KR20090119175A

KR20090119175A - 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 저영양세균바실러스 발리스모르티스 1ａ 균주 및 상기 균주의배양액을 이용한 고추역병 발생 억제 방법

Info

Publication number: KR20090119175A
Application number: KR1020080045054A
Authority: KR
Inventors: 여윤수; 구본성; 윤상홍; 김수진; 이창묵; 이미혜; 장길수; 권태룡
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청)
Priority date: 2008-05-15
Filing date: 2008-05-15
Publication date: 2009-11-19
Also published as: KR101015971B1

Abstract

본 발명은 고추밭 근권 토양에서 분리한 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis) 1A 균주에 관한 것으로, 상세하게는 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 갖는 신규한 저영양세균 바실러스 발리스모르티스 1A 균주 및 상기 균주의 배양액을 이용한 고추역병 발생 억제 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의해 제공되는 저영양세균 바실러스 발리스모르티스 1A 균주는 여러 가지 식물 병원균에 대하여 항균 효과가 있으며, 특히 고추작물의 수확량에 심각한 피해를 일으키는 고추역병균(Phytophthora capsici)에 대하여 강력한 항균력을 나타낸다.

항진균 활성, 고추역병, 저영양세균

Description

식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 저영양세균 바실러스 발리스모르티스 1Ａ 균주 및 상기 균주의 배양액을 이용한 고추역병 발생 억제 방법{OLIGOTROPHIC BACTERIA BACILLUS VALLISMORITS 1A STRAIN WITH ANTIFUNGAL ACTIVITY AGAINST PLANT PATHOGENIC FUNGI AND INHIBITING METHOD OF PHYTOPHTHORA BLIGHT BY USING THE STRAIN}

본 발명은 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 갖는 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis) 1A 균주 및 상기 균주의 배양액을 이용한 고추역병 발생 억제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고추역병균, 고추탄저병균, 잿빛곰팡이균, 시들음병균 등과 같은 대표적인 식물토양전염병에 대하여 항균활성을 가지는 신규한 바실러스 발리스모르티스 1A 균주 및 상기 균주의 배양액을 이용한 고추역병 발생 억제 방법에 관한 것이다.

고추역병은 물에서 진화하여 육지에 정착한 반 수생균으로 물에서 증식하고 물에 따라 전파된다. 대부분의 역병균은 기주식물에 대해 강한 병원성을 가지고 있으며 상처 없이도 기주의 세포벽을 분해하여 침입하는 1차 침입자이다. 역병균은 병든조직을 2차로 침입하지 않으므로 병든 식물체에서 분리된 역병균은 대부분 그 병해의 주원인이다.

역병은 일단 발생되면 치료가 거의 불가능하므로 병 발생을 예방하는 것이 최선의 방책이며 이미 병이 발생된 경우에는 더 이상 번지지 않도록 하는데 목표를 두어야 한다. 역병의 관건은 식물체를 건전하게 키우는 것과 병 발생 환경요인을 없애는 것이지만 등록약제를 예방적으로 적용하여 병원균의 증식을 억제하고 사전에 병이 발생 되지 않도록 하는 것이 매우 중요하다. 실질적으로 역병방제를 위해 현재 저항성품종의 재배, 윤작 등이 행해지고 있는데 지금까지 가장 효율적인 것으로 알려진 방제법은 살균제를 이용한 화학적 방제이다. 이러한 화학적 방제를 이용한 고추역병 방제를 위해 고추재배 토양에 사용되고 있는 살균제의 양은 매년 증가하며 이렇게 사용된 화학농약의 과다사용으로 인하여 식물병원균의 농약 저항성 획득, 잔류독성, 토양의 산성화, 인축의 독성, 천적에 미치는 영향과 식수원의 오염 및 생태계 파괴 등 그 피해가 날로 심각해지고 있으며 이로 인한 사회문제도 심각해지고 있다. 이러한 관점에서 볼 때 상기 고추역병 식물병 방제에 사용 할 수 있는 독성이 없고 환경에 부작용을 일으키지 않는 무공해 살균제의 개발이 절실하게 요구되고 있는데 그것의 하나로 토양내의 길항미생물을 이용한 식물병원균 억제 방법이 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 고추밭 근권 토양으 로부터 저영양배지를 이용해 분리, 동정한 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis) 1A 균주가 식물병원성 진균에 대해 우수한 항진균 활성을 나타내며, 상기 균주의 배양액 역시 우수한 항진균 활성을 나타낼 뿐더러 특히 고추 작물의 수확량에 심각한 피해를 일으키는 고추역병균(Phytophthora capsici)에 대해 강력한 항균력을 나타냄을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

