CN111172053A - 一株多环芳烃降解菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及降解微生物领域，针对现有技术的多环芳烃降解菌群种类不明确及缺少最优降解效率菌种的问题，公开了一株多环芳烃降解菌及其应用，一株多环芳烃降解菌，所述多环芳烃降解菌为菲高效降解菌，命名为HJ2，所述HJ2属于Staphylococcus sp．，HJ2的16s rDNA基因序列的正向序列如SEQ ID NO.1所示；16s rDNA基因序列的反向序列如SEQ ID NO.2所示。所述的多环芳烃降解菌在多环芳烃菲降解中的应用。本发明筛选出了Staphylococcus sp．菌系的菲高效降解菌，丰富了多环芳烃降解菌种类，具有较高的降解效率及有针对性的进行菲降解，筛选工艺简单，降解效果极佳。

Description

一株多环芳烃降解菌及其应用
技术领域
本发明涉及降解微生物领域，尤其是涉及一株多环芳烃降解菌及其应用。
背景技术
多环芳烃(PAHs)是环境中分布十分广泛的一类疏水性持久性有机污染物，易在土壤中累积并通过食物链传递，其“三致效应”和生物毒性对生态环境及人体健康危害很大，大气、土壤、水体及水体沉积物，还有生物体内是我国PAHs检出率最高的地方，它们的高毒性和“三致”效应引起人们的担忧，同时威胁着环境安全。土壤微生物修复技术是技术最成熟、最完善的生物修复技术，虽然存在降解菌属存活期短，较难降解高环PAHs等缺点，但具有效率高、成本低、避免土壤失活等优点，是较佳修复生态环境的技术。微生物降解是目前用来修复环境中多环芳烃污染的最主要方式，微生物降解技术在去除环境污染物方面不仅具有经济、高效等特点，而且不会引起环境的二次污染，是目前降低环境中有机污染的重点突破方向。
专利号CN200810147113.9，专利名称为“多环芳烃好氧降解菌群的富集与驯化筛选方法及应用”，向加入多环芳烃和基础培养基的开口玻璃瓶内加入受石油污染的土壤进行多环芳烃好氧降解微生物的富集与驯化，30d后向加入多环芳烃、基础培养基、微量金属液、维生素c溶液及吸附剂的锥形瓶内接入富集驯化的土壤。在温度为25～30℃、转速为100r/min的振荡器中培养5～7天后，进行循环转接，在循环次数大于8次后即可得到高效去除多环芳烃的好氧降解菌群。本方法能够富集与驯化筛选到对多环芳烃具有好氧降解性能好的微生物菌群，对萘、菲、芴和芘的好氧降解速率分别为：5.46mg·L-1·d-1；0.48mg·L-1·d-1；0.05mg·L-1·d-1及0.06mg·L-1·d-1。
其不足之处在于，所筛选的菌群属类不明确，并没有针对性的对哪种多环芳烃进行降解，未给出具体的最优的降解效率。
发明内容
本发明是为了克服现有技术的多环芳烃降解菌群种类不明确及缺少最优降解效率菌种的问题，提供一株多环芳烃降解菌及其应用，筛选出了Staphylococcus sp.菌系的菲高效降解菌，丰富了多环芳烃降解菌种类，具有较高的降解效率及有针对性的进行菲降解，筛选工艺简单可控，降解效果极佳且环保。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一株多环芳烃降解菌，所述多环芳烃降解菌为菲高效降解菌，命名为HJ2，所述HJ2属于Staphylococcus sp.，HJ2的16s rDNA基因序列的正向序列如SEQ ID NO.1所示；16s rDNA基因序列的反向序列如SEQ ID NO.2所示。
菲是3类致癌物，萘的芳香性比菲高，因此菲比它更容易反应，菲在结构上不仅具有一个“湾区”还有一个“K区”，这两个结构使菲在生物体中具有强烈的“三致”效应。菲同时具有“湾区”、“K区”的独特化学结构是探究降解氧化酶生化机制的重要基石。同时，PAHs代表性有机物是菲，因为菲在生态系统中含量高且检测方法简易，成本较低，部分细菌、藻类等可利用菲作为碳源与能源进行生长。通过微生物的代谢利用，菲最终降解成一些低毒害的小分子或二氧化碳，达到降解的目的，特别是细菌在菲降解过程中发挥着主要作用。本发明中分析了舟山市的PAHs污染状况和分布特征，总体来看低环的萘、菲、荧蒽和芘的检出浓度最高；通过筛选、分离及纯化得到名称为HJ2的菲高效降解菌。
作为优选，所述菲高效降解菌为HJ2的培养物或者传代后的培养物。
作为优选，所述HJ2的筛选方法为：配制无机盐培养基，灭菌后，向培养基中加入土壤样品，所述培养基体积与所述土壤样品质量比为4-4.5:1，在130-135rpm、30-32℃下培养5-7d；取上述土壤培养液接种于无机盐培养基中，再加入多环芳烃母液，多环芳烃母液浓度为20-22g/L，30-32℃恒温培养4-5d，得到多环芳烃培养液；向已灭菌的固体LB培养基中加入多环芳烃母液，光照培养，30-32℃培养3-5d，待有菌落长成后，挑选周围有透明降解圈的单菌落，即为HJ2。
作为优选，所述多环芳烃母液为多环芳烃菲、芘、荧蒽母液。
所述的多环芳烃降解菌在多环芳烃菲降解中的应用。
