CN114231439A - 一种用于高盐水体中油类降解的微生物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境保护和处理技术领域，公开了一种用于高盐水体中油类降解的微生物制剂。该微生物制剂包括：Zobellella denitrificans Zobellella 56‑2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M 20211006；Halomonas mongliensis 56‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M 20211234；Brevibacillus brevis。该微生物制剂中菌种具有良好盐浓度耐受性和油类降解性能，将其投入至受到油类污染的高盐水体中，能够对油类污染物实现高效降解。
Description
技术领域
本发明属于环境保护和处理技术领域，尤其涉及一种用于高盐水体中油类降解的微生物制剂。
背景技术
对于受到油类污染的水体而言，利用微生物的代谢活动催化降解油类污染物的生物降解方式是一种可靠且效果良好的环境污染治理方式，与常规的物理、化学方法相比具有的极大优势。生物降解方法对人和环境造成的影响最小，能够使污染物最终完全分解为二氧化碳和水，不存在二次污染问题，且修复过程彻底，费用低。目前，微生物法治理水体污染所具有的潜在优势得到了广泛认可，应用前景广阔。
对于目前含油水体的生物降解方法而言，基本上是采用以细菌为主要组成的微生物制剂对石油烃底物的协同代谢、共代谢作用完成对石油烃的生物降解。2001年MaruyamaAkihiko等人公开了采用Alcanivorax属和Bacillus属的菌株制备成混合生物制剂降解海洋或相关环境中的重油污染物的方法。细菌是原核生物，其在对有机污染物质的生物降解过程中主要所利用的是单/双加氧酶胞内氧化系统及一系列脱氢酶系，反应需在细菌与石油烃接触后发生，细菌对底物的利用受到石油烃生物可利用度低的限制。另外，石油烃与单/双加氧酶系统最适宜的底物范围是C4-C20的直链烷烃，因此细菌对碳数更高、结构更为复杂的石油烃类的降解较为困难。尤其在高盐浓度的环境下，普通细菌处于高渗状态，生长受到限制，降解效率更低。
因此，本发明希望提出一种在高盐浓度的水体环境下，也能实现对油类污染物高效降解和处理的微生物制剂，以满足类似于石油泄漏所造成的海洋污染、石化、医药、农药、废水再生浓水等重点行业高盐有机废水的治理需求。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于高盐水体中油类降解的微生物制剂，该微生物制剂中菌种具有良好盐浓度耐受性和油类降解性能，将其投入至受到油类污染的高盐水体中，能够对油类污染物实现高效降解。
本发明提供了一种微生物制剂，包括：
Zobellella denitrificans Zobellella 56-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20211006；
Halomonas mongliensis 56-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M 20211234；
Brevibacillus brevis。
上述微生物中，除Brevibacillus brevis为可从常规商业途径购买得到的菌株外，Zobellella denitrificans 56-2和Halomonas mongliensis 56-1均为自行从高浓度盐胁迫和石油烃环境下培养和筛选得到的菌株。经原油降解速率的试验表明，以上三种菌种是起主要降解作用的微生物组分，因而将此三种菌种复合制得微生物制剂，用于高盐水体中的油类降解。
优选的，所述微生物制剂还包括Zooglea cani。
更优选的，所述Zooglea cani为Zooglea cani Caeni x1-9，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20211007。上述Zooglea cani Caeni x1-9也为从高浓度盐胁迫和石油烃环境下培养和筛选得到的菌株，虽然该菌株对于油类并不起主要降解作用，而是可产生菌胶团，从而帮助将水体中大分子有机物及其他微生物附着在一起，提高生物转化效率，并具有保护功能菌群不被原生动物吞噬等功能。
优选的，所述微生物制剂中Zooglea cani Caeni x1-9、Brevibacillus brevis、Zobellella denitrificans Zobellella 56-2和Halomonas mongliensis 56-1的配比为(1.5-2)：(1.8-2.2)：(1.8-2.2)：(0.4-0.6)。
更优选的，所述微生物制剂中Zooglea cani Caeni x1-9、Brevibacillusbrevis、Zobellella denitrificans Zobellella 56-2和Halomonas mongliensis 56-1的配比为(1.5-2)：2：2：0.5。
进一步优选的，所述微生物制剂中Zooglea cani Caeni x1-9、Brevibacillusbrevis、Zobellella denitrificans Zobellella 56-2和Halomonas mongliensis 56-1的配比为2：2：2：0.5。
本发明还提供了上述微生物制剂在水体油类降解中的应用。
优选的，所述水体为高盐水体。
更优选的，所述高盐水体的含盐量为2-20％。
优选的，所述油类包括烷烃、烯烃、环烷烃、芳香烃、炔烃、动植物油脂中的至少一种。
