CN102911892B - 一株石油降解菌及其在三元采油污水处理中的应用 - Google Patents
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Abstract
一株石油降解菌及其在三元采油污水处理中的应用。属于石油微生物领域。它解决了目前缺少可应用到三元采油污水处理技术中的微生物菌种的问题。本发明石油降解菌为假单胞菌（ Pseudomonas sp.）JNS01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2012021。本发明假单胞菌JNS01能够在浓度高达1800mg/L、pH值为10.5的聚丙烯酰胺碱性溶液中生长良好，经过假单胞菌JNS01处理后的采出液中的原油含量可降低至25mg/L，降解率可达到92%。
Description
技术领域
本发明属于石油微生物领域，具体涉及一株能够在高度复杂的三元采油污水环境中以原油为唯一碳源生长的石油降解菌株以及其在三元采油污水处理中的应用。
背景技术
“碱-表面活性剂-聚合物”三元复合驱（ASP）是继聚合物驱后的又一项提高原油采收率的新技术。与聚合物驱相比，它在扩大波及体积的基础上，能够进一步提高洗油效率。大庆油田在二十世纪九十年代完成的5个三元复合驱先导性矿场试验结果已表明，三元复合驱可比水驱提高采收率20%以上，该项技术已逐渐成为油田可持续发展的关键技术之一。
截至目前，我国已经有很多复合驱油项目，分布于大庆、胜利、新疆、吉林、辽河、河南、江汉和大港等油田。复合驱已经大规模应用，而且一些没有注聚合物的区块也已经检测到聚合物，但与其相匹配的采出水处理工艺却明显滞后。三元复合驱的采出污水的组分十分复杂，水中含有大量的聚合物、表面活性剂和碱等化学药剂。油在水中形成O/W型乳化油，表面覆盖一层带负电荷的双电层，体系十分稳定，不易上浮到水面，特别是碱的加入使得污水的pH值高达10以上，造成常规水处理药剂失效。另外，聚合物的存在使得采出水粘度增加，采出水中胶态物质更加稳定，油珠上浮的阻力增大，且相互之间碰撞、聚并机会减少，给油水分离带来很大困难。目前复合驱污水主要采用“絮凝+沉降+过滤”的处理工艺，已不能适应复合驱采出水的水质状况，因此，开发一种高效的复合物驱采出水处理工艺和配套设备是我国油田开发面临的一个重要挑战。
在采出水处理工艺中，微生物处理技术因其具有成本低、操作简便、无二次污染、治理彻底等优势而越来越受到广泛的重视。微生物处理技术的核心就是获得适宜的菌种，但是由于三元复合驱采出水组分复杂，尤其是其高浓度的聚合物和高pH值环境对微生物具有极强的毒性作用，因而能够耐受三元复合驱采出水复杂环境的石油降解菌株沿不多见。这也是开发利用微生物技术处理三元采出污水工艺的最大障碍。因此，获得具有能在高浓度聚合物和高pH值环境中生长的石油降解菌株对于三元污水处理技术具有重要意义。
发明内容
本发明的目是为了解决目前缺少可应用到三元采油污水处理技术中的微生物菌种的问题，而提供一株石油降解菌及其在三元采油污水处理中的应用。
本发明的石油降解菌为假单胞菌（Pseudomonas sp.）JNS01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2012021。
所述的假单胞菌JNS01在三元采油污水处理中的应用。
该假单胞菌JNS01来源于大庆油田采油厂的采出水，经富集培养、分离得到。该菌株的菌落呈亮白色、圆形、边缘整齐、光滑湿润，为革兰氏阴性，杆状。
本发明的石油降解菌，它为假单胞菌（Pseudomonas sp.）JNS01，其16S rDNA基因序列参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol. VШ内容，根据其生理生化特征和16S rDNA基因序列，通过NCBI BLASTn程序比对，本发明假单胞菌JNS01与Pseudomonas aeruginosa S25的16S rDNA基因序列同源为99%，因此鉴定本发明的菌株为假单胞菌属的一个新菌种。
本发明的假单胞菌JNS01能够在含有高浓度聚合物的高碱性无机盐富集培养基中利用石油为唯一碳源生长。所述的富集培养基的配方为：每1000ml去离子水中含有K2HPO4·3H2O 5.2g，KH2PO4 3.7g，Na2SO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，NH4Cl 2.0g，微量金属盐溶液1ml；所述的微量金属盐溶液配方为1000ml去离子水中含有FeCl2·4H2O 0.3g，CoCl2·6H2O 0.038g，MnCl2·4H2O 0.02g，ZnCl2 0.014g，H3BO3 0.0124g，Na2MoO4·2H2O 0.04 g，CuCl2·2H2O 0.0034 g。该富集培养基中加入的唯一碳源是石油，其浓度为2 g/L。
本发明的假单胞菌JNS01的培养温度优选为30℃，培养摇床转速优选为200rpm。
本发明的假单胞菌JNS01能够在浓度高达1800mg/L、pH值为10.5的聚丙烯酰胺碱性溶液中生长良好。以往报道的石油降解菌株在这种高浓度聚丙烯酰胺的碱性环境下很难存活，并且达不到降解石油的效果。本发明的假单胞菌JNS01与现有的石油降解菌株相比，同时具有耐受高浓度聚丙烯酰胺和高浓度碱的优点，对于石油降解菌株在三元采油污水处理的实际应用中更具优势。
本发明假单胞菌（Pseudomonas sp.）JNS01属于假单胞菌属（Pseudomonas），保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2012年2月16日，保藏号为CCTCC NO：M 2012021。