菌株HJ2对环境的适应能力较强，适温性较好，在温度20℃-35℃的范围内活性降解率都比较好；对酸碱度有一定的敏感度，在pH 6.0-pH 8.0范围内可以较好的降解菲，但过酸或过碱的环境会抑制菌株的作用。其适盐范围广，在盐度5‰-20‰时均能发挥作用，低盐度与高盐度的效果较中间盐度偏好；菲的初始浓度在1mg/L-10mg/L的范围内呈从低到高再到下降的趋势，最佳初始降解浓度为5mg/L；HJ2在温度30℃、pH 7.0、盐度20‰、菲初始浓度5mg/L条件下菲的降解效果最好，48h后菲的降解率达86.66％，由此可见菌株HJ2对多环芳烃菲具有较强的降解能力。
作为优选，所述HJ2的菌悬液的制备：将LB固体培养基30-32℃恒温培养，培养22-24h后，待看到有完整的直径5-15mm的单菌落后，再挑取单菌落到LB液体培养基中，再在30-32℃下，130-135rpm振荡培养12-14h后备用。
作为优选，所述HJ2的降解条件为：采用菲母液作为唯一碳源，HJ2在温度20-35℃、pH 6.0-8.0、NaCl盐度5-20‰、菲母液初始浓度1-10mg/L，45-52h后菲的降解率达65.27％。
为了能够更好的运用生物修复技术来解决PAHs污染土壤的问题，我们需要对降解微生物的环境和可控因素等进行更深入的研究，通过合理地改善一些可控因子，使微生物的代谢处于最佳状态，从而选择出最优化的方案来治理污染环境。影响多环芳烃微生物降解的有生物和非生物因素，如温度、盐度、pH值、土壤类型、通气状况、营养盐、所处的深度、扩散速率、微生物适应性、生物利用率、季节因素、多环芳烃的浓度、多环芳烃微生物的理化特性等。此外，由于海洋环境的特殊，土壤和水体的盐度有所不同，对微生物降解多环芳烃的效果也发挥着重要作用，盐度高低能够直接影响菌群的活性和数量，所以需要对其相关的活性条件作出最合适的参数范围的探索及定义；探究温度、盐度、pH、菲的浓度这些因素对HJ2降解菲的影响，并采用GC-MS检测菲的残留浓度，分析环境因素对菲降解菌HJ2的影响，能够为HJ2应用于多环芳烃海洋污染的实地修复提供理论依据和技术指导。
作为优选，所述HJ2的优化降解条件为：采用菲母液作为唯一碳源，HJ2在温度30-32℃、pH 7.0-7.2、NaCl盐度18-20‰、菲母液初始浓度5-6mg/L，48-50h后菲的降解率达86.66％。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)筛选出了Staphylococcus sp.菌系的菲高效降解菌HJ2，丰富了多环芳烃降解菌种类；具有较高的降解效率及有针对性的进行菲降解；
(2)筛选工艺简单可控，降解效果极佳且环保，高效节能，也可避免造成二次污染，更符合实际环境修复的要求，能够实现彻底修复。
附图说明
图1是基于菌株HJ2和相近菌株的基因序列构建的系统发育树。
图2是HJ2在不同环境下的形态特征(A为菌体在液体LB中的形态，B为菌株在固体培养基中的形态，C为菌体进行革兰氏染色后油镜观察下的形态)。
图3是HJ2的扫描电镜下的细胞形态图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。
总实施例
本发明提供了一株多环芳烃降解菌，所述多环芳烃降解菌为菲高效降解菌，命名为HJ2，所述HJ2属于Staphylococcus sp.，HJ2的16s rDNA基因序列的正向序列如SEQ IDNO.1所示；16s rDNA基因序列的反向序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了所述菲高效降解菌为HJ2的培养物或者传代后的培养物。
本发明提供了所述HJ2的筛选方法为：配制无机盐培养基，灭菌后，向培养基中加入土壤样品，所述培养基体积与所述土壤样品质量比为4-4.5:1，在130-135rpm、30-32℃下培养5-7d；取上述土壤培养液接种于无机盐培养基中，再加入多环芳烃母液，多环芳烃母液浓度为20-22g/L，30-32℃恒温培养4-5d，得到多环芳烃培养液；向已灭菌的固体LB培养基中加入多环芳烃母液，光照培养，30-32℃培养3-5d，待有菌落长成后，挑选周围有透明降解圈的单菌落，即为HJ2。
本发明提供了所述多环芳烃母液为多环芳烃菲、芘、荧蒽母液。
本发明提供了所述的多环芳烃降解菌在多环芳烃菲降解中的应用。
本发明提供了所述HJ2的菌悬液的制备：将LB固体培养基30-32℃恒温培养，培养22-24h后，待看到有完整的直径5-15mm的单菌落后，再挑取单菌落到LB液体培养基中，再在30-32℃下，130-135rpm振荡培养12-14h后备用。
本发明提供了所述HJ2的降解条件为：采用菲母液作为唯一碳源，HJ2在温度20--35℃、pH 6.0-8.0、NaCl盐度5-20‰、菲母液初始浓度1-10mg/L，45-52h后菲的降解率达65.27％。
本发明提供了，所述HJ2的优化降解条件为：采用菲母液作为唯一碳源，HJ2在温度30-32℃、pH 7.0-7.2、NaCl盐度18-20‰、菲母液初始浓度5-6mg/L，48-50h后菲的降解率达86.66％。
