菌剂，目前国内对石油降解菌剂的研究在只开展了实验室小规模培养，没有工业化产品。
目前微生物活菌制剂类产品主要有固态发酵和液态发酵两种方式。固态发酵是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式，固态基质中气、液、固三相并存，即多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质同。固态发酵相对于液态发酵有以下缺点：限于耐低水活性的微生物，选择少；发酵速率慢，周期长；天然原料成分复杂，有时变化，影响产量质量；工艺参数难检测和控制；产品少，操作消耗劳力多，强度大。含油污泥生物降解需要大量的微生物菌剂，目前国内对石油降解菌剂的研究在多为实验室小规模培养，其中山东科学院通过固态发酵方法对石油降解菌剂进行了研制，经过3天的培养，活菌量可达到3.6×1010cfu。本发明专利通过液态培养技术对石油降解菌的生产进行研究，确定了石油降解菌高密度液态深层发酵生产工艺技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种石油降解菌剂的液态发酵方法，通过对发酵培养基和发酵条件的探索优化提高发酵液中菌体密度，同时使菌体具有较高的降解活性。以获得高密度高活性的石油降解菌剂，用于石油污染物的降解。
本发明所述的石油降解菌剂的液体发酵生产方法，其特征：包括下述步骤：
（1）将琼氏不动杆菌接种在种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；一级种子为固态斜面培养，培养条件为30°C，培养24小时；二级种子为液态摇床培养，培养条件为30°C，转速160rpm,培养10-12小时；种子罐培养条件为搅拌转速80rpm，通气量1:1，罐压0.01-0.02MPa，菌体密度达到1*107cfu后接入发酵罐；种子培养基水溶液组成为wt%：牛肉膏0.3，蛋白胨1，氯化钠0.5，pH为7，121℃灭菌20min；
（2）将液体种子接入发酵培养基中，通气量为1:1，搅拌转速为100rpm，接种量为10％，罐压0.01-0.02MPa；发酵培养基水溶液组成为wt％：葡萄糖0.3；豆油0.1；玉米浆2.5；牛肉膏0.35；磷酸二氢钾0.3；硫酸镁0.06；氯化钙0.003，pH7,121℃灭菌30min；
（3）发酵罐培养4小时起，每2小时进行取样，对样品进行染色，使用生物显微镜的油镜进行观察，同时使用细菌计数器对菌体密度进行检测；
（4）发酵8-14小时后可得到菌体密度大于1*109cfu的石油降解活菌制剂。
按照本发明进行生产，在500L发酵罐内培养10小时后检测菌体密度为8.9*1010cfu,相对于固体发酵来讲，发酵周期缩短了约60—84小时。
具体实施方式
（1）无菌条件下取一环琼氏不动杆菌接种在试管斜面培养基中。培养基组成每升为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15g，酸碱度7,121℃，灭菌20分钟。培养条件为：30℃，24小时。作为一级种子。
（2）无菌条件下取两环一级种子接入装有100毫升培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶培养基组成每升为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，酸碱度7,121℃，灭菌20分钟。培养条件为30℃，转速160rpm,培养9小时。作为二级种子。
（3）按10％的接种量将摇瓶种子接入50升发酵罐中。在50升发酵罐中加入32升培养基并接入二级种子液3.2升。培养基组成每升为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，酸碱度7,121℃，灭菌30分钟。培养条件为搅拌转速80rpm，通气量1:1，罐压0.01-0.02MPa，温度30℃，培养8小时后，经细菌计数器检测菌体密度为2.4*107cfu，培养结束。
（4）在500升发酵罐内加入320升培养基，养基组成每升为：葡萄糖3g；豆油1g；玉米浆25g；牛肉膏3.5g；磷酸二氢钾3g；硫酸镁0.6g；氯化钙0.03g，pH7,121℃灭菌30min。将培养好的种子罐发酵液接入到500升发酵罐中。培养条件为通气量为1:1，搅拌转速为100rpm，温度30℃，罐压0.01-0.02MPa。
（5）500升发酵罐接种后4小时起，每隔两小时进行染色镜检及细菌计数。培养10小时后检测菌体密度为8.9*109cfu，得到可用于含油污泥治理的工业化石油降解活菌制剂。
Claims (1)
1.一种石油降解菌剂的液体发酵生产方法，其特征：包括下述步骤：
（1）将琼氏不动杆菌接种在种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；一级种子为固态斜面培养，培养条件为30°C，培养24小时；二级种子为液态摇床培养，培养条件为30°C，转速160rpm，培养10-12小时；种子罐培养条件为搅拌转速80rpm，通气量1:1，罐压0.01-0.02MPa，菌体密度达到1*107cfu后接入发酵罐；种子培养基水溶液组成为wt%：牛肉膏0.3，蛋白胨1，氯化钠0.5，pH为7，121℃灭菌20min；
（2）将液体种子接入发酵培养基中，通气量为1:1，搅拌转速为100rpm，接种量为10％，罐压0.01-0.02MPa；发酵培养基水溶液组成为wt％：葡萄糖0.3；豆油0.1；玉米浆2.5；牛肉膏0.35；磷酸二氢钾0.3；硫酸镁0.06；氯化钙0.003，pH7,121℃灭菌30min；
（3）发酵罐培养4小时起，每2小时进行取样，对样品进行染色，使用生物显微镜的油镜进行观察，同时使用细菌计数器对菌体密度进行检测；
（4）发酵8-14小时后可得到菌体密度大于1*109cfu的石油降解活菌制剂。
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