CN109437470A - 一种清除海洋溢油的处理工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种清除海洋溢油的处理工艺，包括以下步骤：油膜预处理：按溢油量将经亲油改性的粘土颗粒喷洒于溢油油膜表面，利用经亲油改性的粘土颗粒与原油形成凝聚体，降低油水界面张力作用，使油膜初步分散；溢油降解：按溢油量将原油降解菌接种于油膜初步分散的溢油区域，待原油降解菌降解原油即可。该工艺可以有效提高原油降解菌对海洋溢油的降解率，提高原油污染物去除效果，在海洋溢油污染清除方面具有很好的应用潜力。

Description

一种清除海洋溢油的处理工艺

技术领域

本发明属于海洋环境保护领域，具体涉及一种清除海洋溢油的处理工艺。

背景技术

随着全球经济一体化进程的加快，海上交通运输业的发展和海洋油气资源 的进一步勘探开发，海洋溢油事故也不断地增多。海洋溢油污染是各种海洋污 染类型中发生频率最高、分布面积最广、危害程度最大的一种。

现有的溢油处理技术主要包括物理处理法、化学处理法和生物处理法。其 中，基于微生物降解技术的生物处理法已被证明是一种非常有效的石油污染清 除技术，其具有无污染、成本低、效果好等优点，较适合海上溢油应急处理的 实际应用，但是，采用单纯的微生物降解技术处理海洋溢油，其去除效率并不 高，如中国专利“一株海洋柴油降解菌QPH-9及其固定化方法”(申请号 CN2015108813989)公开了一种可以降解海洋柴油的菌株，游离态的该菌株对 柴油的降解率仅为49.1％，原油降解菌的原油降解率较低限制了生物处理技术 在海洋溢油污染处理中的应用。

通过筛选培养具有较高原油降解率的微生物是目前提高生物处理法去除 原油效率的主要研究思路，对功能性菌株的提取筛选存在一定的不可预见性和 随机性，研究进展较为缓慢，相较于高性能菌株的筛选培养，对海洋溢油处理 工艺的改进行研究较少，但是，对海洋溢油处理工艺的改进具有广泛的研究意 义，工艺改进对菌株的限定较小，能够适用于提高多种降解菌的原油降解效率， 具有更好的普适性，因此，对海洋溢油处理工艺的改进具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明提供了一种清除海洋溢油的处理工艺，该工艺可以有效提高原油降 解菌对海洋溢油的降解率，提高原油污染物去除效果，在海洋溢油污染清除方 面具有很好的应用潜力。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种清除海洋溢油的处理工艺,其特征在于，包括以下步骤：

油膜预处理：按溢油量将经亲油改性的粘土颗粒喷洒于溢油油膜表面，利 用经亲油改性的粘土颗粒与原油形成凝聚体，降低油水界面张力作用，使油膜 初步分散；

溢油降解：按溢油量将原油降解菌接种于油膜初步分散的溢油区域，待原 油降解菌降解原油即可。

作为优选，油膜预处理步骤中所述的经亲油改性的粘土颗粒为：CTAB-膨润 土颗粒、CTAB-天然土颗粒、Bent-膨润土颗粒、DMSO-高岭土颗粒中的一种或多 种。所述CTAB-膨润土颗粒为十六烷基三甲基溴化铵改性膨润土，所述CTAB-天 然土颗粒为十六烷基三甲基溴化铵改性天然土，Bent-膨润土颗粒为壳聚糖改性 膨润土，DMSO-高岭土颗粒为二甲基亚砜改性高岭土。

作为优选，所述的经亲油改性的粘土颗粒为Bent-膨润土颗粒，改性方法 包括以下步骤：

钠化：将一定量的膨润土与钠化剂混合进行钠化后将钠化膨润土烘干备用；

活化：将钠化膨润土在马弗炉中高温焙烧，将焙烧后的钠化膨润土与一定 量的草酸溶液混合,加热搅拌器搅拌酸化膨润土后，用去离子水将多余的草酸洗 净，抽滤后将滤饼烘干，得到活化钠化膨润土；

复合：壳聚糖和草酸溶液按一定比例混合加热搅拌得壳聚糖溶胶；按照一 定比例将活化钠化膨润土加入壳聚糖溶胶中，恒温高速搅拌混合负载壳聚糖后, 用去离子水洗涤，抽滤后烘干，以相同反应条件重复壳聚糖负载反应数次后， 将所得反应液静置冷却，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液，将反应液调节pH至中 性，抽滤后于烘干制得Bent-膨润土。

作为优选，活化步骤的焙烧温度为110℃～600℃，焙烧时间为4h，优选焙 烧温度为250℃。

作为优选，所述的油膜预处理步骤为：将经亲油改性的粘土颗粒与海水混 合，配制成1.0～3.0g/L的颗粒物溶液，按溢油量喷洒颗粒物溶液到溢油表层 后，在波浪条件下作用4h以上，以初步分散油膜。