具体实施例以菲、芘、荧蒽作为目标污染物，通过以此为唯一碳源筛选出可以降解多环芳烃的降解菌。菲和荧蒽是PAHs中三个苯环的代表物，芘作为PAHs中4个苯环的代表物。实验采用舟山石油化工工业园区地带排污口的底泥，24h内带回实验室进行细菌分离。
I、多环芳烃降解菌的筛选
用丙酮配制多环芳烃母液，母液浓度为20g/L。取9个500mL的三角瓶，配制2000mL无机盐培养基,向三角瓶中加入200mL无机盐培养基，用封口膜封口。灭菌后，向培养基中加入25g土壤样品(葡萄糖可加可不加)，置于摇床130rpm，30℃培养5-7d；取10％土壤培养液接种于新鲜的无机盐培养基中，培养基中加多环芳烃母液50μL，再置于摇床恒温培养4-5d；取10％培养液接种于另一新鲜的多环芳烃无机盐培养基中，培养基中加多环芳烃母液100μL，重复该步骤2-3次(多环芳烃的含量设置逐次增加)。以菲、芘、荧蒽三种多环芳烃为唯一碳源，且每种设三个平行。
配制1000mL的生理盐水，吸取9mL到试管中，灭菌备用。向灭菌好的固体LB培养基中加入多环芳烃母液200μL，摇晃均匀后倒到平板上。待培养基凝固后，用移液管吸取1mL多环芳烃培养液到试管，再吸取1mL稀释过的液体到另一试管中，以此往下，稀释至10-2、10-3、10-4、10-5后，取100μL涂布到固体平板上，将平板倒置于恒温光照培养箱中，设置温度为30℃，培养3-5d，待有菌落长成后，挑选周围有透明降解圈的单菌落，在新鲜的固体LB培养基上划线分离、纯化，菌株采用斜面平板在4℃保存。
II、菌株鉴定
(1)形态特征观察
将纯化后的菌株单菌落接种到新鲜固体平板上进行划线，在30℃下恒温培养2-3d，可观察其生长情况和形态特征；另外将单菌落接种于LB液体培养基中，观察其生长形态；菌株的细胞形态在电子显微镜下观察，革兰氏属性采用革兰氏染色法并在光学显微镜下观察。
(2)生理生化试验
16s rDNA及基因序列鉴定分析
16S rDNA是用来鉴定细菌种属的一种常见方法，主要是因为基因序列较为稳定且不同的细菌它们的基因序列会存在部分差异，因此利用分析这种差异可以确认细菌的种类。
基因DNA的提取过程：用灭菌后的枪头取活化后的菌株单菌落至1.5mL EP管中，管中加800μL左右的无菌水，并不断吹打，至液体浑浊后，在7000rpm离心5min。取出上层清液倒掉，加500μL无菌水冲洗，摇匀。将EP管放入沸水中水浴10min后，再放入冰水中10min，再7000rpm离心5min。提取上层清液至新的1.5mL离心管，放至-20℃冷冻48h。
PCR扩增方法：选择细菌引物，通过引物对HJ2的DNA进行PCR扩增，16S rDNA的正向引物为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-S’)，反向引物为1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')；
16S rDNA PCR反应混合体系：
Figure BDA0002248133920000051
Figure BDA0002248133920000061
16S rDNA PCR扩增反应条件：
Figure BDA0002248133920000062
PCR反应液进行1.1％琼脂糖电泳检测，将跑完电泳的琼脂糖凝胶利用凝胶成像系统进行检测，在成像仪看到清晰地发光条带后将扩增后的序列送去测序。
III、鉴定所得结果
(1)降解菌的筛选与分离
通过无机盐培养基培养1-2周后涂布到含有多环芳烃的固体培养基中，在恒温培养箱中培养，在培养初期均无菌落形成，培养24h后有一些小菌落形成，但形状较小，过了48h后才有明显的菌落形成，72h后可观察到单菌落的表面形态，以及单菌落周围的降解圈，最终在含有菲的培养基上挑出了一株较好的菌株，并命名为HJ2。
(2)降解菌的形态特征
菌株在LB液体培养基中培养48h后呈黄色半透明状，底部有白色菌体沉淀，呈粘稠状；菌株在LB固体平板上生长较快，24h有大面积菌落出现，大概48h后出现清晰可见的菌落，菌落表面呈乳白色，中间有部分凸起，规则圆形，边缘整齐，表面光滑，质地黏稠，有呈单个、成对及成堆状分布。挑选长势较好的单菌落制备菌悬液，将菌悬液加入含有菲的无机盐培养液中，并和没有加菌液的菲无机盐培养液作对照，将培养液均放入恒温振荡器中培养24h，加菌液的培养基呈白色半透明状。通过革兰氏染色，，如图2所示，菌株HJ2革兰氏染色显示菌体为紫色，阳性菌；将菌体放在扫描电镜下，看到的菌体形态如图3所示，在电子显微镜下HJ2呈球状，有荚膜，菌体大小为直径0.5μm左右。
(3)降解菌生理生化特征分析
对HJ2的生理生化鉴定结果如表1所示，结果表明HJ2能还原硝酸盐，V-P试验、精氨酸水解、D-麦芽糖、D-海藻糖、甲基-B-D葡萄糖吡哺苷、奥普托欣耐受、D-甘露糖等反应为阳性，L-天冬氨酸芳胺酶、D-乳糖、尿素酶、D-甘露醇、α-葡萄糖苷酶、水杨素试验等反应为阴性。