이에 따라 본 발명은 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 갖는 저영양세균 바실러스 발리스모르티스 1A 균주, 및 상기 균주가 생산하는 배양액을 이용한 고추역병 방제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 갖는 저영양세균 바실러스 발리스모르티스 1A 균주(수탁번호 KACC 91342P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주의 배양액을 포함하는 고추역병 발생 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주의 배양액을 사용한 고추역병 발생 억제 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 저영양세균 바실러스 발리스모르티스 1A 균주는 고추역병균인 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici ), 고추탄저병균인 콜렉토트리키움 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 잿빛 곰팡이균인 보트 리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 시들음병균인 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum ) 등의 여러 가지 식물병원균에 대해 우수한 항균력을 나타내는 동시에, 고추역병 병원균의 생장을 강력하게 저해 하는 항균 활성을 나타낸다. 따라서, 상기 균주가 생산하는 균체 배양액을 식물병의 방제제로서 농용 미생물 친환경 제제 등에 이용할 수 있다.

또한, 상기 균주는 저영양세균으로 통상 농도의 고영양 배지에서는 잘 분리되지 않기 때문에 생리활성물질 탐색에도 거의 이용되지 않으며, 상기 균체의 배양액에 포함되어 있는 항균활성물질은 기존의 밝혀진 물질과는 구조적으로 다른 독특한 신규 화합물 혹은 합성을 위한 선도물질일 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 갖는 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis) 1A 균주, 및 상기 균주의 배양액을 이용한 고추역병 발생 억제 방법에 관한 것이다.

상세하게는 상기 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis) 1A 균주는 고추밭 근권 토양으로부터 저영양 배지를 이용해 분리, 동정한 것으로, 고추역병균인 파이토프소라 캡사이시 (Phytophthora capsici ), 고추탄저병균인 콜렉토트리키움 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 잿빛 곰팡이균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 시들음병균인 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 등과 같은 대표적인 식물 토양 전염병에 대하여 우수한 항균활성을 나타낸다.

상기 바실러스 발리스모르티스 1A 균주의 균주 분리는 통상의 방법으로 불가능하나 분리 후 그 증식은 통상의 방법으로 배양할 수 있다.

바람직하게는 상기 본 발명에 따른 바실러스 발리스모르티스 1A 균주는 고추 재배지역의 토양중 고추역병이 발생한 지역 토양에 있어서 역병에 걸리지 않은 고추작물의 근권 토양으로부터 분리한 균을 효모 추출물 0.5g, 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 0.5g, 카사미노산(casamino acid) 0.5g, 텍스트로스(dextrose) 0.5g, 가용성 녹말(soluble starch) 0.5g, 피르브산 나트륨(sodium pyruvate) 0.3g, 디칼륨인산염(dipotassium phosphate) 0.3g, 황산마그네슘(magnesium sulfate) 0.05g, 및 증류수(distilled water) 1000㎖를 포함하며 pH 7.0 내지 7.2로 조정된 저영양세균분리 배지인 R2A에 10^-1, 10^-2, 10^-3,10^-4배의 증류수로 희석한 배지를 사용하여 분리한 다양한 저영양세균들을 R2A 평판배지에서 배양한 후 고추역병균인 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici ), 고추탄저병균인 콜렉토트리키움 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 잿빛 곰팡이균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 시들음병균인 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 등에 대해 생육 저지 능력을 가진 균주를 선발하였다.

본 발명자들은 본 발명의 미생물 균주가 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis)에 속하는 균주임을 확인하고, 상기 균주를 바실러스 발 리스모르티스(Bacillus vallismortis) 1A라 명명하고, 상기 균주를 2007년 12월 13일자로 한국 농업미생물 자원센타에 기탁하여 기탁번호 KACC 91342P를 부여받았다.