作为优选，溢油降解步骤中所述的原油降解菌为Bacillus sp.JS Xiao Bai、Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong、D1、P-6、海洋石油降解 菌(Advenellakashmirensis)6-10-1的一种或多种；所述Bacillus sp.JS Xiao Bai和Providenciarettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong均保藏于中国普通微生物 菌种保藏管理中心,D1保藏号为CGMCC No.10287，P-6保藏号为CGMCC No.9913， 海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1的保藏号为CGMCC No.13003。

作为优选，溢油降解步骤中所述的原油降解菌代谢产物包括能够降低油水 界面张力的表面活性剂。

作为优选，所述的原油降解菌为Bacillus sp.JS Xiao Bai或Providenciarettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong，优选Bacillus sp.JS Xiao Bai。

作为优选，以Bacillus sp.JS Xiao Bai作为原油降解菌，所述处理工艺 的原油去除率达到76.2％～85.6％。

作为优选，所述的溢油降解步骤为：将Bacillus sp.JS Xiao Bai接种于 液体培养基中，放置在25～30℃恒温振荡器中以160r/min转速培养1天进行富 集得原油降解菌菌液，按溢油量在溢油区域内喷洒原油降解菌菌液即可，所述 富集培养基的配方为：氯化钠10g/L，浸牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，所 述富集培养基的溶剂为蒸馏水，富集培养基的pH值7.0。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：提供了一种清除海洋溢 油的处理工艺，该工艺可以有效提高原油降解菌对海洋溢油的降解率，提高原 油污染物去除效果，在海洋溢油污染清除方面具有很好的应用潜力。具体而言：

(1)采用本发明的处理工艺清除海洋溢油可以克服微生物与海洋溢油无 法充分接触导致的原油降解率低的问题，能够起到较好的清除效果。该处理工 艺中，通过油膜预处理步骤利用经亲油改性的粘土颗粒与原油形成凝聚体作用， 能在较短时间内破坏海洋溢油的大面积油膜，将其分散成小块的具有较大比表 面积的凝聚体，进而在原油降解菌与原油接触初期就能够更加充分的接触，微 生物可以与预处理所得的凝聚体形成新的凝聚体，更容易降解原油，从而提高 微生物的原油降解率，有效提高海洋溢油清除效果。

(2)优选代谢产物包括能够降低油水界面张力的表面活性剂的原油降解 菌。具有该属性的原油降解菌的代谢产物产生的表面活性剂，可降低漂浮在海 水表面油膜与海水的界面张力，使油膜分散，增大原油与降解菌的接触面积， 使微生物能够更好的与原油接触，提高原油降解率。同时，经过前期改性的粘 土颗粒对油膜预处理使海洋溢油的大面积油膜分散为具有较大比表面积的凝聚 体，使得溢油降解这一过程自开始时原油降解菌就能够与原油污染物充分接触， 这种充分接触的状态为微生物代谢反应提供了充分的碳源，使得微生物代谢活 动从初期就较为旺盛，能够产生更多的表面活性剂，进一步降低油水界面张力， 与颗粒作用共同促进油膜进一步分散形成具有更大比表面积的凝聚体，从而进一步提高原油降解效率，提高海洋溢油清除效果。

附图说明

图1为未经处理的膨润土的扫描电镜照片；

图2为焙烧温度250℃的Bent-膨润土的扫描电镜照片；

图3为不同焙烧温度的活化膨润土的XRD图谱；

图4为不同焙烧温度的Bent-膨润土的XRD图谱；

图5为本发明实施例筛选的Bacillus sp.JS Xiao Bai菌株的生长曲线；

图6为本发明实施例筛选的Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong 菌株的生长曲线；

图7为粘土颗粒联合Bacillus sp.JS Xiao Bai的原油去除率对比；

图8粘土颗粒联合Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong的原油 去除率对比；

图9为粘土颗粒联合Bacillus-LHF的原油去除率对比。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实 施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种清除海洋溢油的处理工艺,其特征在于，包括以下步骤：