表1HJ2的生理生化鉴定结果
Figure BDA0002248133920000071
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性
(4)降解菌16S rDNA及基因序列分析和系统发育树构建
利用27F和1492R作为细菌HJ2的双向引物进行扩增，经电泳检测，在凝胶成像仪上可以看到清晰地发光条带。
经测序得到的基因序列正向序列为：AGACTTGGCGCGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGAACAGATAAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAACATATTGAACCGCATGGTTCAATAGTGAAAGGCGGCTTTGCTGTCACTTATAGATGGATCCGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTATCAGGGAAGAACAAATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGACGGTACCTGATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTATGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTG
反向序列为：
AATTTTGTCACTTCGACGGCTAGCTCCATAAATGGTTACTCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACAACTTTATGGGATTTGCTTGACCTCGCGGTTTAGCTGCCCTTTGTATTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAAATCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGCTTAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTGTCCCCCGAAGGGGAAGACTCTATCTCTAGAGCGGTCAAAGGATGTCAAGATTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGATCCCCACGCTTTCGCACATCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTGCGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTTCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTAC
将HJ2的16s rDNA基因序列在Genbank上进行基因比对，与Staphylococcus warneristrain AW25的序列相似度达到了99％，与Staphylococcus pasteuri strain ATCC 51129的序列相似度达到了99％，与Staphylococcus haemolyticus strain JCM 2416的序列相似度达到了98％，可以确定细菌HJ2属于葡萄球菌(Staphylococcus)。
基于菌株HJ2和相近菌株的基因序列构建的系统发育树如图1所示。由实施例1-5以及对比例1-3的数据可知，只有在本发明权利要求范围内的方案，才能够在各方面均能满足上述要求，得出最优化的方案，得到最优的性能的氧化铅，各工艺参数才能使得材料利用、回收率最大化。而对于配比的改动、原料的替换/加减，或者加料顺序的改变，均会带来相应的负面影响。
IIII、菲高效降解菌的降解条件优化
通过微生物治理污染土壤的研究已经有很多年了，为了能够更好的运用生物修复技术来解决PAHs污染土壤的问题，我们需要对降解微生物的环境和可控因素等进行更深入的研究，通过合理地改善一些可控因子，使微生物的代谢处于最佳状态，从而选择出最优化的方案来治理污染环境。影响多环芳烃微生物降解的有生物和非生物因素，如温度、盐度、pH值、土壤类型、通气状况、营养盐、所处的深度、扩散速率、微生物适应性、生物利用率、季节因素、多环芳烃的浓度、多环芳烃微生物的理化特性等。此外，由于海洋环境的特殊，土壤和水体的盐度有所不同，对微生物降解多环芳烃的效果也发挥着重要作用，盐度高低可能直接影响菌群的活性和数量。
(1)、制备菌悬液
配置100mL的LB液体培养基，取5mL分装到试管中。将划线好的LB固体培养基放入恒温培养箱30℃培养，培养24h后，待看到有完整小指大小的单菌落后，用灭菌的枪头挑取单菌落到LB液体培养基中，将试管斜45°放入恒温振荡器30℃，130rpm振荡培养12h后，将5mL的菌液全部倒入新鲜的100mL液体LB培养基中，继续培养，用紫外分光光度计测定OD值。