본 발명자들은 본 발명의 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis) 1A 균주가 생산하는 항균 물질에 대한 항균 스펙트럼을 확인하기 위하여, 식물에서 심각한 병해를 일으키는 5종의 곰팡이를 지시균으로 시험관 내(in vitro) 항균성 검정을 수행하였다.

또한, 본 발명의 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis) 1A 균주가 생산하는 항균 물질의 고추역병균에 대한 특이적인 항균력을 검정하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 균주 분리

본 발명의 항진균 활성을 가지는 균주를 분리하기 위해 고추 재배지역의 토양중 고추역병이 발생한 지역 토양에 있어서 역병에 걸리지 않은 고추작물의 근권 토양을 대상으로 하였다.

고추작물의 근권 토양으로부터 시료를 채취하여 폴리에틸렌 비닐백(polyethylene vinyl bag)에 넣은 후 실험실로 운반하였다. 토양으로부터 효모 추출물(yeast extract) 0.5g, 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 0.5g, 카사미노산(casamino acid) 0.5g, 텍스트로스(dextrose) 0.5g, 가용성 녹말(soluble starch) 0.5g, 피르브산 나트륨(sodium pyruvate) 0.3g, 디칼륨인산 염(dipotassium phosphate) 0.3g, 황산마그네슘(magnesium sulfate) 0.05g, 및 증류수(distilled water) 1000㎖를 포함하며 pH 7.0 내지 7.2로 조정된 저영양세균분리 배지인 R2A에 10^-1, 10^-2, 10^-3,10^-4배의 증류수로 희석한 배지를 사용하여 분리한 다양한 저영양세균들을 R2A 평판배지에서 배양하였다. 이후 자라나는 균주에 대하여 식물토양병원균과 대치배양하여 여러 가지 병원균에 대한 항균력을 측정하였다. 그 중 고추역병균인 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici ), 고추탄저병균인 콜렉토트리키움 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 잿빛 곰팡이균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 시들음병균인 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum ) 등의 생육을 저지시키는 능력을 가진 균주를 도 1에 나타난 바와 같이 선발하였다.

도 1은 본 발명에 따른 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis)1A 균주의 식물병원균 억제 활성을 검정한 결과를 나타낸 사진이다.

시험예 1 : 1A 균주의 분류 및 동정

상기 실시예 1에서의 본 발명에 따른 저영양세균 바실러스 발리스모르티스 1A 균주를 동정하기 위하여 형태학적 생리학적 생화학적 특징을 조사한 후 세균학(Bergey's manual of systematic bacteriology)을 근거로 하여 1차적으로 동정하였다. 이어서 보다 확실한 동정을 위하여 바실러스 발리스모르티스 1A 균주의 16S rDNA의 분석을 기초로 하여 다른 종들과의 유연관계를 통한 2차 동정을 실시하였 다.

선발된 1A 균주를 동정하기 위해 그람염색법, 형태학적 관찰 및 생화학적 실험을 수행하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

이때 생화학적 실험은 미생물 동정 kit인 API20NE kit를 이용하여 세균학(Bergey's manual of systematic bacteriology) 준하여 동정하였다.

또한 선발된 1A 균주의 정확한 형태를 주사 전자 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

특징	Bacillus vallismortis 1A
형태적특징	간균
운동성	+
최적온도	28℃
그람염색	+
호기성	+
생리적 특징(API20NE kit)
질산칼륨(potassium nitrate)	+
L-트립토판(L-tryptophane)	-
D-글루코스(D-glucose)	-
L-아르기닌(L-arginine)	-
우레아(urea)	-
에스쿨린(esculin)	+
젤라틴(gelatin)	+
4-니트로페닐-D-갈락토피라노사이드 (4-nitrophenyl-D-galactopyranoside)	+
L-아라비노스(L-arabinose)	-
D-만노스(D-mannose)	+
N-아세틸-글루코사민 (N-acetyl-glucosamine)	+
D-만니톨(D-mannitol)	+
D-말토즈(D-maltose)	+
글르콘산칼륨(potassium gluconate)	+
카프프산(capric acid)	-
아디프산(adipic acid)	-
말산(malic acid)	+
구연산삼나트늄(trisodium citrate)	-
페닐아세트산(phenylacetic acid)	-

(상기 표 1에서 +: 양성반응, -: 음성반응)

상기 표 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 균주는 전형적인 바실러스(Bacillus)속 형태의 간균으로 대표적인 그람 양성이며, R2A 고체 배지상에서 점질성 집락을 형성하는 저영양세균으로 28℃가 최적 성장 온도이다.

