CN106006993B - 一种采用短短芽孢杆菌降解磷酸三苯酯的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用短短芽孢杆菌降解磷酸三苯酯的方法及其应用，属于环境有机污染物生物处理技术领域。该方法具体步骤包括：在温度为30℃条件下将短短芽孢杆菌接种于以磷酸三苯酯为唯一碳源的降解培养基中，恒温摇床降解5d后，采用气相色谱质谱联用法（GC‑MS）测定培养基中残留的磷酸三苯酯浓度，以此分析短短芽孢杆菌对磷酸三苯酯的降解效果。该方法对环境适应性强，成本较低，5d后有机磷阻燃剂降解率可达95.4%。实际应用价值高，为解决水体有机磷阻燃剂污染治理问题提供参考。

Description

一种采用短短芽孢杆菌降解磷酸三苯酯的方法及其应用
技术领域
本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，特别涉及一种采用短短芽孢杆菌降解磷酸三苯酯的方法及其应用。
背景技术
近年来，溴代阻燃剂（Brominated flame retardants, BFRs）在世界范围内被逐步禁用，有机磷阻燃剂（Organophosphorus flame retardants, OPFRs）因具良好的阻燃性能、低毒性等特点逐渐成为了BFRs的主要替代品，其生产和使用大幅增长。OPFRs在纺织、建筑材料、电子、化学试剂等行业中被广泛使用，据报道，2013年OPFRs在中国的产量已达15万吨，且每年以15%的速度递增。由于OPFRs在材料中的添加方式以直接添加而非化学键合成的方式为主，导致其在生产和利用过程中容易被释放到环境中而造成污染。目前在世界范围内的大气、灰尘、水、沉积物、土壤、生物体等环境介质，甚至人体中均检测出了OPFRs。环境中的OPFRs可以通过呼吸、饮食、意外摄入等多种途径进入人体，其具有神经毒性、生殖毒性、致癌性和基因毒性。作为新一类有机污染物，OPFRs在环境中的生态风险和健康安全效应引起了环境研究者的广泛关注。磷酸三苯酯（TPhP）是最常用的一类有机磷阻燃剂，现已越来越受到人们的关注。
目前，有机磷阻燃剂主要采用物理化学、生物方法予以去除，其中物理化学方法因其较高的运行成本、容易造成二次污染等诸多问题，不能成为污染治理的首选技术。微生物法降解/转有机污染物具有环境友好性和低成本性，因而成为水体有机污染修复的最安全、经济、有效途径。有机磷阻燃剂微生物降解在实际应用过程中往往效率不高，因此有机磷阻燃剂高效降解菌的筛选及应用具有一定的研究意义。从专利申请情况来看，目前仅有申请号为201410438100.2，名称为一种采用苏云金芽孢杆菌降解磷酸三（2-氯乙基）酯的方法，申请公布号为CN104261568A。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种采用短短芽孢杆菌降解磷酸三苯酯的方法及其应用，通过短短芽孢杆菌对磷酸三苯酯的快速高效降解，为其污染治理和生物修复提供技术方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种采用短短芽孢杆菌降解磷酸三苯酯的方法，包括以下步骤：
（1）将短短芽孢杆菌接种到已灭菌的富集培养基中，摇床中振荡培养；
（2）收集菌种，然后接种于磷酸三苯酯降解培养基中摇床振荡培养；
（3）培养基中的磷酸三苯酯经过气相色谱质谱联用仪测定，分析短短芽孢杆菌对磷酸三苯酯的降解效果。
优选的，步骤（1）所述的富集培养基组成为：5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl，蒸馏水1000 mL，pH 为6.5-7.5。
优选的，步骤（1）所述的培养条件为：温度为20-40 ℃，转速为120-180 rpm，培养时间为16-32 h。
优选的，步骤（2）所述的磷酸三苯酯降解培养基组成为：1g/L NH4NO3，1.5 g/LKH2PO4，3 g/L K2HPO4，0.5-2 mg/L磷酸三苯酯，2mL/L微量元素溶液，1000mL蒸馏水，pH 为6.5-7.5。其中微量元素溶液组成为：4g/L MgSO4，4 g/L ZnSO4，1g/L CuSO4，1g/L MnSO4，1g/L FeSO4·7H2O，1g/L CaCl2，其余为水。
优选的，步骤（2）所述的培养条件为：温度为20-40 ℃，转速为120-180 rpm，培养时间为3-7 d。
所述的短短芽孢杆菌筛选于广东贵屿镇电子垃圾污染水体沉积物，此菌株的驯化采用梯度增加污染物的方法，在无机盐培养基中加入磷酸三苯酯，配置磷酸三苯酯浓度梯度为0.5、1、2、5、10、20mg/L的驯化培养基，采用梯度增加污染物浓度的驯化方法进行驯化。该菌株为革兰氏阴性菌，观察外部形态，其芽孢，呈短杆状，菌落湿润光滑、边缘整齐、表面为隆起的乳白色不透明圆形菌落，可以从广东省微生物菌种保藏中心获取，保藏号为GDMCC1.825。
在此条件下降解培养5d，磷酸三苯酯的降解率达到95.4%。
与现有技术相比，本发明具有如下优点与技术效果：
1、本发明提供了一种采用微生物降解有机磷阻燃剂的方法，该方法对环境适应性强，对有机磷阻燃剂降解效果较好，且成本较低。
2、采用本发明的方法对磷酸三苯酯的降解率达到95.4%。
附图说明