本发明还提供了一种水体油类降解方法，包括将含油类的水体与上述微生物制剂混合的步骤。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
与目前使用的生物降解制剂相比，本发明所述微生物制剂可显著提高在高盐浓度下含油水体的生物降解的效力，能够更好满足石油(主要成分为烷烃、环烷烃、芳香烃)泄漏所造成的海洋污染的治理需求。
附图说明
图1为通过高通量数据分析所得出的富集菌种；
图2为石油含量-吸光度值标准曲线。
保藏信息：
Zooglea cani Caeni x1-9，属于动胶菌属，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCC NO：M20211007，保藏时间为2021年8月10日。
Zobellella denitrificans Zobellella 56-2，属于脱氮卓贝尔氏菌属，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCC NO：M 20211006，保藏时间为2021年8月10日。
Halomonas mongliensis 56-1，属于嗜盐菌属，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCC NO：M20211234，保藏时间为2021年9月29日。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1：菌种筛选
1.配置筛选用培养基，其组成为：Na2HPO4·2H2O 3.5g；KH2PO4 1.0g；(NH4)2SO40.5g；MgCl2·6H2O 0.1g；钙盐0.05g；加水至1L，调pH＝7.0±0.2。将配置后的筛选用培养基采用121℃高温高压灭菌20分钟。在超净工作台上往筛选用培养基中加入100mL石油原液，200mL活性污泥，于28℃，180rpm培养7-30天，筛选得到能降解大分子有机碳中不同基团的降解菌。
2.配置营养培养基，其组成为：胰蛋白胨0.5g；酵母提取物0.5g；酶水解酪蛋白0.5g；葡萄糖0.5g；丙酮酸钠0.3g；KH2PO4 0.3g；MgSO4·7H2O 0.02g；加蒸馏水至1L。将配置后的营养培养基采用121℃高温高压灭菌20分钟，将上述所筛选出的降解菌用该营养培养基进行培养，培养3-7天。按3％浓度在该营养培养基中添加NaCl，通过高浓度盐胁迫培养60天，富集能在高盐浓度中可降解含油污水的菌群。
3.通过高通量数据分析，提示富集到如图1所示的菌种。以石油烃和NaCl作为两个可变因子影响了反应器中微生物群落的变化，由图1可以发现，耐盐远洋杆菌Pelagibacterium、海杆菌Marinobacter、耐盐卓贝尔氏菌Zobellella、太平洋硫膨大杆菌Thioclava、嗜盐菌Halomonas、斯塔普氏菌Stappia在高盐条件的胁迫下被选择出来，同时我们也通过分菌的方法分离到这些可在高盐胁迫下可以高效地降解石油烃的功能菌株。其中Zobellella也可以在高盐条件下消耗污泥和废水来生产聚羟基丁酸酯(生物塑料)。
4.配制石油无机盐固体培养基，其组成为：Na2HPO4·2H2O 3.5g；KH2PO4 1.0g；(NH4)2SO40.5g；MgCl2·6H2O 0.1g；钙盐0.05g；琼脂15g；石油1g，加水至1L，调pH＝7.0±0.2。将配置后的石油无机盐固体培养基在121℃高温高压灭菌20分钟。待培养基冷却至70℃左右，在超净工作台15ml分装至无菌培养皿中，冷却后获得固体培养基。
将含有上述经富集后菌群的溶液进行梯度稀释后，注入在石油无机盐固体培养基上，用涂布棒涂布均匀，然后放入28℃的恒温培养箱中，进行培养2-3天后，观察石油降解菌的生长情况，用记号笔分别划出培养基上生长的不同形态的石油降解菌，并标注序号，挑取单克隆划线进一步分离培养。
5.将划好的平板放入恒温培养箱，于28℃培养2-3天，观察平板上石油降解菌的生长，并对生长好的石油降解菌进行染色镜检，记录其形态特征，用PCR扩增的方法获得16SrRNA并测序，通过GenBank对核酸序列进行BLAST比对确定种属，将纯化的石油降解菌在试管斜面培养基中进行斜面划线保藏，并送至中国典型培养物保藏中心进行保藏。
进行保藏的菌种有：Zooglea cani Caeni x1-9、Zobellella denitrificansZobellella 56-2和Halomonas mongliensis 56-1，上述三种菌株的16S rRNA序列依次为SEQ ID NO:1-3所示。
通过GenBank对核酸序列进行BLAST比对，Halomonas mongliensis 56-1与Halomonas mongoliensis strain Z-7009的16S rRNA序列同一性为96.75％；Zobellelladenitrificans Zobellella56-2与Zobellella denitrificans strain ZD1的16S rRNA序列同一性为96.77％；Zoogleal.cani Caeni x1-9与Zoogloea caeni strain EMB43的16SrRNA序列同一性为97.9％。
实施例2：各菌种的石油降解率。
菌种石油降解率的测试方法，包括以下步骤：
(1)将原油配制成70mg/L的石油醚溶液，以溶剂石油醚作为空白样进行光谱扫描，显示波长242nm处吸光值保持稳定，所以实验测定样品的最适测定波长选为242nm。
(2)绘制石油醚溶液标准曲线
油标准储备液：准确称取0.5g原油溶于石油醚中，在100mL容量瓶中定容后，充分混合均匀，此时原油浓度为5.0g/L。
油标准使用液：取油标准储备液5mL于50mL容量瓶中，加石油醚定容后充分混合均匀，此时原油浓度为0.5g/L。以石油醚为溶剂把油标准使用液配制成油浓度分别为10、20、30、40、50、60、70mg/L的油溶液。
