CN109868243B

CN109868243B - 加快土壤有机物污染修复的微生物菌剂，其制备方法及应用

Info

Publication number: CN109868243B
Application number: CN201910212082.9A
Authority: CN
Inventors: 黄彩红; 李英军; 杨天学; 何连生; 夏湘勤; 袁文超; 唐朱睿
Original assignee: Chinese Research Academy of Environmental Sciences
Current assignee: Chinese Research Academy of Environmental Sciences
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2039-03-20
Also published as: CN109868243A

Abstract

本发明涉及微生物菌剂，其特征在于包含复合菌剂I，所述复合菌剂I由功能菌和保护菌组成，其中所述功能菌由腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens)，金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens)，绿色木霉(Trichoderma viride)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)组成，所述保护菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选地，腐败假单胞菌，金属还原地杆菌，绿色木霉，哈茨木霉和枯草芽孢杆菌的质量比为A∶B∶C∶D∶E，其中A选自2～4的数字，B选自3～5的数字，C选自1～3的数字，D选自2～4的数字，E选自4～6的数字；其制备方法和用途。本发明制得的微生物菌剂在修复有机物污染方面具有非常优异的效果，且制备方法简单、成本低、无二次污染，具有广阔的市场价值。

Description

加快土壤有机物污染修复的微生物菌剂，其制备方法及应用

技术领域

本发明属于环境工程领域，具体地涉及一种加快土壤有机物污染修复的微生物菌剂及其制备方法。

背景技术

目前，我国有机物污染的程度和面积均呈现增加态势，特别是设施农业的高施肥量和连作种植方式，导致酞酸酯、多环芳烃等有机污染物含量逐年累积，成为影响土壤质量和农产品品质的重要因素。微生物修复技术可利用微生物自身的生命活动，调节或控制生境内的生化反应，进而实现有机污染物的降解和去除，成本低、见效快、无二次污染，具有较大的应用潜力。

生物炭是生物有机材料(生物质)在缺氧或绝氧环境中，经高温热裂解后生成的固态产物，其既可作为高品质能源、土壤改良剂，也可作为还原剂、肥料缓释载体及二氧化碳封存剂等，已广泛应用于固碳减排、水源净化、重金属吸附和土壤改良等，可在一定程度上为气候变化、环境污染和土壤功能退化等全球关切的热点问题提供解决方案。

发明内容

本发明涉及以下几个方面：

1.微生物菌剂，其特征在于包含复合菌剂I，所述复合菌剂I由功能菌和保护菌组成，其中所述功能菌由腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens)，金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens)，绿色木霉(Trichoderma viride)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)组成，所述保护菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选地，腐败假单胞菌，金属还原地杆菌，绿色木霉，哈茨木霉和枯草芽孢杆菌的质量比为A∶B∶C∶D∶E，其中A选自2～4的数字，B选自3～5的数字，C选自1～3的数字，D选自2～4的数字，E选自4～6的数字。

2.上述1的微生物菌剂，其特征在于还包含生物活性物质，所述生物活性物质由糖(例如葡萄糖，果糖，乳糖，麦芽糖，优选葡萄糖)和氨基酸组成，所述复合菌剂I，糖和氨基酸组成复合菌剂II，优选所述复合菌剂I，糖和氨基酸的质量比为a∶b∶c，其中a选自70～80的数字，b选自10～25的数字，c选自10～20的数字。

3.上述1的微生物菌剂，其特征在于还包含生物炭，优选所述生物炭来自植物，更优选来自小麦秸秆，更优选地，其是通过350～450℃热解小麦秸秆5～7小时，过120～150目筛而制得，进一步优选地，复合菌II占生物炭的质量百分比为6～12％。

4.制备上述3所述微生物菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将功能菌与保护菌分别培养至对数生长期，后冻干混合，得到复合菌剂I；

