CN114107276A - 一种菌棒生物炭固定化菲降解菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物降解有机污染物技术领域，涉及一种菌棒生物炭固定化菲降解菌剂及其制备方法与应用，制备步骤包括菌悬液制备和包埋固定，将菲降解菌株固定化于菌棒生物炭载体中制得微生物固定化菌剂；生物炭发达的孔隙结构和较大的比表面积能够将污染物多环芳烃吸附于表面，提高菲降解菌的环境浓度，促进菌株对菲的降解；同时利用菌棒生物炭作为固定化微生物载体，既为菌株提供了丰富的营养物质和稳定的生长环境，又实现了废物的循环利用，对环境友好；所制备的菲降解菌剂，具有高效的菲降解效果，并且增强了菌株对重金属铜的耐受性，使得在铜离子胁迫下菌株Sphingobium abikonense对污染物菲依然有较高的降解效果。
Description
技术领域：
本发明属于微生物降解有机污染物技术领域，涉及一种菌棒生物炭固定化菲降解菌剂及其制备方法与应用，将菲降解菌株固定化于菌棒生物炭载体中制得微生物固定化菌剂，具有高效的菲降解效果。
背景技术：
随着工业上人类对石油、煤炭等产品的不断开发利用，环境污染问题越来越严重，尤其是复合污染问题日益加重。研究复合污染的土壤修复技术对解决土壤环境问题、降低土壤环境风险有重要意义和价值。固定化微生物技术一方面由于生物炭较大的比表面积和丰富的多孔结构可以吸附土壤中的重金属和多环芳烃，另一方面可以通过提高菌体密度以及增强菌体对毒害污染物的耐受性来显著提高对有机污染物的降解效率。中国专利CN201310523187.9公开了一种石油降解菌群的固定化方法，包括以下步骤：(1)石油降解菌群液体发酵；(2)石油降解菌群在硅藻土/活性炭复合载体上的固定化。本发明所提出的石油降解菌群固定化方法具有成本低，利于大规模应用和除油效率高的优点，固定化的降解菌群协同作用强、降解能力大，适用于各类含油固废物的生物降解。中国专利CN201410614051.3公开了一种生物炭固定化复合污染降解菌颗粒制备及用途、使用方法；所述制备方法包括：将风干、粉碎的农林废弃物及动物粪便热裂解，研磨过筛，得生物炭；将复合污染降解菌的菌种接入液体培养基中进行培养，待菌种生长到对数生长期后，离心富集降解菌，得复合污染降解菌菌体；将复合污染降解菌菌体加入生物炭，得吸附有复合污染降解菌的生物炭；将吸附有复合污染降解菌的生物炭加至载体溶胶中得复合溶胶；将复合溶胶滴至交联液，低温交联固定，干燥即得。本发明生物炭固定化复合污染降解菌具有良好的生物活性和化学稳定性，可有效去除复合污染土壤中多环芳烃、加速土壤功能微生物恢复，成本低，制备工艺简单，对污染土壤修复效果明显。
重金属和多环芳烃是典型共存的无机和有机类污染物，而现有技术的多环芳烃降解菌剂大多只对单独存在的多环芳烃有降解效果，现亟需一种在重金属存在下对多环芳烃能够有效降解的多环芳烃降解菌剂。
发明内容：
为了克服现有技术存在的缺点，本发明提供一种菌棒生物炭固定化菲降解菌剂及其制备方法与应用，将菲降解菌株Sphingobium abikonense固定化于菌棒生物炭载体中，具有高效的菲降解效果，并且增强了菌株对重金属铜的耐受性。
为实现上述目的，本发明提供一种菌棒生物炭固定化菲降解菌剂的制备方法，具体步骤包括：
(1)菌悬液制备：将菲降解菌在LB培养基中于30℃，170r/min的恒温振荡器中震荡培养16h，然后以4000r/min离心5min，然后去除培养基成分后，再次用灭菌水重悬，在紫外-可见分光光度计波长为600nm处调节菌浓度，使其OD600＝0.8，制得的菌悬液在冰箱4℃保存，作为后续生物炭固定的供试菌株；
(2)包埋固定：取灭菌菌棒生物炭粉末和菌悬液置于锥形瓶中，菌棒生物炭：菌悬液＝1g：20mL，然后在恒温振荡器中震荡培养2-6h，其中温度为30℃，振荡速度为170r/min，制得吸附载体菌悬液；将吸附载体菌悬液与质量体积浓度为3g/mL海藻酸钠水溶液等体积混合，在振荡器中振荡30min；超净台中利用无菌注射器移取该混合溶液，匀速滴加到质量体积浓度为2g/mL的氯化钙水溶液中交联，静置12h，然后用无菌水冲洗颗粒，LB培养基里增殖培养3天，无菌水冲洗，即得到菌棒生物炭固定化菲降解菌剂即包埋菌炭小球，颗粒4℃保存。