油膜预处理：按溢油量将经亲油改性的粘土颗粒喷洒于溢油油膜表面，利 用经亲油改性的粘土颗粒与原油形成凝聚体，降低油水界面张力作用，使油膜 初步分散；

溢油降解：按溢油量将原油降解菌接种于油膜初步分散的溢油区域，待原 油降解菌降解原油即可。

海洋溢油污染现场具有一定的特殊性，轻质的原油不是均匀分布于水体内， 而是在海面上形成大面积连续的油膜，这就导致了直接向油膜表面接种原油降解 菌，微生物与原油的接触面积较小，微生物无法充分发挥降解作用，导致原油降 解效率进一步下降，限制了生物处理法在海洋溢油清除方面的应用。单纯使用微 生物对海洋溢油进行处理，即便采用菌株能够代谢产生表面活性剂以降低油水界 面张力，但仅依靠微生物代谢产生的表面活性剂也不足以在短时间内起到分散油 膜的作用，由于表面活性剂为菌株代谢产物，在原油降解菌作用于油膜表面初期 其含量很低，且微生物与原油的接触面积小，导致微生物代谢所需的碳源有限， 其代谢产生表面活性剂也较为缓慢，不能及时分散油膜，因此单独使用原油降解 菌的清除海洋溢油的效果往往不够理想。

采用实施例1的处理工艺清除海洋溢油可以克服微生物与海洋溢油无法充 分接触导致的原油降解率低的问题，能够起到较好的清除效果。该处理工艺中， 通过油膜预处理步骤利用经亲油改性的粘土颗粒与原油形成凝聚体，降低油水 界面张力作用，能在较短时间内破坏海洋溢油的大面积油膜，将其分散成小块 的具有较大比表面积的凝聚体，进而在原油降解菌与原油接触初期就能够更加 充分的接触，微生物可以与预处理所得的凝聚体形成新的凝聚体，更容易降解 原油，从而提高微生物的原油降解率，有效提高海洋溢油清除效果。

实施例1的处理工艺可具体为以下步骤：

油膜预处理：将经亲油改性的粘土颗粒与海水混合，配制成1.0～3.0g/L 的颗粒物溶液，按溢油量喷洒颗粒物溶液到溢油表层后，在波浪条件下作用4h 以上，以初步分散油膜；

溢油降解：将原油降解菌接种于富集培养基中，放置在25～30℃恒温振荡 器中以160r/min转速培养1天进行富集得原油降解菌菌液，按溢油量在溢油区 域内喷洒原油降解菌菌液即可。

实施例2

由于粘土颗粒本身不具备亲油性，对油质的吸附作用较小，为了在油膜预 处理中能够实现对油膜的初步分散，该步骤采用经亲油改性的粘土颗粒，降低 油水界面张力，保障油膜分散效果，具体所述的经亲油改性的粘土颗粒可以采 用CTAB-膨润土颗粒、CTAB-天然土颗粒、Bent-膨润土颗粒、DMSO-高岭土颗粒 中的一种或多种。

其中，所述DMSO-高岭土颗粒为二甲基亚砜改性高岭土，可由以下方法制 得：取一定量的高岭土、DMSO和去离子水，按照高岭土：DMSO：去离子水1:10:1 的比例混合均匀，磁力加热搅拌器作为反应装置，70℃水浴加热连续高速搅拌 72h，抽滤后产物于70℃下用烘箱烘干24h，密封保存，即制得DMSO改性的有 机高岭土，即为DMSO-高岭土。

所述CTAB-天然土颗粒为十六烷基三甲基溴化铵改性天然土，可由以下方 法制得：将取自黄河口天然土样品与浓度为1mol/L的氯化钠溶液混合，用磁 力加热搅拌器常温搅拌12h，搅拌结束后静置分层并弃去上清液，重复操作三 次保证天然土充分钠化，用去离子水洗涤，用硝酸酸化的硝酸银检测直至没有 沉淀产生，抽滤后将滤饼置于烘箱中70℃烘干得钠化天然土,在烧杯中加入钠 化天然土和去离子水，质量比为1:10，然后向混合液中加入1/4钠化天然土质 量的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，用磁力加热搅拌器在60℃水浴条件下 中速搅拌加热2h，静置冷却至室温后，用硝酸酸化的硝酸银检测直至没有沉 淀产生，证明Br^-已除净，抽滤后将滤饼置于烘箱中70℃烘干24h，即制得 CTAB改性的有机天然土，记为CTAB-天然土。

所述CTAB-膨润土颗粒为十六烷基三甲基溴化铵改性膨润土，将一定量的 膨润土与浓度为1mol/L的氯化钠溶液混合，用磁力加热搅拌器常温搅拌12h， 搅拌结束后静置分层并弃去上清液，重复操作三次保证钙基膨润土充分钠化， 用去离子水洗涤，用硝酸酸化的硝酸银检测直至没有沉淀产生，抽滤后将滤饼 置于烘箱中70℃烘干得钠化膨润土,在烧杯中加入钠化膨润土和去离子水，质 量比为1:10,然后向混合液中加入1/4钠化膨润土质量的十六烷基三甲基溴化 铵(CTAB)，用磁力加热搅拌器在60℃水浴条件下中速搅拌加热2h，静置 冷却至室温后，用硝酸酸化的硝酸银检测直至没有沉淀产生，证明Br^-已除净。 抽滤后将滤饼置于烘箱中70℃烘干24h，即制得CTAB改性的有机膨润土， 记为CTAB-膨润土。