图1是磷酸三苯酯标准样品的GC-MS图；
图2是不同时间短短芽孢菌对磷酸三苯酯的降解曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、降解菌株的筛选
（1）采集污染场地水体中的沉积物，称取1g沉积物样品加入到含有磷酸三苯酯浓度为5mg/L的富集培养基中，于30℃、150rpm恒温摇床中培养。富集培养基的主要成分为：5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，蒸馏水1000 mL，pH 为7.0。
（2）每2天转接1次，每次转接的同时提高5mg/L的磷酸三苯酯的浓度，直到磷酸三苯酯的浓度达到40mg/L后，接种到40mg/L磷酸三苯酯为唯一碳源的无机盐培养基中。无机盐培养基的主要成分为：1g/L NH4NO3，1.5 g/L KH2PO4，3 g/L K2HPO4，40 mg/L磷酸三苯酯，2mL/L微量元素溶液，1000mL蒸馏水，pH 为7.0。其中微量元素组成为：4g/L MgSO4，4 g/LZnSO4，1g/L CuSO4，1g/L MnSO4，1g/L FeSO4·7H2O，1g/L CaCl2。
（3）连续培养2周后，采用稀释梯度法、平板涂布法对菌株进行分离纯化，挑选生长较快、形态不同的菌落，确保是纯的单一菌株后，将其接种到固体斜面培养基上，于4℃保存于冰箱中，待后续进行讲解实验。固体斜面培养基的主要成分为：3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，琼脂18g/L，蒸馏水1000 mL，pH 为6.5。
2、降解菌株的鉴定
（1）菌体及菌落形态特征
该菌株为革兰氏阴性菌，观察外部形态，其芽孢，呈短杆状，菌落湿润光滑、边缘整齐、表面为隆起的乳白色不透明圆形菌落。
（2）16S rDNA序列
通过16S rDNA序列测定和分析比较，该序列与Brevibacillus brevis的16S rDNA序列的同源达到99.9%，该菌株确定为短短芽孢杆菌，序列如序列表1所示，命名为Brevibacillus brevis YH，其16S rDNA序列（共1403bp）已提交到genebank，登录号为KU921105。该菌可以从广东省微生物菌种保藏中心获取，保藏号为GDMCC1.825。
实施例2 短短芽孢杆菌对磷酸三苯酯的降解分析
将短短芽孢杆菌接种到装有已灭菌的500mL富集培养基的1000mL三角瓶中，置于恒温摇床内，30℃、150rpm，培养24h，富集培养基的主要成分为：5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，蒸馏水1000 mL，pH 为7.0。
将富集培养的菌液置于50mL灭菌离心管中，以6000g的转速离心5min后，收集菌体并用无菌生理盐水反复洗涤并离心3次，最后加入生理盐水配置成一定浓度（OD600=0.6）的菌悬液，将1mL配置好的菌悬液加入到含有19mL的灭菌后的降解培养基中进行降解实验，30℃、150rpm，培养5d后，样品经过GC-MS测定，分析菌体对磷酸三苯酯的降解效果。降解培养基的主要成分为：1g/L NH4NO3，1.5 g/L KH2PO4，3 g/L K2HPO4，1 mg/L磷酸三苯酯，2mL/L微量元素溶液，1000mL蒸馏水，pH 为7.0。其中微量元素组成为：4g/L MgSO4，4 g/L ZnSO4，1g/L CuSO4，1g/L MnSO4，1g/L FeSO4·7H2O，1g/L CaCl2。
磷酸三苯酯的浓度采用GC-MS进行测定，分析条件如下：
（1）气相色谱条件
色谱柱：Rxi-5MS；
进样口温度：280℃；
升温程度：初温50℃，以15℃/min升至200℃，保持1min；再以4℃/min升至250℃，保持2min；
载气：高纯氦，纯度大于99.999%；
恒流控制：1mL/min；
模式：不分流进样；
进样量：1mL。
（2）质谱条件
离子源：EI源；
温度：200℃；
接口温度：280℃；
溶剂延迟时间：3min；
扫描质量范围：50-450m/z；
特征离子：326。
配置磷酸三苯酯浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2的标准溶液，绘制磷酸三苯酯浓度-峰面积标准曲线，磷酸三苯酯标准样品的GC-MS图如图1所示。以接种灭活的短短芽孢杆菌为对照组，培养5d后对照组磷酸三苯酯浓度为0.968mg/L，最终实验组磷酸三苯酯浓度为0.045mg/L，通过对对照组和实验组的比较可以得到，降解效率为95.4%，如图2所示。
实施例3
同实施例2，只是富集培养过程中，富集培养基pH为6.5，培养条件为：温度为20℃、摇床转速为120 rpm、培养时间为16h，最终短短芽孢杆菌对磷酸三苯酯的降解率为94.8%。
实施例4
同实施例2，只是富集培养过程中，富集培养基pH为7.5，培养条件为：温度为40℃、摇床转速为180 rpm、培养时间为32 h，最终短短芽孢杆菌对磷酸三苯酯的降解率为93.9%。
实施例5
同实施例2，只是降解过程中，降解培养基中磷酸三苯酯浓度为0.5 mg/L，降解培养基pH为6.5，培养条件为：温度为20℃、摇床转速为120 rpm、培养时间为3d，最终短短芽孢杆菌对磷酸三苯酯的降解率为89.5%。