(2)、制备降解体
在灭菌三角瓶中，加入一定浓度的菲甲醇母液，过夜，待甲醇挥发完全，加入无机盐培养基及5mL上述制备好的菌悬液制成25mL的降解体系。通过人工改变pH、盐度、温度、菲的浓度等条件，定时取样，分别测定培养基中菲的残留浓度。
(3)本发明研究了培养温度、培养基初始pH、培养基盐度、菲的初始浓度添加对HJ2降解菲的影响，通过用GC-MS检测菲的残留浓度，确定了HJ2降解菲的最适环境条件。通过多次实验得到以下实验结果：菌株HJ2对环境的适应能力较强，适温性较好，在温度20℃—35℃的范围内活性降解率都可以。对酸碱度有一定的敏感度，在pH 6.0-pH 8.0范围内可以较好的降解菲，但过酸或过碱的环境会抑制菌株的作用。其适盐范围广，在盐度5‰-20‰时均能发挥作用，低盐度与高盐度的效果较中间盐度偏好。菲的初始浓度在1mg/L-10mg/L的范围内呈从低到高再到下降的趋势，最佳初始降解浓度为5mg/L。通过对比发现，HJ2在温度30℃、pH 7.0、盐度20‰、菲初始浓度5mg/L条件下菲的降解效果最好，48h后菲的降解率可达86.66％。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 浙江省海洋水产研究所
<120> 一株多环芳烃降解菌及其应用
<130> 2019
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 1
agacttggcg cgtgctatac atgcaagtcg agcgaacaga taaggagctt gctcctttga 60
cgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg gataacctac ctataagact gggataactt 120
cgggaaaccg gagctaatac cggataacat attgaaccgc atggttcaat agtgaaaggc 180
ggctttgctg tcacttatag atggatccgc gccgtattag ctagttggta aggtaacggc 240
ttaccaaggc aacgatacgt agccgacctg agagggtgat cggccacact ggaactgaga 300
cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg gcgaaagcct 360
gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg tcttcggatc gtaaaactct gttatcaggg 420
aagaacaaat gtgtaagtaa ctgtgcacat cttgacggta cctgatcaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg 540
gcgtaaagcg cgcgtaggcg gttttttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 600
gagggtcatt ggaaactgga aaacttgagt gcagaagagg aaagtggaat tccatgtgta 660
gcggtgaaat gcgcagagat atggaggaac accagtggcg aaggcgactt tctggtctgt 720
aactgacgct gatgtgcgaa agcgtgggga tcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttatg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacgac cgcaagttga aactcaaagg aattgacggg 900
gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccaa 960
atcttg 966
<210> 2
<211> 948
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 2
aattttgtca cttcgacggc tagctccata aatggttact ccaccggctt cgggtgttac 60
aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta caagacccgg gaacgtattc accgtagcat 120
gctgatctac gattactagc gattccagct tcatgtagtc gagttgcaga ctacaatccg 180
aactgagaac aactttatgg gatttgcttg acctcgcggt ttagctgccc tttgtattgt 240