所述Bent-膨润土颗粒为壳聚糖改性膨润土，在制备壳聚糖改性膨润土的 过程中，可通过对膨润土进行焙烧、酸化的预处理活化膨润土，以增强壳聚糖 与膨润土的复合效果，为了优选亲油改性最好的壳聚糖改性膨润土，发明人研 究了活化过程中焙烧温度对壳聚糖与膨润土的复合效果的影响。

壳聚糖改性膨润土的改性方法包括以下步骤：

(a)钠化：将一定量的膨润土(形貌如图1所示)与浓度为1mol/L的氯 化钠溶液混合，用磁力加热搅拌器常温搅拌12h，搅拌结束后静置分层并弃去 上清液，重复操作三次保证钙基膨润土充分钠化，用去离子水洗涤，用硝酸酸 化的硝酸银检测直至没有沉淀产生，抽滤后将滤饼置于烘箱中70℃烘干得钠化 膨润土；

(b)活化：将一定量的钠化膨润土在马弗炉中焙烧，设置温度分别为 110℃、250℃、400℃、600℃，焙烧时间均为4h，将焙烧后的钠化膨润土与一 定量的质量分数为10％的草酸溶液混合，在60℃条件下用磁力加热搅拌器搅拌 12h，用去离子水将多余的草酸洗净，抽滤后将滤饼置于烘箱中70℃烘干，得到 四种不同温度处理的活化钠化膨润土；

(c)复合：按照1g壳聚糖加入50ml质量分数为10％草酸溶液的比例混合 原料，50℃混合搅拌2h得壳聚糖溶胶；按照10g活化钠化膨润土加入1g壳聚 糖的比例，将四种活化钠化膨润土分别缓慢加到壳聚糖溶胶中，60℃下高速搅 拌24h后，完成壳聚糖的第一次负载后用去离子水洗涤，抽滤后于70℃烘干， 将烘干的样品按照原比例加到壳聚糖溶胶中，反应条件不变二次负载壳聚糖， 反应结束后静置冷却，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液，调节pH至7，抽滤后于 70℃烘箱中干燥24h，制得四种Bent-膨润土。

对上述方法中制得的不同温度的四种活化钠化膨润土和最终制得的四种 Bent-膨润土进行XRD分析实验，所得XRD图谱分别如图3和图4所示，由图3 和图4可以看出步骤(b)的焙烧温度为250℃条件下，膨润土与壳聚糖复合的 效果最好，即壳聚糖对膨润土的亲油改性效果最好，改性后的Bent-膨润土能够 对油脂起到较好的吸附效果，故优选焙烧温度为250℃的Bent-膨润土(形貌如 图2所示)为本发明清除海洋溢油的处理工艺所用的Bent-膨润土。

发明人还分别对未经处理的原始膨润土和焙烧温度为250℃的Bent-膨润 土进行了BET测试，测得原始膨润土样品的比表面积为26.44m²/g，经活化和 负载壳聚糖处理的Bent-膨润土的比表面积为69.39m²/g，通过数据可以得出， 250℃焙烧膨润土负载壳聚糖的比表面积明显大于原始膨润土，Bent-膨润土比 表面积明显增大，增加了与原油的接触面积，有利于原油分散和形成凝聚体， 在后续微生物降解过程中增大原油降解菌与原油的接触面积，提高微生物降解 石油的降解率。

实施例3

为了进一步提高清除海洋溢油的效果，实施例1的溢油降解步骤中所述的 原油降解菌代谢产物包括能够降低油水界面张力的表面活性剂。具有这属性的 原油降解菌的代谢产物产生的表面活性剂，可降低漂浮在海水表面油膜与海水 的界面张力，使油膜分散，增大原油与降解菌的接触面积，使微生物能够更好 的与原油接触，提高原油降解率。同时，经过前期改性的粘土颗粒对油膜预处 理使海洋溢油的大面积油膜分散为具有较大比表面积的凝聚体，使得溢油降解 这一过程自开始时原油降解菌就能够与原油污染物充分接触，这种充分接触的 状态为微生物代谢反应提供了充分的碳源，使得微生物代谢活动从初期就较为 旺盛，能够产生更多的表面活性剂，进一步降低油水界面张力，与颗粒作用共 同促进油膜进一步分散形成具有更大比表面积的凝聚体，从而进一步提高原油 降解效率，提高海洋溢油清除效果。

为了提高海洋溢油清除效果，发明人自青岛的不同海域筛选获得了两株能 够代谢产生表面活性剂的原油降解菌，分别命名为Bacillus sp.JS Xiao Bai 和Providenciarettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong，均保藏于中国普通微生物 菌种保藏管理中心，保藏日期为2018年9月28日，存活性经保藏中心于保藏 日检测结果均为存活，保藏编号分别为CGMCCNo.16546和CGMCC No.16545； Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong筛选自青岛红岛海域，Bacillus sp. JS Xiao Bai筛选自青岛金沙滩海域。