所述菲降解菌为鞘氨醇菌(Sphingobium abikonense)，于2021年11月7日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为：CGMCC23559。
进一步的，步骤(1)中LB培养基的制备方法为：将10g胰蛋白胨、5g酵母浸出汁和10g氯化钠混溶于1L蒸馏水中，调节pH至7.2，121℃高压灭菌20min。
进一步的，所述菌棒生物炭为过100目筛的颗粒。
进一步的，所述菌棒生物炭的制备方法为：以风干的菌棒为试验材料，将过20目筛的菌棒样品于陶瓷容器中，压实后盖上盖子，置于可控温马弗炉中在400℃条件下热解2h，经冷却至室温后取出，取部分样品研磨过100目筛，制得菌棒生物炭，装于密封袋中置于干燥器内备用。
本发明还提供上述制备方法得到的菌棒生物炭固定化菲降解菌剂。
本发明还提供所述菌棒生物炭固定化菲降解菌剂在菲降解方面的应用。
进一步地，所述菲降解菌剂对铜菲复合污染有显著修复效果。
本发明选择铜和多环芳烃菲为代表污染物，以Sphingobium abikonense菌株为菲降解菌，将菲降解菌固定化于菌棒生物炭中对铜菲复合污染有显著修复效果。
与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
(1)本发明所述方法将菲降解菌株Sphingobium abikonense固定化于菌棒生物炭载体中，一方面生物炭发达的孔隙结构和较大的比表面积能够将污染物多环芳烃吸附于表面，提高菲降解菌的环境浓度，促进菌株对菲的降解。另一方面利用菌棒生物炭作为固定化微生物载体，既为菌株提供了丰富的营养物质和稳定的生长环境，同时实现了废物的循环利用，对环境友好。
(2)本发明所制备的菲降解菌剂，具有高效的菲降解效果，并且增强了菌株对重金属铜的耐受性，使得在铜离子胁迫下菌株Sphingobium abikonense对污染物菲依然有较高的降解效果。
附图说明：
图1为本发明涉及的实施例2中菌棒生物炭粉末的电镜扫描SEM图。
图2为本发明涉及的实施例2中无菌生物炭小球的切面SEM图。
图3为本发明涉及的实施例2中包埋菌生物炭小球的切面SEM图。
图4为本发明涉及的实施例3中不同初始浓度下游离菌对菲的降解效果实验结果示意图。
图5为本发明涉及的实施例3中游离菌对铜离子的耐受性实验结果示意图。
图6为本发明涉及的实施例3中铜离子胁迫下包埋菌炭小球对菲的降解效果实验结果示意图。
图7为本发明涉及的实施例3中炭小球中吸附的菲含量测定结果示意图。
图8为本发明涉及的实施例3中液体中剩余铜离子浓度测定结果示意图。
图9为本发明涉及的实施例3中炭小球中吸附的铜离子浓度测定结果示意图。
具体实施方式：
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例为菌棒生物炭固定化菲降解菌剂菲降解菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌悬液制备：将菌株Sphingobium abikonense在LB培养基中于30℃，170r/min的恒温振荡器中震荡培养16h，然后以4000r/min离心5min，倒掉上层培养基，菌体用灭菌水稀释后再离心，如此反复冲洗3遍，去除培养基成分后，再次用灭菌水重悬，在紫外-可见分光光度计波长为600nm处调节菌浓度，使其OD600＝0.8，制得的菌悬液在冰箱4℃保存，作为后续生物炭固定的供试菌株；
所述LB培养基的制备方法为：将10g胰蛋白胨、5g酵母浸出汁和10g氯化钠混溶于1L蒸馏水中，调节pH至7.2，121℃高压灭菌20min；
(2)包埋固定：取2g过100目的灭菌菌棒生物炭粉末置于100mL锥形瓶中，再加入40mL菌悬液(生物炭：菌悬液＝1g：20mL)，置于，然后在恒温振荡器中震荡培养6h，其中温度为30℃，振荡速度为170r/min，制得吸附载体菌悬液；将吸附载体菌悬液与质量体积浓度为3g/mL海藻酸钠水溶液等体积混合，在振荡器中振荡30min；超净台中利用无菌注射器移取该混合溶液，匀速滴加到质量体积浓度为2g/mL的氯化钙水溶液中交联，静置12h，然后用无菌水冲洗颗粒，LB培养基里增殖培养3天，无菌水冲洗，即得到菌棒生物炭固定化菲降解菌剂，即包埋菌炭小球，颗粒4℃保存。