以石油醚为空白对照、在波长为242nm处用1.00cm石英比色皿。测定各溶液的吸光度值，绘制石油标准曲线，结果如表1和图2所示，得出油含量-吸光度值曲线方程y＝0.0175x-0.0371；R2＝0.9962。
表1石油醛溶液标准系列吸光值
(3)各菌种降油率的测定
按1:1000的体积比将实施例1中富集得到的菌种分别至100mL含3％NaCl的R2A培养基中，培养至OD600≈0.6，添加1mL原油，在30℃、180±5r/min的条件下继续培养7天后，用10mL石油醚(沸程60-90℃)萃取摇瓶中残余石油并全部转入60mL分液漏斗中，充分震荡3分钟，待静置分层后，将下层液仍放回原摇瓶中，再加10mL石油醚继续萃取,如此共萃取3次，将3次余留的上层萃取液均放入50mL离心管中混匀备用。以石油醚为对照样，在最适测定波长242nm下，采用紫外分光光度法测定吸光度，根据对照标准曲线求出各菌的石油降解率，测试结果如表2所示。
表2各菌株高盐浓度下的降解效率
其中，菌种zoogleal.cani为Zoogleal.cani Caeni x1-9、Zobellella为Zobellella denitrificans Zobellella 56-2、Halomonas为Halomonas mongliensis 56-1。
通过表2的降解效率可知，Bacillus brevis、Halomonas mongliensis 56-1和Zobellella denitrificans Zobellella 56-2具备优良的油类降解性能。
实施例3
本实施例提供一种用于高盐水体中油类降解的微生物制剂，包括Bacillusbrevis、Halomonas mongliensis 56-1和Zobellella denitrificans Zobellella 56-2；考虑到自然条件下，活性污泥中需要动胶菌属为优势菌属，可帮助将污水中大分子有机物及其他微生物附着在一起，提高生物转化效率，并具有保护功能菌群不被原生动物吞噬等功能，因而在上述微生物制剂中还加入一定量的Zooglea cani Caeni x1-9。
上述微生物制剂所用到的菌种中，Bacillus brevis购买自宁波明舟生物科技有限公司，商品货号：BMZ133008；Zooglea cani Caeni x1-9、Zobellella denitrificansZobellella 56-2和Halomonas mongliensis 56-1均为自行从高浓度盐胁迫和石油烃环境下培养和筛选得到的菌株。
为了探究上述四种菌种在微生物制剂中的最佳添加配比，将上述四种菌活化培养后，以不同投加量加入到装有100mL MSM+3％NaCl培养基的锥形瓶中，初始含油(原油)量为5g/L，28℃，180rpm，恒温震荡培养7天，计算各实验组的降油率，确定混合菌群中四株菌的最适投加量。采用三水平四因素正交实验，对4株菌的混合接种量进行实验。正交因素的各因素、各水平如表3所示，正交试验结果表如表4所示。
表3正交因素的各因素、各水平
表4正交试验结果表
由表3-4可见，4株菌投加量的改变对混合菌群降油率的影响大小顺序为：Zoogleal.cani Caeni x1-9＞Bacillus brevis＞Zobellella denitrificansZobellella 56-2＞Halomonas mongliensis56-1；根据正交数据，7号接种比例：Bacillusbrevis、Zobellella denitrificans Zobellella 56-2接种量2％，Zooglea cani Caenix1-9接种量1.5％，Halomonas mongliensis 56-1接种量0.5％时降解效率最高，培养7天降解效率可达到64.88％。
结合单菌的三水平数据综合考虑，Zooglea cani Caeni x1-9浓度越高，菌群的降解效率更好，综合考虑获得最佳配比方案：Zooglea cani Caeni x1-9：Bacillus brevis：Zobellella denitrificans Zobellella 56-2：Halomonas mongliensis 56-1＝2:2:2:0.5，并按此比例以同样培养条件和检测条件进行验证试验，结果如表5所示。
表5最佳投加量组合验证结果
表5的结果表明，经重新配比后的微生物制剂对于高盐环境下水体的石油降解效率得到进一步的提升。
实施例4:实验室降解试验
两个4L容量的降解反应器，向A反应器(试验组)中添加原油0.5g/L，NaCl 3g/L，微生物制剂(Zoogleal.cani Caeni x1-9：Bacillus brevis：Zobellella denitrificansZobellella 56-2：Halomonas mongliensis 56-1＝2:2:2:0.5)2g/L，培养基4L；向反应器B(对照组)中添加原油0.5g/L，NaCl 3g/L，普通市政活性污泥2g/L，培养基4L。同时进行培养，温度在20-25℃之间，pH维持在7.5左右。经过60个昼夜的降解，发现试验组中原油的含量降低了89.3％(质量百分比)，而对照组中原油的含量仅降低31.3％(质量百分比)。
上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 中化珠海石化储运有限公司
<120> 一种用于高盐水体中油类降解的微生物制剂
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 908
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggctggggc ggatgcttta ccatgcagtc gaacggtaac agggagcttg ctccgctgac 60