Bacillus sp.JSXiao Bai和Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong 可采用如下筛选方法取得：

1)富集：取自不同海域的海水分别进行处理，海水经滤膜过滤去除杂质后， 加入氯化钠、浸牛肉膏、胰蛋白胨配置成为细菌培养液，所述细菌培养液中各成 分的含量为氯化钠10g/L，浸牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，溶剂为除杂海水； 将细菌培养液置于25～30℃恒温振荡器中以160r/min转速培养7天进行富集， 得富集液；

2)驯化：取2mL步骤1)所得的富集液加入到50mL的原油浓度为10000mg/L 驯化培养基中，在步骤1)相同条件下培养7天，完成第一次驯化，取2mL第一 次驯化培养的培养液加入到50mL的原油浓度为15000mg/L驯化培养基中，继续 培养7天，完成第二次驯化，再取2mL第二次驯化培养基的培养液加入到50mL 的原油浓度为20000mg/L驯化培养基中，相同条件下培养7天即驯化完成得驯化 培养液；所述驯化培养基以过滤海水为溶剂，其配方中除原油外其他组分为：氯 化钠10g/L，浸牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L；

3)分离：配置培养基，所述培养基的配方为：氯化钠10g/L，浸牛肉膏5 g/L，胰蛋白胨10g/L，溶剂为蒸馏水；取2mL步骤2)所得驯化培养液加入到 50mL培养基中培养1天，取1mL该培养液加入装有9mL蒸馏水的试管中进行梯度 稀释，取各梯度稀释液100μL加入盛有牛肉膏蛋白胨固体培养基(向培养基中加 入琼脂，添加量为15g/L即得)的培养皿中，进行划线,在25～30℃恒温培养箱 中培养直至有单菌落长出,用已高压蒸汽灭菌的接种环挑出单菌分别接种于培养 基中置于25～30℃恒温振荡器中以160r/min转速培养1天进行增殖培养，得到 多种单菌株培养液；

4)表面活性剂检查(筛选)：步骤3)所得的每株单菌株均取一定量培养 液分别倒入不同的离心管中，置于高速旋转离心机中以10000rpm/min的转速离 心5分钟，取上清液即为含细菌代谢产物的发酵液，将8mL未染色和经苏丹红Ⅲ 染色后的液体石蜡分别加入装有60mL蒸馏水的直径为9cm的培养皿中，待整个 平板形成一层分散均匀的薄膜后，用微量移液器在油膜中心慢慢加入3mL离心所 得发酵液，测量排油圈直径，筛选出排油圈大于5cm的原油降解菌，在步骤4) 中分别自青岛红岛海域和金沙滩海域的海水中筛选出了一株排油圈为5.59cm的 原油降解菌和一株排油圈为6.35cm的原油降解菌，分别命名为Bacillussp.JS Xiao Bai和Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong，经测试计算，Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong的代谢物能将水油界面张力由 68.53mN/m降低至13.28mN/m；Bacillus sp.JS Xiao Bai的代谢物能将水油界 面张力由68.53mN/m降低到8.85mN/m。界面张力的计算方法，参照曹娟等在文献 (CRESSWELL H P，PAINTERD J，CAMERON K C.Tillage and water content effects on surface soil hydraulicproperties and short wave albedo[J].Soil Sci Soc Am J，1993，57：816－824.)中记载的方法；

5)鉴定：使用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公 司)对步骤4)筛选所得的2株单菌株进行基因组DNA提取。使用琼脂糖凝胶电 泳对提取得到的细菌基因组DNA进行检测，检测结果在GenBank上与已知的 16SrDNA进行BLAST，确定Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong为雷 氏普罗威登斯菌属(Providenciarettgeri)，Bacillus sp.JS Xiao Bai为芽 孢杆菌属(Bacillus)。

由上述方法筛选出的Bacillus sp.JS Xiao Bai的生长曲线如图5所示， 该菌株的代谢产物能将油水界面张力由68.53mN/m降低到8.85mN/m； Providencia rettgerisp.Hong 1 Xiao Zong的生长曲线如图6所示，该菌株 的代谢产物能将油水界面张力由68.53mN/m降低至13.28mN/m；即这两种菌株的 代谢产物中均包括能够降低油水界面张力的表面活性剂，可降低油膜的油水界面 张力，使油膜分散，增大原油与降解菌的接触面积，增加降解率。