(2)将步骤(1)所得复合菌剂I与生物活性物质混合，得到复合菌剂II；

(3)将步骤(2)所得复合菌剂II，与生物炭混合固定。

5.上述4的制备方法，其特征在于腐败假单胞菌和金属还原地杆菌的培养条件为LB培养基，35～38℃，160～180r.min^-1，厌氧条件；绿色木霉和哈茨木霉的培养条件为PDA培养基，28～30℃，180～200r.min^-1，好氧条件；枯草芽孢杆菌的培养条件为LB培养基，35～38℃，150～170r.min^-1，好氧条件。

6.上述4-5任一项所述的制备方法，其特征在于所述对数生长期是将腐败假单胞菌，金属还原地杆菌，枯草芽孢杆菌培养11～13小时，绿色木霉和哈茨木霉培养96～120小时。

7.上述4-5任一项所述的制备方法，所述生物炭的制备方法为：350～450℃热解小麦秸秆5～7小时，过120～150目筛。

8.上述4-5任一项所述的制备方法，所述固定方法为：

将生物炭(优选1～1.2g)加入100mL固定化培养基，灭菌后，加入质量比为6～12％的复合菌剂II，温度为28～32℃，固定时间为18～20h。

9.上述1-3任一项所述的微生物菌剂在促进土壤有机物污染修复中的应用。

10.上述9所述的应用，其中所述有机物选自多环芳烃，多氯联苯，酞酸酯、有机氯农药、石油烃或其组合，优选地，所述多氯联苯选自PCB28(2，4，4’-三氯联苯)、PCB52(2，2’，5，5’-四氯联苯)、PCB101(2，2’，4，5，5’-五氯联苯)、PCB118(2，3’，4，4’，5-五氯联苯)、PCB138(2，2’，3，4，4’，5’-六氯联苯)、PCB153(2，2’，4，4’，5，5’-六氯联苯)和/或PCB180(2，2’，3，4，4’，5，5’-七氯联苯)，所述酞酸酯选自邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基苄基酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和/或邻苯二甲酸正辛酯。

在具体实施方案中，固定化培养基的组成为蔗糖10g、牛肉膏6g、酵母浸膏1.5g、蒸馏水1000mL，调节pH 7.0～7.5。

在本发明中，生物活性物质用来为微生物提供营养，其中所用的糖是本领域常规用于微生物培养的糖，包括，但不限于葡萄糖，果糖，乳糖，麦芽糖。所使用的氨基酸也是本领域常规用于微生物培养的氨基酸。

在优选的实施方案中，本发明针对作物秸秆产量大、处理处置效率低及资源化利用程度低等问题，将秸秆高温炭化制备生物质材料，既避免了秸秆资源的浪费，又提供了新型高效生物质环境材料，在本发明的研发过程中，本发明的发明人发现利用微生物修复土壤有机污染技术存在普适性差的问题，将微生物固定在生物炭上，可大大提高微生物的菌剂的作用面积，提高对污染物的降解效率，此外，生物炭可作为土壤腐殖质中高度芳香化结构组分的来源，腐殖质的存在会强化微生物菌剂的作用，同时增加土壤中的有机质含量。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

本发明的优点在于例如，本发明制得的微生物菌剂在降解污染物、提升土壤有机质含量、改善土壤营养结构等方面都具有非常优异的效果。此外，可经济高效地实现秸秆处理处置，避免二次污染。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清晰，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。本领域的普通技术人员可以理解，以下实施例仅仅是举例说明的目的，本发明的保护以后附的权利要求书所记载的为准。

下面列举一些具体实施例，以对本发明的实施和技术效果做更进一步的说明。

以下实施例中所用的菌株均均是公众可以获得，例如购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，中国微生物菌种查询网，北纳生物，中国农业微生物菌种保藏管理中心，或发表于科技期刊，氨基酸购自一般试剂公司。