在其他条件都相同的情况下，用40mL无菌水代替上述40mL菌悬液，制备相应的无菌炭小球作对照。整个过程无菌操作。
所述菌棒生物炭为以风干的菌棒为试验材料，将过20目筛的菌棒样品于陶瓷容器中，压实后盖上盖子，置于可控温马弗炉中在400℃条件下热解2h，经冷却至室温后取出，取部分样品研磨过100目筛，生物炭装于密封袋中置于干燥器内备用。
本实施例对菌棒生物炭粉末进行电镜扫描表征，结果如图1所示：生物炭粉末表面凹凸不平，富有孔隙，孔洞呈蜂窝状相互连接，很适合作为微生物生长的载体。
对制得的包埋菌炭小球进行电镜扫描表征，结果如图3所示：包埋菌炭小球内部的空隙中附着有大量的鞘氨醇菌，孔隙明显减少，且菌体细胞饱满完整，表明固定化技术对细胞毒害小，菌体未受到制备过程中外界的冲击，制得的固定化菲降解菌有良好的应用前景。
对制得的对照组无菌炭小球进行电镜扫描表征，结果如图2所示，无菌炭小球内部有丰富网状孔隙，致密度高，多孔结构十分明显，表明炭小球可以为菌体提供较大的寄居空间，维持细菌正常生理代谢。
实施例2：
本实施例为实施例1制备的包埋菌炭小球对菲的降解效果的测试实验。
1、测定菌株Sphingobium abikonense在不同初始浓度下对菲的降解效果，具体操作如下：
在7只30mL灭菌玻璃离心管中分别加入100uL、200uL、400uL、1.1mL、1.9mL、2.5mL、3.15mL、4.29mL浓度为5g/L的菲母液，过夜挥发，待丙酮挥发完全，再分别加入9mL无机盐培养基和1mL菌悬液，构成菲浓度为50mg/L，100mg/L，200mg/L，500mg/L，800mg/L，1000mg/L，1200mg/L和1500mg/L的体系，同时以1mL无菌水代替1mL菌悬液设置对照组，每组设置3个平行；整个过程采用无菌操作；然后将样品置于恒温振荡器(30℃，170r/min)中震荡7d后，测定溶液中残留的菲浓度。
所述无机盐培养基配方：将0.5g硝酸钠，1.0g磷酸二氢钾，0.02g氯化钙，0.2g硫酸镁，0.5g硫酸镁和1.0g磷酸二氢钠依次溶于1L蒸馏水中，调节pH为7.2，121℃，灭菌20min。
所述菲母液配方：称取0.5g菲，溶于100mL丙酮中，配制成浓度为5g/L的菲母液。
所述菌悬液为实施例1步骤(1)制得的菌悬液。
所述测定菲浓度的步骤如下：往装有样品的离心管里加10mL二氯甲烷(二氯甲烷和样品的体积比是1:1)，用涡旋仪涡旋1min，超声30min，之后再涡旋2min，在2000r/min条件下离心5min；取5ml一次性针管，针头安装0.22um的聚四氟乙烯滤器，针管内装适量无水硫酸钠，用移液枪移取下层二氯甲烷溶液2-3mL至针管，过滤至GC-MS进样瓶，测定菲浓度。
菌株Sphingobium abikonense在不同初始浓度下对菲的降解效果如图4所示。图4为Sphingobium abikonense降解菌菌悬液的游离菌在不同初始浓度下对菲的降解率。从图4可以看出，当菲浓度低于500mg/L时菌株的降解率较高，且菲浓度在200mg/L以下时菌株的降解率最高，均在90％以上；当菲浓度高于500mg/L时，降解率较低，并且在1500mg/L时降解率几乎为零，这时菌株可视为死亡。这表明，菲浓度0～200mg/L是菌株Sphingobiumabikonense游离状态下的最佳降解浓度，此后随着菲浓度的增加，降解效率不断降低，当菲浓度超过1500mg/L时，菌体已无降解效果。
2、测定菌株Sphingobium abikonense对Cu2+耐受性，具体步骤如下：
50mL灭菌锥形瓶中加入18mL LB培养基和2mL菌悬液，并加入适量浓度为10g/L的CuCl2水溶液配置成Cu2+浓度分别为0mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1、150mg·L-1、200mg·L-1的实验组，每组设置3个重复；在其他条件相同的情况下，以2mL无菌水代替2mL菌悬液，设置不加菌液的对照组，每组3个重复。整个过程无菌操作；置于30℃、170r/min恒温振荡器中培养2d，测每个培养体系的菌浓度。用紫外可见分光光度计测定600nm处的吸光值，用OD600表示结果。