除Bacillus sp.JS Xiao Bai和Providencia rettgeri sp.Hong 1Xiao Zong外，发明人在菌株筛选过程中通过上述方法还从海水中筛选出一株代谢产物 的表面活性剂对油水界面张力作用较小的菌株，其排油圈为1.2cm，该菌株经步 骤5)的鉴定方法鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)，命名为Bacillus-LHF，将该 菌株作为Bacillus sp.JSXiao Bai和Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong的对比菌株。

实施例4筛选菌株原油降解效率测试

实施例2分别测试了实施例1所得的原油降解菌对3种不同油品的原油降 解率，所述3种原油的组分如表1所示：

表1原油组分对比表

测试方法如下：将100mL过滤除杂后的海水加入250mL锥形瓶中，在121℃ 下高温灭菌，将0.1g原油和2mL原油降解菌菌液(实施例1步骤(3)所得的 单菌株培养液作为原油降解菌菌液)依次加入到灭菌后的装有过滤海水的锥形 瓶中，用脱脂棉对锥形瓶封口，放入模拟海洋环境的恒温振荡箱中(设置温度 25～30℃，120r·min^-1连续振荡)，振荡反应7天后，对所得样品多次萃取， 并检测得到处理后的油品含量，结合初始加入油量计算原油清除率，微生物对 原油的降解率，计算公式如下：

公式中，C₀和C_e表示最初加入原油和剩余原油的质量，经测定计算， Providenciarettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong对委内瑞拉原油、济北原油和柴 油的降解率依次为53.8％、45.6％和55.9％，即Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong在7天内对原油的降解率达到45.6％～55.9％；Bacillussp.JS Xiao Bai对委内瑞拉原油、济北原油和柴油的降解率依次为57.6％、49.3％和60.2％， 即Bacillus sp.JS Xiao Bai在7天内对原油的降解率达到49.3％～60.2％； Bacillus-LHF对委内瑞拉原油、济北原油和柴油的降解率依次为39.2％、30.6％、 45.9％，即在7天内对原油的降解率达到30.6％～45.9％；综上Bacillus sp.JS Xiao Bai和Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong均具有较高的原油 降解率，可应用于石油污染修复，其中，Bacillus sp.JS Xiao Bai的原油降 解率更加突出，作为本发明的工艺方法的优选原油降解菌。

实施例5处理工艺作用效果模拟测试

为了验证实施例1的清除海洋溢油的处理工艺的作用效果，实施例5模拟 了海洋溢油的油水体系，对不同颗粒和实施例3筛选出的3种原油降解菌(两 种优选菌株和一种对比菌株)联合作用去除原油(以委内瑞拉原油为例)的效 果进行了测试，测试方法包括以下步骤：

(1)将100mL过滤除杂后的海水加入250mL锥形瓶中，在121℃下高温 灭菌，将0.1g经亲油改性的粘土颗粒和0.1g原油加入到灭菌后的装有过滤海 水的锥形瓶中，用包裹着铝箔纸的橡胶塞封口，放入模拟海洋环境的恒温振荡 箱中(设置温度25～30℃，120r·min^-1连续振荡)，连续往复振荡反应4h后， 可观察到颗粒物与原油形成了油-悬浮颗粒物凝聚体；

(2)取2mL的原油降解菌菌液(实施例3步骤(3)所得的单菌株培养液 作为原油降解菌菌液)加入步骤(1)的锥形瓶中，同时用透气封口膜代替橡胶 塞为微生物提供有氧环境，继续在原有培养条件下振荡反应7天；

(3)完成步骤(2)后停止振荡，静置12小时，分离得到颗粒物样品和液 相。对颗粒物样品和液相多次萃取，并测定得到处理后的石油含量，计算得到 颗粒物结合原油量，结合初始加入油量计算原油清除率，原油清除率计算公式 如下：

公式中，C₀和C_e表示最初加入原油和剩余原油的质量，C'表示微生物菌体 和颗粒物与石油形成凝聚体中未能被石油醚萃取出来的原油质量。经测试计算， Bacillus sp.JSXiao Bai与不同的经亲油改性的粘土颗粒联合作用于委内瑞 拉原油的原油去除率如图7所示，Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong 与不同的经亲油改性的粘土颗粒联合作用于委内瑞拉原油的原油去除率如图8 所示，Bacillus-LHF与不同的经亲油改性的粘土颗粒联合作用于委内瑞拉原油 的原油去除率如图9所示，由图7至图9可以看出本发明所筛选的原油降解菌 与改性的粘土颗粒配合，均可以有效提高原油的去除效率，该方法在提高原油 降解菌降油率方面具有普适性，相较于单纯使用微生物清除海洋溢油，实施例1 的处理工艺可以更加高效彻底的清除海洋溢油污染，同时，Bacillus sp.JS Xiao Bai和Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong，尤其是Bacillus sp.JS Xiao Bai与粘土颗粒联合作用的效果更加优越，可作为该处理工艺的优选菌株。