实施例1

(1)微生物菌剂的制备方法：

将腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens，例如中国微生物菌种查询网，编号bio-097659)和金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens，例如中国微生物菌种查询网，编号bio-091064)活化，于LB液体培养基中37℃、170r.min^-1，厌氧条件培养11h，绿色木霉(Trichoderma viride，例如中国微生物菌种查询网，编号：bio-098339)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum，例如中国微生物菌种查询网，编号：bio-102235)于液体PDA培养基中28℃、200r.min^-1，好氧条件培养96h，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，例如中国微生物菌种查询网，编号：bio-103318)于LB液体培养基中37℃、160r.min^-1，好氧条件培养12h。将上述菌体收集后冻干，将腐败假单胞菌(S.putrefaciens)：金属还原地杆菌(G.metallireducens)：绿色木霉(T.viride)：哈茨木霉(T.harzianum)：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)按2∶3∶1∶2∶4质量比混合，得到复合菌剂I，将复合菌剂I∶葡萄糖∶氨基酸以80∶10∶10质量比混合，得到复合菌剂II。

(2)生物炭的制备方法：

将小麦秸秆于450℃马弗炉内热解5h，过120目筛。

(3)微生物菌剂的固定方法：

将1.2g生物炭加入100mL固定化培养基(蔗糖10g、牛肉膏6g、酵母浸膏1.5g、蒸馏水1000mL，调节pH 7.0～7.5)，121℃灭菌20min后冷却，加入质量比为12％的复合菌剂II，调节转速至160r.min^-1，温度至30℃，固定时间为20h，离心后的沉淀，采用无菌生理盐水清洗3次，即获得本发明所述微生物菌剂。

该待修复土壤中的有机物主要包括多环芳烃。

将制得的微生物菌剂应用于北京某化工厂附近多环芳烃污染土壤(PAHs总量为352μg·kg^-1(218～536μg·kg^-1))修复试验，以检测该菌剂对有机污染物降解的促进能力，结果显示，按质量百分比添加20％所述菌剂、修复15天的土壤中，多环芳烃含量较未添加菌剂的对照降低了26％，具有明显的促进作用，加快了多环芳烃的降解。此外，处理组土壤有机质含量较对照组增加了4.5％。

实施例2

(1)微生物菌剂的制备方法：

将腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens)和金属还原地杆菌(Geobactermetallireducens)活化，于LB液体培养基中37℃、160r.min^-1，厌氧条件培养12h，绿色木霉(Trichoderma viride)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)于液体PDA培养基中30℃、180r.min^-1，好氧条件培养108h，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)于LB液体培养基中37℃、170r.min^-1，好氧条件培养12h。将上述菌体收集后冻干，将腐败假单胞菌(S.putrefaciens)：金属还原地杆菌(G.metallireducens)：绿色木霉(T.viride)：哈茨木霉(T.harzianum)：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)按4∶5∶3∶4∶6质量比混合，得到复合菌剂I，将复合菌剂I∶葡萄糖∶氨基酸为70∶15∶15质量比混合，得到复合菌剂II。

(2)生物炭的制备方法：

将小麦秸秆于400℃马弗炉内热解7h，过150目筛。

(3)微生物菌剂的固定方法：

将1g生物炭加入100mL固定化培养基(蔗糖10g、牛肉膏6g、酵母浸膏1.5g、蒸馏水1000mL，调节pH 7.0～7.5)，121℃灭菌20min后冷却，加入质量比为10％的复合菌剂II，调节转速至170r.min^-1，温度至32℃，固定时间为18h，离心后的沉淀，采用无菌生理盐水清洗3次，即获得本发明所述微生物菌剂。

该待修复土壤中的有机物主要包括多氯联苯。

将制得的微生物菌剂应用于河北某造纸厂附近多氯联苯(PCBs)污染农田土壤(PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153、PCB180等7种指示性PCBs平均值为95.82μg/kg)修复试验，以检测该菌剂对有机污染物降解的促进能力。结果显示，按质量百分比添加30％所述菌剂、修复15天的土壤中，上述多氯联苯含量平均值较未添加菌剂的对照(95.82％μg/kg)降低了37％，具有明显的促进作用，加快了多氯联苯的降解。此外，处理组土壤有机质含量较对照组增加了6.5％。