本发明的假单胞菌JNS01能够以石油为唯一碳源生长，并将其矿化为CO2和H2O。在纯培养条件下，本发明假单胞菌JNS01能够在24h内将无机盐富集培养基中含量为2g/L的石油降解95%以上，菌液的OD620值可由0.1增加到0.8。将单胞菌JNS01实际应用于三元复合驱采出液的处理技术中，通过测定可知，经过假单胞菌JNS01处理后的采出液中的原油含量可降低至25mg/L，降解率可达到92%。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式提供一株石油降解菌，该菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）JNS01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2012021。该菌株的菌落呈亮白色、圆形、边缘整齐、光滑湿润，为革兰氏阴性，杆状。
本实施方式的假单胞菌JNS01来源于大庆油田采油厂的采出水，经富集培养、分离得到。具体步骤如下：将采集到的大庆油田采油厂采出水加入到无机盐富集培养基中，并加入2g/L原油进行富集培养，培养10天后开始传代培养，培养条件同上，每三天转接一次，转接10次后将培养液适当稀释后用LB固体平板培养基培养，筛选能够生长的菌株，选取生长最快的一株菌转接到无机盐液体培养基中，并加入2g/L的石油培养。所述的富集培养基的配方为：每1000ml去离子水中含有K2HPO4·3H2O 5.2g，KH2PO4 3.7g，Na2SO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，NH4Cl 2.0g，微量金属盐溶液1ml；所述的微量金属盐溶液配方为1000ml去离子水中含有FeCl2·4H2O 0.3g，CoCl2·6H2O 0.038g，MnCl2·4H2O 0.02g，ZnCl2 0.014g，H3BO3 0.0124g，Na2MoO4·2H2O 0.04 g，CuCl2·2H2O 0.0034 g。该富集培养基中加入的唯一碳源是石油。所述的LB固体平板培养基的配方为：每1000ml去离子水中含有酵母膏5g、蛋白胨5g、NaCl 10g、琼脂粉20g，用NaOH溶液调pH值为7.0。
将上述菌株进行16S rDNA基因提取并测序，其基因序列长度为1452 bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该菌株的16S rDNA基因序列参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol. VШ内容，根据其生理生化特征和16S rDNA基因序列，通过NCBI BLASTn程序比对，本发明假单胞菌JNS01与Pseudomonas aeruginosa S25的16S rDNA基因序列同源为99%，因此鉴定本发明的菌株为假单胞菌属的一个新菌种，并将其命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.）JNS01。
本实施方式的假单胞菌JNS01的培养温度优选为30℃，培养摇床转速优选为200rpm。
本实施方式的假单胞菌JNS01能够在浓度高达1800mg/L、pH值为10.5的聚丙烯酰胺碱性溶液中生长良好。以往报道的石油降解菌株在这种高浓度聚丙烯酰胺的碱性环境下很难存活，并且达不到降解石油的效果。本实施方式的假单胞菌JNS01与现有的石油降解菌株相比，同时具有耐受高浓度聚丙烯酰胺和高浓度碱的优点，对于石油降解菌株在三元采油污水处理的实际应用中更具优势。
本实施方式的假单胞菌JNS01能够以石油为唯一碳源生长，并将其矿化为CO2和H2O。在纯培养条件下，本发明假单胞菌JNS01能够在24h内将无机盐富集培养基中含量为2g/L的石油降解95%以上，菌液的OD620值可由0.1增加到0.8。将单胞菌JNS01实际应用于三元复合驱采出液的处理技术中，通过测定可知，经过假单胞菌JNS01处理后的采出液中的原油含量可降低至25mg/L，降解率可达到92%。
本实施方式的假单胞菌（Pseudomonas sp.）JNS01属于假单胞菌属（Pseudomonas），保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2012年2月16日，保藏号为CCTCC NO：M 2012021。
具体实施方式二：本实施方式将假单胞菌JNS01应用于三元复合驱采出液的处理：
实验样品：大庆油田采油三厂某聚驱单井采出液，其表面活性剂浓度为335mg/L，聚合物浓度为1800mg/L，总碱为3595mg/L，矿化度为6239mg/L，pH值为10.5，油含量为570 mg/L；
实验方法：取200mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入细胞浓度为OD620=1.2的假单胞菌JNS01培养液20mL，30℃培养18h，测定采出液中原油含量；
实验结果：通过测定发现，经过本发明的假单胞菌JNS01处理后，采出液中的原油含量为118mg/L，原油降解率为79%。
具体实施方式三：本实施方式将假单胞菌JNS01应用于三元复合驱采出液的处理：
实验样品：大庆油田采油三厂某聚驱单井采出液，表面活性剂浓度为465mg/L，聚合物浓度为1363mg/L，总碱为3742mg/L，矿化度5375 mg/L，pH值为8.46，油含量为412mg/L；
实验方法：取200 mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入细胞浓度为OD620=1.2的假单胞菌JNS01培养液20mL，30℃培养18h，测定采出液中原油含量；
实验结果：通过测定发现，经过本发明的假单胞菌JNS01处理后，采出液中的原油含量为97mg/L，原油降解率为79.1%。
具体实施方式四：本实施方式将假单胞菌JNS01应用于三元复合驱采出液的处理：
实验样品：大庆油田采油三厂某聚驱单井采出液，表面活性剂浓度为292mg/L，聚合物浓度为1281mg/L，总碱为2340mg/L，矿化度为5877mg/L，pH值为8.41，油含量为379 mg/L；