以上所述，仅是本发明的实施例证而已，并非是对本发明作其它形式的限 制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型 为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明的技术方案 内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与 改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 中国石油大学（华东）

<120> 一种清除海洋溢油的处理工艺

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtatctctct ctaggtacgt tggctctaca tgtaaccccc aacttctggt ggtacaactc 60

tcgtggtggg acgggggggg tggacagggc cgggaacgta ttccccgcgg catggtgatc 120

cccgattact aacgattccc gcttcctgga agcgaattgc agcctacaat ccgaactgaa 180

aacggtttta tgaaattaac tccccctccc ggtcttgcag ctctttgtac cgtccattgg 240

aacacgtgtg tagcccaagg cataaggggc atgatgattt gacgtcctcc ccaccttcct 300

ccggtttggc accggcagtc accttaaaat ggccaactga atgatggcaa ctaaaaacaa 360

gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga ccaccaccat 420

gcaccacctg gcactctgct cccgaaggaa aaaccctatc tctagggttg tcagaagatg 480

tcaagaactg gtaagggtct tcccgttgct tccaattaaa ccacatgctc caccgcttgt 540

gcgggccccc gtcaattcct ttgaatttca gccttgcggc cgtactcccc aggcggaatg 600

cttaatgcgt taacttcagc actaaagggc ggaaaccctc taacacttaa cactcatcgt 660

ttaccgcgtg gaataccaag gtatctaatt ctggttgctc cccacgcttt cgccgctcca 720

gtgtcagtta cagaccagaa agtcgcttcg ccactggtgt tccttcatat ctctacgcat 780

ttcacgctac acatggaatc cactttctct tctgcactca agtctccagt ttcatgacct 840

cacggtggag cgtgggcttc acatcagact agaacactgc cgcgcttacg ccattatcga 900

tacgctgcac tacgtatacg cgctgctgca cgtagtagcg tggcttctgt agtacgtcag 960

tgccagctat ca 972

<210> 2

<211> 1042

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caaggactga tgcggtaagc gtgtacaact gtcaggcaac cactactggg gaaccacttc 60

cctggggtga cgggcggtgt gacagggccg ggaacgtatt cccgtagcat tctgatccgc 120

attactaacg attccgactt catggagtcg agttgcagac tgcgatccgg actacaacgt 180

actttatgaa ttcctcttgc tctcgcgagg tggcttctct ttgtccctcc attggatgac 240

gtgtgtagcc ctactcataa gggccatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccggt 300

ttatcaccgg cagtctcctt tgagtgccct agcgaatcac tggcagacaa ggatagcggt 360

tgctctcgta gcgggaccta acccaacagt taccaactga cgatgaccac gcccctgctg 420

cgcttgtgtt ctattgccag aagggacaaa tctctctctg tttgcttatc tggatgtgat 480

aagtaagtaa ggttcttctg gttgcatcta attaacccca ttgctcgctt gtttgggcgg 540

ccccccgtca attcatttga gtttcaacct tgcggccgta ctcccgcggg cggttgattt 600

aacgcgttgc tctactaagg cactccggag ggaacaacct ttgatctcct tatttacagg 660

atggactacc aggtatcaag cctgcttgct cccacgcttg tctaaccgac cgtctatttt 720

gtccaggggg ccgccctctc cacctgcatt ccccatatct ctacgcattt caccgctaca 780

caaggaaatc tacctctctc aacagactct agctgaccag tcatacatgt cctacccccg 840

attacagcgc gggggatctt acaatctatc ctaatcaacc acatgcgtgt gatttacacc 900

caataatacc gagtaatgct tgctacctat gtattacgct gctgctggca cgtagtagcc 960

gtgcttcttc agatcaggta cgtcagtcgt cgatatatag catcatcttc ttcctcccga 1020

agaagtattt acaacctgac ag 1042

<210> 3

<211> 1029

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccgtaactc tttaggtgct tggttccaaa tgttaaccta cctacttacg gtggtccaac 60

tcccggggtg tgacgggcgg tgtgtacaag ggccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 120

atccacgatt actaacgatt cccacttcat ggaggcgagt tgcagactcc aatccggact 180

gagaacgggt ttatgagatt agcttgctct cgcggggttg cttctctttg tatccgccat 240

tgtagcacgt gtgtagccct agtcataagg ggcatgatga cttgacgtca tccccacctt 300

cctccggttt gtcaccggca gtctcctttg agtgcccgac tgaatgatgg caactaaaaa 360

ccagggttgg cgctcgtggc ggacttaacc caacattttc gaacacaagt gaacaacacc 420

atggcccacc tggtctctgc tccccaagga aaagccctaa tctctggggt gttctaagaa 480

tgtcagaact gggtaaggtc cttcccgttg cttcaaatta aacaacaggc tcaaccgctg 540

gtgcggcccc ccgtcaattc ttttgagttc aacccttgcg gcggtatccc ccaggcggat 600

gatttaaggc gttacctccg aaataaacgg cggaaagcct ctaacttcta atccacatcg 660

tttacagcgt ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca 720

gtgtcagtta ttgaccagaa agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca 780