实施例3

(1)微生物菌剂的制备方法：

将腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens)和金属还原地杆菌(Geobactermetallireducens)活化，于LB液体培养基中38℃、160r.min^-1，厌氧条件培养12h，绿色木霉(Trichoderma viride)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)于液体PDA培养基中28℃、200r.min^-1，好氧条件培养120h，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)于LB液体培养基中37℃、150r.min^-1，好氧条件培养12h。将上述菌体收集后冻干，将腐败假单胞菌(S.putrefaciens)：金属还原地杆菌(G.metallireducens)：绿色木霉(T.viride)：哈茨木霉(T.harzianum)：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)按3∶4∶2∶3∶5质量比混合，得到复合菌剂I，将复合菌剂I∶葡萄糖∶氨基酸为70∶20∶10质量比混合，得到复合菌剂II。

(2)生物炭的制备方法：

将小麦秸秆于350℃马弗炉内热解7h，过200目筛。

(3)微生物菌剂的固定方法：

将1g生物炭加入100mL固定化培养基(蔗糖10g、牛肉膏6g、酵母浸膏1.5g、蒸馏水1000mL，调节pH 7.0～7.5)，121℃灭菌20min后冷却，加入质量比为6％的复合菌剂II，调节转速至150r.min-1，温度至28℃，固定时间为18h，离心后的沉淀，采用无菌生理盐水清洗3次，即获得本发明所述微生物菌剂。

该待修复土壤中的有机物主要包括酞酸酯(PAE)。

将制得的微生物菌剂应用于北京怀柔区蔬菜大棚酞酸酯污染土壤(邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基苄基酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、邻苯二甲酸正辛酯等6种酞酸酯总浓度为0.58～3.26mg/kg)修复试验，以检测该菌剂对有机污染物降解的促进能力。结果显示，按质量百分比添加20％所述菌剂、修复20天的土壤中，6种酞酸酯总浓度较未添加菌剂的对照(0.58～3.26mg/kg)降低了42％，具有明显的促进作用，加快了酞酸酯的降解。此外，处理组土壤有机质含量较对照组增加了6.1％。

实施例4

重复实施例1的实验，仅是将土壤中的有机物替换为有机氯农药或石油烃等，以检测该菌剂对有机污染物降解的促进能力。结果显示，按质量百分比添加20％所述菌剂、修复20天的土壤中，该有机物含量较未添加菌剂的对照降低(其中含机氯农药土壤来自山东某农田，其原始含量为65.37μg/kg，添加菌剂后有机氯农药残留量降低了53％；含石油烃土壤来自黑龙江某采油厂，其原始总量平均值为60.37mg/kg，添加菌剂后石油烃含量降低了71％)，具有明显的促进作用，加快了有机物的降解。此外，处理组土壤有机质含量较对照组增加(其中含有机氯农药土壤有机质含量增加了5.8％％；含石油烃土壤有机质含量增加了6.5％)。

按照Environmental，Science&Techology，2017，51，3176-3186的方法，测量上述实施例1-4中有机质(腐殖质)的含量：

腐殖质是土壤有机质中最活跃的部分，腐殖质质量分数的多少，是土壤肥力高低的一项重要标志。因此，本专利中土壤有机质含量以腐殖质含量为代表，参照国际腐殖质协会提供的方法进行测定^[1]。具体地：

1、腐殖质的提取

称取土壤样品于离心管中，按1g∶10ml比例加入提取液(0.1M Na₄P₂O₇∶0.1M NaOH，1∶1)并充分混匀，用N₂持续吹30min。然后在60℃的恒温水浴中振荡15h，离心弃去下层沉淀物，所得滤液用6M的HCl溶液调pH至l～2，在60℃恒温条件下水浴1h，静置过夜，离心15min，下层沉淀为胡敏酸粗品，上层清液为富里酸溶液。

2、腐殖质的纯化

将胡敏酸粗品通过碱溶酸沉法进行反复沉淀，重复3次后，采用电渗析法除去其中的金属离子，60℃减压浓缩，真空干燥后得到纯的胡敏酸干样；富里酸溶液过大孔吸附树脂(XAD-8)与氢型阳离子交换树脂，然后进行冷冻干燥后得到纯的富里酸干样。将干样称重加和即得到腐殖质含量。