gagtggcgaa cgggtgagta atgcatcgga acgtacccag tcgtggggga taacgtagcg 120
aaagttacgc taataccgca tacgtcctga gggagaaagc gggggaccgt aaggcctcgc 180
gcgattggag cggccgatgt cggattagct agttggtagg gtaaaggcct accaaggcga 240
cgatccgtag cgggtctgag aggatgatcc gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300
tcctacggga ggcagcagtg gggaattttg gacaatgggc gaaagcctga tccagccatg 360
ccgcgtgagt gaagaaggcc ttcgggttgt aaagctcttt cagacggaaa gaaatcgcat 420
cttctaatac agggtgtgga tgacggtacc gtaagaagaa gcaccggcta actacgtgcc 480
agcagccgcg gtaatacgta gggtgcgagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgtg 540
cgcaggcggt gatgtaagac agatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcgtttg 600
tgactgcatc actcgagtac ggcagaggga ggtggaattc cgcgtgtagc agtgaaatgc 660
gtagatatgc ggaggaacac cgatggcgaa ggcagcctcc tgggccagta ctgacgctca 720
tgcacgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccctaaacga 780
tgtcaactag ttgttcggtg aggagactca ttgagtaacg cagctaacgc gtgaagttga 840
ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa 900
gcggtgga 908
<210> 2
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtccgtggcg ggcggctaca catgcaagtc gagcggtaac agggggtagc ttgctactct 60
gctgacgagc ggcggacggg tgagtaaggc ttgggtatct gcccagtcga gggggataac 120
cgttggaaac gacggctaat accgcatacg ccctacgggg gaaagcaggg gaccttcggg 180
ccttgcgcga ttggatgagc ccaagtgaga ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca 240
aggcgacgat ctctagctgg tctgagagga tgaccagcca cactgggact gagacacggc 300
ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggggcaa ccctgatgca 360
gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttcg ggttgtaaag cactttcagt ggggaggaaa 420
ggtgagtggc gaatacccgc ttactgtgac gttacccaca gaagaagcac cggctaactc 480
cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta atcggaatga ctgggcgtaa 540
agcgcacgca ggcggtctgc taagccagat gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaactg 600
catttggaac tggcaggcta gagtcttgga gaggggggta gaatttccgg tgtagcggtg 660
aaatgcgtag agatcggaag gaataccagt ggcgaaggcg gccccctggc caaagactga 720
cgctcaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgctgt 780
aaacgatgtc aacttggagt ctgtgcctat tgagcgcggg ttccggagct aacgcgttaa 840
gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaactcaa atgaattgac gggggccgca 900
caagcggtgg agcatgtggt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct acccttgact 960
agtagaactt ggcagaatgc cttggtgctt cggaacttac tacagggctg atggctgcgt 1020
cactcgggct gaaatgtggg taatccccaa caagccaacc ttgcctttgt gcacgattcg 1080