tttcacgcta cacatggaat tctactctcc tcttctggac tctagttgac cagtttcgat 840

gacccttcca ggttgagccc gtgggatttc acatcagact tatcaacact gcgtgcgctt 900

tacgccaata atcggataac gctgccacta cgtatacgcg ctgctggcac gtagtagcgt 960

gcttctcgta gtacgtcatg gtgcagctat cactagcgct gttcttccga agaacgagtt 1020

acgacctga 1029

Claims (10)

1.一种清除海洋溢油的处理工艺，其特征在于，包括以下步骤：

油膜预处理：按溢油量将经亲油改性的粘土颗粒喷洒于溢油油膜表面，利用经亲油改性的粘土颗粒与原油形成凝聚体，降低油水界面张力作用，使油膜初步分散；

溢油降解：按溢油量将原油降解菌接种于油膜初步分散的溢油区域，待原油降解菌降解原油即可。

2.根据权利要求1所述的清除海洋溢油的处理工艺，其特征在于，油膜预处理步骤中所述的经亲油改性的粘土颗粒为：CTAB-膨润土颗粒、CTAB-天然土颗粒、Bent-膨润土颗粒、DMSO-高岭土颗粒中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的清除海洋溢油的处理工艺，其特征在于，所述的经亲油改性的粘土颗粒为Bent-膨润土颗粒，改性方法包括以下步骤：

钠化：将一定量的膨润土与钠化剂混合进行钠化后将钠化膨润土烘干备用；

活化：将钠化膨润土在马弗炉中高温焙烧，将焙烧后的钠化膨润土与一定量的草酸溶液混合加热搅拌器搅拌酸化膨润土后，用去离子水将多余的草酸洗净，抽滤后将滤饼烘干，得到活化钠化膨润土；

复合：壳聚糖和草酸溶液按一定比例混合加热搅拌得壳聚糖溶胶；按照一定比例将活化钠化膨润土加入壳聚糖溶胶中，恒温高速搅拌混合负载壳聚糖后用去离子水洗涤，抽滤后烘干，以相同反应条件重复壳聚糖负载反应数次后，将所得反应液静置冷却，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液，将反应液调节pH至中性，抽滤后于烘干制得Bent-膨润土。

4.根据权利要求3所述的清除海洋溢油的处理工艺，其特征在于，活化步骤的焙烧温度为110℃～600℃，焙烧时间为4h，优选焙烧温度为250℃。

5.根据权利要求1所述的清除海洋溢油的处理工艺，其特征在于，所述的油膜预处理步骤为：将经亲油改性的粘土颗粒与海水混合，配制成1.0～3.0g/L 的颗粒物溶液，按溢油量喷洒颗粒物溶液到溢油表层后，在波浪条件下作用4h以上，以初步分散油膜。

6.根据权利要求1所述的清除海洋溢油的处理工艺，其特征在于，溢油降解步骤中所述的原油降解菌为Bacillus sp.JS Xiao Bai、Providencia rettgeri sp.Hong 1 XiaoZong、D1、P-6、海洋石油降解菌(Advenella kashmirensis)6-10-1的一种或多种；Bacillussp.JS Xiao Bai如Providencia rettgeri sp.Hong 1 Xiao Zong均保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC No.16546和CGMCC No.16545；D1保藏号为CGMCC No.10287，P-6保藏号为CGMCC No.9913，海洋石油降解菌(Advenellakashmirensis)6-10-1的保藏号为CGMCC No.13003。

7.根据权利要求1所述的清除海洋溢油的处理工艺，其特征在于，溢油降解步骤中所述的原油降解菌代谢产物包括能够降低油水界面张力的表面活性剂。

8.根据权利要求7所述的清除海洋溢油的处理工艺，其特征在于，所述的原油降解菌为Bacillus sp.JS Xiao Bai。

9.根据权利要求8所述的清除海洋溢油的处理工艺，其特征在于，所述处理工艺的原油去除率达到76.2％～85.6％。

10.根据权利要求8所述的清除海洋溢油的处理工艺，其特征在于，所述的溢油降解步骤为：将Bacillus sp.JS Xiao Bai接种于富集培养基中，放置在25～30℃恒温振荡器中以160r/min转速培养1天进行富集得原油降解菌菌液，按溢油量在溢油区域内喷洒原油降解菌菌液即可，所述富集培养基的配方为：氯化钠10g/L，浸牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，所述富集培养基的溶剂为蒸馏水，液体培养基的pH值7.0。