Claims

1.微生物菌剂，其特征在于包含复合菌剂I，所述复合菌剂I由功能菌和保护菌组成，其中所述功能菌由腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens)，金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens)，绿色木霉(Trichoderma viride)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)组成，所述保护菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，腐败假单胞菌，金属还原地杆菌，绿色木霉，哈茨木霉和枯草芽孢杆菌的质量比为A：B：C：D：E，其中A选自2～4的数字，B选自3～5的数字，C选自1～3的数字，D选自2～4的数字，E选自4～6的数字。

2.权利要求1的微生物菌剂，其特征在于所述腐败假单胞菌的编号为中国微生物菌种查询网bio-097659，所述金属还原地杆菌的编号为中国微生物菌种查询网bio-091064，所述绿色木霉的编号为中国微生物菌种查询网bio-098339，所述哈茨木霉的编号为中国微生物菌种查询网bio-102235，所述枯草芽孢杆菌的编号为中国微生物菌种查询网bio-103318。

3.权利要求1的微生物菌剂，其特征在于还包含生物活性物质，所述生物活性物质由糖和氨基酸组成，所述复合菌剂I、糖和氨基酸组成复合菌剂II。

4.权利要求3的微生物菌剂，其特征在于，所述糖为葡萄糖，果糖，乳糖或麦芽糖。

5.权利要求3的微生物菌剂，其特征在于，所述糖为葡萄糖。

6.权利要求3的微生物菌剂，其特征在于，所述复合菌剂I、糖和氨基酸的质量比为a：b：c，其中a选自70～80的数字，b选自10～25的数字，c选自10～20的数字。

7.权利要求1的微生物菌剂，其特征在于还包含生物炭。

8.权利要求7的微生物菌剂，其特征在于所述生物炭来自植物。

9.权利要求7的微生物菌剂，其特征在于所述生物炭来自小麦秸秆。

10.权利要求7的微生物菌剂，其特征在于所述生物炭是通过350～450℃热解小麦秸秆5～7小时，过120～150目筛而制得。

11.权利要求7的微生物菌剂，其特征在于复合菌II占生物炭的质量百分比为6～12％。

12.制备权利要求7所述微生物菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：

(3)将步骤(2)所得复合菌剂II，与生物炭混合固定。

13.权利要求12的制备方法，其特征在于腐败假单胞菌和金属还原地杆菌的培养条件为LB培养基，35～38℃，160～180r.min^-1，厌氧条件；绿色木霉和哈茨木霉的培养条件为PDA培养基，28～30℃，180～200r.min^-1，好氧条件；枯草芽孢杆菌的培养条件为LB培养基，35～38℃，150～170r.min^-1，好氧条件。

14.权利要求12-13任一项所述的制备方法，其特征在于所述对数生长期是将腐败假单胞菌，金属还原地杆菌，枯草芽孢杆菌培养11～13小时，绿色木霉和哈茨木霉培养96～120小时。

15.权利要求12-13任一项所述的制备方法，所述生物炭的制备方法为：350～450℃热解小麦秸秆5～7小时，过120～150目筛。

16.权利要求12-13任一项所述的制备方法，所述固定方法为：

将生物炭加入100mL固定化培养基，灭菌后，加入质量比为6～12％的复合菌剂II，温度为28～32℃，固定时间为18～20h。

17.根据权利要求16所述的制备方法，所述生物炭为1～1.2g。

18.权利要求1-11中任一项所述的微生物菌剂在促进土壤有机物污染修复中的应用。

19.权利要求18所述的应用，其中所述有机物选自多环芳烃、多氯联苯、酞酸酯、有机氯农药、石油烃或其组合。

20.权利要求19所述的应用，其中所述多氯联苯选自2,4,4’-三氯联苯、2,2’,5,5’-四氯联苯、2,2’,4,5,5’-五氯联苯、2,3’,4,4’,5-五氯联苯、2,2’,3,4,4’,5’-六氯联苯、2,2’,4,4’,5,5’-六氯联苯和/或2,2’,3,4,4’,5,5’-七氯联苯，所述酞酸酯选自邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基苄基酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和/或邻苯二甲酸正辛酯。