实施例6
同实施例2，只是降解过程中，降解培养基中磷酸三苯酯浓度为2 mg/L，降解培养基pH为7.5，培养条件为：温度为40℃、摇床转速为180 rpm、培养时间为7d，最终短短芽孢杆菌对磷酸三苯酯的降解率为93.6%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
GGCTGGCTCCTTGCGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCCCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGTTTTAAGAGATTGGCGTCCTCTCGCGAGGTAGCATCCCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGTCTTGTCGACGGCAGTCTCTCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAAGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCGCTGCCCCGAAGGGAAGCTCTGTCTCCAGAGCGGTCAGCGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCACTCTTGCGAGCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGCGTTAGCTGCGGCACTGAGGGTATTGAAACCCCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATACCGCTTTCCTCTTCTGCACTCAAGCTACACAGTTTCCGATGCGAACCGGGGTTGAGCCCCGGGCTTTAACACCAGACTTACATAGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCGTCAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTATTCGTCCCTAACAACAGAACTTTACAATCCGAAGACCTTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAAATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTAGGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCAGGCCCATCTCCCAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTCTTTTCGGATCATGCGATCCAAAAACCTATCCGGTATTAGCATAAGTTTCCCTATGTTATCCCAGTCTGAGAGGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAGGGTCCGAAGAGACTCGCTCGACTTGCAT

Claims (4)

1.一种采用短短芽孢杆菌降解磷酸三苯酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将短短芽孢杆菌接种到已灭菌的富集培养基中，摇床中振荡培养；短短芽孢杆菌的序列如序列表1所示，命名为Brevibacillus brevis YH，其16S rDNA序列（共1403bp）已提交到genebank，登录号为KU921105；所述的培养条件为：温度为20-40 ℃，转速为120-180rpm，培养时间为16-32 h；
（2）收集菌种，然后接种于磷酸三苯酯降解培养基中摇床振荡培养；所述的培养条件为：温度为20-40 ℃，转速为120-180 rpm，培养时间为3-7d；
（3）培养基中的磷酸三苯酯经过气相色谱质谱联用仪测定，分析短短芽孢杆菌对磷酸三苯酯的降解效果。
2.根据权利要求1所述的一种采用短短芽孢杆菌降解磷酸三苯酯的方法，其特征在于：步骤（1）所述的富集培养基组成为：5 g/L牛肉膏；10 g/L蛋白胨；5 g/L NaCl，蒸馏水1000mL，pH 为6.5-7.5。
3.根据权利要求1所述的一种采用短短芽孢杆菌降解磷酸三苯酯的方法，其特征在于：步骤（2）所述的磷酸三苯酯降解培养基组成为：1g/L NH4NO3，1.5 g/L KH2PO4，3 g/LK2HPO4，0.5-2 mg/L磷酸三苯酯，2mL/L微量元素溶液，1000mL蒸馏水，pH 为6.5-7.5；其中微量元素溶液组成为：4g/L MgSO4，4 g/L ZnSO4，1g/L CuSO4，1g/L MnSO4，1g/L FeSO4·7H2O，1g/L CaCl2，其余为水。
4.权利要求1~3任一项所述的一种采用短短芽孢杆菌降解磷酸三苯酯的方法在有机磷阻燃剂污染水体生物修复方面的应用。
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