所述浓度为10g/L的CuCl2水溶液配方：准确称取2.1093gCuCl2固体，充分溶解于100mL蒸馏水中，121℃高压灭菌20min，制得10g/L CuCl2水溶液。
所述菌悬液为实施例1步骤(1)制得的菌悬液。
菌株Sphingobium abikonense对Cu2+耐受性结果如图5所示。图5为游离菌株对Cu2 +耐受性柱状图。从图中可以看出，在Cu2+浓度为0～100mg/L范围内，菌株能够正常生长，但是当Cu2+浓度继续升高至150mg/L时，菌株几乎无法生长；随着Cu2+浓度不断增加，菌株的生长水平也不断下降，并且在高浓度时无法生长。这表明，Cu2+对菌株的生长有抑制作用，且菌株Sphingobium abikonense游离状态下对Cu2+的最大耐受浓度在100mg/L～150mg/L之间。
3、测定铜离子胁迫下实施例1制备的包埋菌炭小球对菲的降解效果，具体步骤如下：
(1)实验步骤：
玻璃离心管高压灭菌，超净台内，在30mL玻璃离心管中加1mL浓度为5g/L的菲母液，过夜挥发，待丙酮挥发完全后，设置如下实验组：
CK组：铜+菲，具体为在加菲的玻璃离心管中加入150uLCuCl2水溶液和10mLLB培养基，设置为对照组，(离心管中的菲浓度为500mg/L，Cu2+浓度为150mg/L)；
第F组：游离菌+菲+铜，具体为在加菲的玻璃离心管中加入150uLCuCl2水溶液、9mLLB培养基和1mL菌悬液；
第I组：包埋菌炭小球+菲+铜，在CK组基础上往离心管中加1g包埋菌炭小球；
第NI组：无菌炭小球+菲+铜，在CK组基础上往离心管中加1g无菌炭小球；
整个过程为无菌操作，每组设置3个重复，分别在2d，4d，10d，20d时破坏性取样，测定溶液、包埋菌炭小球和无菌炭小球中的菲浓度和Cu2+浓度。
所述菌悬液为实施例1步骤(1)制备得到。
所述包埋菌炭小球为实施例1菲降解菌的固定化方法制备得到的包埋菌炭小球。
所述无菌炭小球为采用实施例1方法，在其他条件都相同的情况下，用40mL无菌水代替40mL菌悬液，制备得到相应的无菌炭小球。
(2)菲浓度和Cu2+浓度的测定方法：
1)溶液中剩余菲浓度的测定：
往每组离心管里加10mL二氯甲烷，用涡旋仪涡旋1min，超声30min，之后再涡旋2min，离心机2000r/min离心5min。取5mL一次性针管，针头安装0.22um的聚四氟乙烯滤器，针管内装适量无水硫酸钠，用移液枪移取下层二氯甲烷溶液2-3ml至针管，过滤至GC-MS进样瓶，测定菲浓度。
2)炭小球中菲浓度的测定：
将炭小球从溶液中分离，捣碎后加入10ml二氯甲烷，其他步骤及条件与上述测菲步骤一致。
3)溶液中Cu2+的测定：
将测菲后剩余的上层上清液过0.45um的聚醚砜滤器，用ICP-MS测定。
4)炭小球中Cu2+的测定：将提完菲后的炭小球置于通风橱内，使二氯甲烷挥发完全，然后加入10mL体积百分比浓度为10％的稀硝酸水溶液，置于30℃、170r/min的恒温振荡器中振荡3h，过0.45um的聚醚砜滤器，用ICP-MS测定。
(3)实验结果：
1)在Cu2+胁迫下菲的降解效果如图6所示。从图中可以看出，在150mg/L高浓度铜离子胁迫下，F组游离菌对菲的降解率极低，几乎无降解；NI组的无菌炭小球对菲的吸附量在40％左右，并且在第10天之后吸附量不再增加；而I组的包埋菌炭小球对菲的的降解率随着时间的增加而不断增大，在第20d时降解率达到80％以上，降解效率显著高于游离菌。
2)炭小球中吸附的菲含量结果如图7所示。从图中可以看出，前4天，I组炭小球中的菲含量要高于NI组炭小球中的菲含量，之后随着时间的增加，NI组炭小球中菲含量在缓慢增加，但是I组生物炭小球中菲的含量却在逐渐降低，这是因为I组炭小球里的菌株对菲进行了降解。
3)溶液中Cu2+变化结果如图8所示。从图中可以看出，F组液体中Cu2+浓度最高，铜离子含量变化不大；而I组液体中，铜离子浓度最低，且明显低于NI组液体中的铜离子浓度。随着时间的增加，除空白组外，液体中铜离子浓度在不断降低，但是，在第4天之后，I和NI组液体中铜浓度又有增加，这是因为炭小球里吸附的铜离子发生了二次释放，使得液体中铜浓度增加。结果表明，固定化小球可高效反复吸附Cu2+，能循环利用。