gcggaatcaa ggaatgccgg gaaaaccggg gaaggggggc actcaactct tggc 1134
<210> 3
<211> 1027
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggtgcggag ctaccatgca agtcgagcgg aaacgatgga agcttgcttc caggcgtcga 60
gcggcggacg ggtgagtaat gcataggaat ctgcccgata gtgggggata acctggggaa 120
acccaggcta ataccgcata cgtcctacgg gagaaagcag gggatcttcg gaccttgcgc 180
tatcggatga gcctatgtcg gattagctag ttggtggggt aatggcccac caaggcgacg 240
atccgtagct ggtctgagag gatgatcagc cacatcggga ctgagacacg gcccgaactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcga aagcctgatc cagccatgcc 360
gcgtgtgtga agaaggccct cgggttgtaa agcactttca gtgaggaaga aggccttcgg 420
gttaataccc tggaggaagg acatcactca cagaagaagc accggctaac tccgtgccag 480
cagccgcggt aatacggagg gtgcgagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcgcg 540
taggcggttt gataagccgg ttgtgaaagc cccgggctca acctgggaac ggcatccgga 600
actgtcaggc tagagtgcag gagaggaagg tagaattccc ggtgtagcgg tgaaatgcgt 660
agagatcggg aggaatacca gtggcgaagg cggccttctg gactgacact gacgctgagg 720
tgcgaaagcg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780
tcgactagcc gttgggctcc ttgagagctt tgtggcgcag ttaacgcgat aagtcgaccg 840
cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg 900
gtggagcatg tggttaattc gatgcacgcg aagaccttac tacccttgac tcgaaagact 960
tggcaaaatg ctttggtgct tcgggactct caaaagggct gctggtggcc ccactcgggt 1020
gggaaag 1027
Claims (9)
1.一种微生物制剂，其特征在于，包括：
Zobellella denitrificans Zobellella 56-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20211006；
Halomonas mongliensis 56-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M20211234；
Brevibacillus brevis。
2.根据权利要求1所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂还包括Zoogleacani Caenix1-9，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20211007。
3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中Zooglea caniCaeni x1-9、Brevibacillus brevis、Zobellella denitrificans Zobellella 56-2和Halomonas mongliensis 56-1的配比为(1.5-2)：(1.8-2.2)：(1.8-2.2)：(0.4-0.6)。
4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中Zooglea caniCaeni x1-9、Brevibacillus brevis、Zobellella denitrificans Zobellella 56-2和Halomonas mongliensis 56-1的配比为(1.5-2)：2：2：0.5。
5.权利要求1-4中任一项所述的微生物制剂在水体油类降解中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水体为高盐水体。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述高盐水体的含盐量为2-20％。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述油类包括烷烃、烯烃、环烷烃、芳香烃、炔烃、动植物油脂中的至少一种。
9.一种水体油类降解方法，其特征在于，包括将含油类的水体与权利要求1-4中任一项所述的微生物制剂混合的步骤。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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