ccattgtagc acgtgtgtag cccaaatcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca 300
ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcaac ttagagtgcc caacttaatg atggcaacta 360
agcttaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga 420
caaccatgca ccacctgtca ctttgtcccc cgaaggggaa gactctatct ctagagcggt 480
caaaggatgt caagatttgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc 540
accgcttgtg cgggtccccg tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca 600
ggcggagtgc ttaatgcgtt agctgcagca ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc 660
actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgatcc ccacgctttc 720
gcacatcagc gtcagttaca gaccagaaag tcgccttcgc cactggtgtt cctccatatc 780
tctgcgcatt tcaccgctac acatggaatt ccactttcct cttctgcact caagttttcc 840
agtttccaat gaccctccac ggttgagccg tgggctttca catcagactt aaaaaaccgc 900
ctacgcgcgc tttacgccca ataattccgg ataacgcttg ccacctac 948

Claims (8)

1.一株多环芳烃降解菌，其特征是，所述多环芳烃降解菌为菲高效降解菌，命名为HJ2，所述HJ2属于Staphylococcus sp．，HJ2的16s rDNA基因序列的正向序列如SEQ ID NO.1所示；16s rDNA基因序列的反向序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据利要求1所述的多环芳烃降解菌，其特征是，所述菲高效降解菌为HJ2的培养物或者传代后的培养物。
3.根据权利要求1所述的多环芳烃降解菌，其特征是，所述HJ2的筛选方法为：配制无机盐培养基，灭菌后，向培养基中加入土壤样品，所述培养基体积与所述土壤样品质量比为4-4.5:1，在130-135rpm、30-32 ℃下培养5-7 d；取上述土壤培养液接种于无机盐培养基中，再加入多环芳烃母液，多环芳烃母液浓度为20-22 g/L，30-32 ℃恒温培养4-5 d，得到多环芳烃培养液；向已灭菌的固体LB培养基中加入多环芳烃母液，光照培养，30-32℃培养3-5d，待有菌落长成后，挑选周围有透明降解圈的单菌落，即为HJ2。
4.根据权利要求1所述的多环芳烃降解菌，其特征是，所述多环芳烃母液为多环芳烃菲、芘、荧蒽母液。
5.如权利要求1所述的多环芳烃降解菌在多环芳烃菲降解中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是，所述HJ2的菌悬液的制备：将LB固体培养基30-32 ℃恒温培养，培养22-24 h后，待看到有完整的直径5-15mm的单菌落后，再挑取单菌落到LB液体培养基中，再在30-32℃下，130-135 rpm振荡培养12-14 h后备用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征是，所述HJ2的降解条件为：采用菲母液作为唯一碳源，HJ2在温度20 --35 ℃、pH 6.0-8.0、NaCl盐度5-20 ‰、菲母液初始浓度1-10mg/L，45-52 h后菲的降解率达65.27%。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征是，所述HJ2的优化降解条件为：采用菲母液作为唯一碳源，HJ2在温度30-32℃、pH 7.0-7.2、NaCl盐度18-20 ‰、菲母液初始浓度5-6 mg/L，48-50 h后菲的降解率达86.66％。
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戴娟: "舟山海域PAHs的分布及菲高效降解菌的筛选", 《浙江海洋大学 海洋与渔业研究所毕业论文》 *

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