实验方法：取200mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入细胞浓度为OD620=1.2的假单胞菌JNS01培养液20mL，30℃培养18h，测定采出液中原油含量；
实验结果：通过测定发现，经过本发明的假单胞菌JNS01处理后，采出液中的原油含量为83mg/L，降解率为78%。
具体实施方式五：本实施方式将假单胞菌JNS01应用于三元复合驱采出液的处理：
实验样品：大庆油田采油三厂某聚驱单井采出液，表面活性剂浓度为315mg/L，聚合物浓度为1316mg/L，总碱为2057mg/L，矿化度为5699 mg/L，pH值为8.69，油含量为4130mg/L；
实验方法：取200mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入细胞浓度为OD620=1.2的假单胞菌JNS01培养液20mL，30℃培养18h，测定采出液中原油含量；
实验结果：通过测定发现，经过本发明的假单胞菌JNS01处理后，采出液中的原油含量为2045mg/L，降解率为50.5%。
具体实施方式六：本实施方式将假单胞菌JNS01应用于三元复合驱采出液的处理：
实验样品：大庆油田采油四厂某聚驱单井采出液，表面活性剂浓度为35mg/L，聚合物浓度为299mg/L，总碱为2575mg/L，矿化度为含油量为6050mg/L，pH值为8.95，油含量为330mg/L；
实验方法：取200mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入细胞浓度为OD620=1.2的假单胞菌JNS01培养液20mL，30℃培养27h，测定采出液中原油含量；
结果：通过测定发现，经过本发明的假单胞菌JNS01处理后，采出液中的原油含量为25mg/L，降解率为92%。
具体实施方式七：本实施方式将假单胞菌JNS01应用于三元复合驱采出液的处理：
实验样品：大庆油田采油四厂某聚驱单井采出液，表面活性剂浓度为51mg/L，聚合物浓度为475mg/L，总碱为3011mg/L，矿化度为含油量为6218mg/L，pH值为9.07，油含量为1520mg/L；
实验方法：取200mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入细胞浓度为OD620=1.2的假单胞菌JNS01培养液20mL，30℃培养28h，测定采出液中原油含量；
实验结果：通过测定发现，经过本发明的假单胞菌JNS01处理后，采出液中的原油含量为335 mg/L，降解率为78.9%。
具体实施方式八：本实施方式将假单胞菌JNS01应用于三元复合驱采出液的处理：
实验样品：大庆油田采油四厂某聚驱单井采出液，表面活性剂浓度为37mg/L，聚合物浓度为539mg/L，总碱为2877mg/L，矿化度为含油量为5799mg/L，pH值为9.13，油含量为420mg/L；
实验方法：取200 mL采出液，放到500mL三角瓶中，加入细胞浓度为OD620=1.2的假单胞菌JNS01培养液20mL，30℃培养18h，测定采出液中原油含量；
实验结果：通过测定发现，经过本发明的假单胞菌JNS01处理后，采出液中的原油含量为51mg/L，降解率为87.8%。
<110> 黑龙江吉纳森生物工程股份有限公司
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gggcagtaag ttaatacctt gctgttttga cgttaccaac agaataagca ccggctaact 480
tcgtgccagc agccgcggta atacgaaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta 540
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acactgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780
taaacgatgt cgactagccg ttgggatcct tgagatctta gtggcgcagc taacgcgata 840
agtcgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt acctggcctt 960
gacatgctga gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggaactcaga cacaggtgct 1020
gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac 1080
ccttgtcctt agttaccagc acctcgggtg ggcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac 1140
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gctacaatgg tcggtacaaa gggttgccaa gccgcgaggt ggagctaatc ccataaaacc 1260
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1.一株石油降解菌，该菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）JNS01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2012021。
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