4)炭小球中吸附的Cu2+含量结果如图9所示。在前4天，I组和NI组的炭小球中铜离子含量均不断增加，在第4d之后，铜离子含量又逐渐减少，这是因为炭小球中吸附的铜离子发生了二次释放，结果和液体中铜含量变化相对应。
Claims (10)
1.一种菌棒生物炭固定化菲降解菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
(1)菌悬液制备：将菲降解菌Sphingobium abikonense在LB培养基中于恒温振荡器中震荡培养，然后离心，去除培养基成分后，再次用灭菌水重悬，在紫外-可见分光光度计波长为600nm处调节菌浓度，使其OD600＝0.8，制得的菌悬液在冰箱4℃保存，作为后续生物炭固定的供试菌株；
(2)包埋固定：取灭菌菌棒生物炭粉末和菌悬液置于锥形瓶中，然后在恒温振荡器中震荡培养2-6h，制得吸附载体菌悬液；将吸附载体菌悬液与海藻酸钠水溶液等体积混合，在振荡器中振荡30min；超净台中移取该混合溶液匀速滴加到氯化钙水溶液中交联，静置，然后用无菌水冲洗颗粒，LB培养基里增殖培养3天，无菌水冲洗，即得到菌棒生物炭固定化菲降解菌剂。
2.根据权利要求1所述的菌棒生物炭固定化菲降解菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中菲降解菌Sphingobium abikonense在恒温振荡器中的培养条件：温度30℃，震荡速度170r/min，培养时间16h；离心转速为4000r/min，离心时间为5min。
3.根据权利要求1所述的菌棒生物炭固定化菲降解菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中LB培养基的制备方法为：将10g胰蛋白胨、5g酵母浸出汁和10g氯化钠混溶于1L蒸馏水中，调节pH至7.2，121℃高压灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的菌棒生物炭固定化菲降解菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中菌棒生物炭：菌悬液＝1g：20mL。
5.根据权利要求1所述的菌棒生物炭固定化菲降解菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中菌棒生物炭粉末和菌悬液在恒温振荡器中的培养条件：温度为30℃，振荡速度为170r/min。
6.根据权利要求1所述的菌棒生物炭固定化菲降解菌剂的制备方法，其特征在于，所述菌棒生物炭为过100目筛的颗粒。
7.根据权利要求1所述的菌棒生物炭固定化菲降解菌剂的制备方法，其特征在于，所述菌棒生物炭的制备方法为：以风干的菌棒为试验材料，将过20目筛的菌棒样品于陶瓷容器中，压实后盖上盖子，置于可控温马弗炉中在400℃条件下热解2h，经冷却至室温后取出，取部分样品研磨过100目筛，制得菌棒生物炭，装于密封袋中置于干燥器内备用。
8.一种如权利要求1所述制备方法得到的菌棒生物炭固定化菲降解菌剂。
9.一种如权利要求8所述的菌棒生物炭固定化菲降解菌剂在菲降解方面的应用。
10.根据权利要求9所述的菌棒生物炭固定化菲降解菌剂在菲降解方面的应用，其特征在于，所述菲降解菌剂对铜菲复合污染有显著修复效果。
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| Title |
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| 周宏飞;陈玮;杨鑫星;辛德东;巩菊芳;孙梅好;: "2株柴油降解菌的分离筛选及生长特性分析", 浙江师范大学学报(自然科学版), no. 01 * |
| 李骅;姜灿烂;丁大虎;杨倩;蔡天明;: "海藻酸钠-生物炭联合固定化菌株降解2-羟基-1,4-萘醌", 南京农业大学学报, no. 05 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114107276B (zh) | 2024-03-26 |
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