정확한 속명을 확인하기 위하여 16S rDNA를 획득하여 염기서열을 확인하였다.

그 결과 Bacillus vallismortis와 99% 상동성을 가지고 있음을 확인하였다.

또한 다른 종들과의 유연관계를 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이 실시예 1에 따른 저영양세균 바실러스 발리스모르티스 1A 균주는 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis)와 매우 밀접한 관계를 나타내었다. 이같은 결과로부터 선별된 1A 균주를 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis)로 명명하고 농용미생물보존센터에 2007년 12월 13일자로 기탁번호 KACC 91342P로 기탁하였다.

시험예 2: 항균력 스펙트럼 검정

실시예 1에 따른 본 발명의 바실러스 발리스모르티스 1A 균주가 생산하는 균체 배양액에 대한 항균 스펙트럼을 확인하기 위하여, 식물에서 심각한 병해를 일으키는 다수의 곰팡이를 지시균으로 하여 고체배지에서 대치배양하여 저지대을 확인하는 방법으로 시험관 내(in vitro) 항균력 검정을 수행하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

저영양세균의 균주에 의한 곰팡이 성장 저해는 공팡이 성장 억제 결과로 야기된 저지대(clear zone)의 직경을 측정하고, 하기와 같은 기준으로 평가하였다.

+: 1 내지 2mm

++ : 3 내지 4mm

+++ : 5 내지 6mm

++++ : 7mm 이상

공시균주	저지대 활성도
공시균주	1A	8B
피토프토라 캠시시 (Phytophthora capsici)	++++	+
콜렉토트리키움 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides)	+++	-
보트리티스 시네리아 (Botrytis cinerea)	+++	+
푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)	+++	-
라이족토니어 솔라니 (Rhizoctonia solani)	++	-

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 바실러스 발리스모르티스 1A 균주 항균력은 고추탄저병균인 콜렉토트리키움 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 잿빛 곰팡이균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 시들음병균인 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 등에 항균활성을 보인 동시에 고추작물에 역병을 유발하는 고추역병균인 피토프토라 캠시시(Phytophthora capsici)의 생육을 강력하게 억제하는 항균활성을 보였다.

시험예 3 : 고추 유묘 검정을 통한 바실러스 발리스모르티스의 항균력 생성 검정

실시에 1에 따른 본 발명은 바실러스 발리스모르티스 1A 균주의 고추역병에 대한 항균력 활성을 검정하기 위하여 고추 유묘검정을 실시하였다.

온실에서 9주 정도 자란 고추유묘에 분리된 저영양 균주를 R2A액체 배지에 3일간 배양하여 10⁷cfu/㎖의 농도로 주당 5㎖씩 관주 접종 하였고, 2일후에는 고추역병 발병을 위해 역병포자(10⁵cfu/㎖)를 접종하여 발병정도를 조사하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 실시예 1에서의 본 발명에 따른 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis)1A 균주의 고추 유묘 검정 결과를 나타낸 그래프로, 도 4에서 1A는 실시예 1에 따른 바실러스 발리스모르티스 1A 균주를 나타내며, 8B는 비교균주 그리고 CON은 대조구(무처리)를 나타낸다.

도 4에 나타난 바와 같이, 비교균주(8B)와 무처리 시험구 에서는 고추역병균 접종후 10일부터 발병되기 시작하여 20일경에는 60%이상의 발병률을 보였으나 바실러스 발리스모르티스 1A(1A)는 25일 까지도 30%미만의 발병률을 보여 고추역병발병 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

이상, 본 발명을 바람직한 실시 예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시 예에 한정되지 않고, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

도 1은 실시예 1에 있어서의 본 발명에 따른 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis)1A 균주의 식물병원균 억제 활성을 검정한 결과를 나타낸 사진이다.

도 2는 실시예 1에서 선발된 본 발명에 따른 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis)1A 균주의 주사전자현미경 사진이다.

도 3은 실시예 1에서 선발된 본 발명에 따른 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis)1A 균주를 계통학적으로 분류한 분류도이다.

도 4는 실시예 1에서의 본 발명에 따른 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis)1A 균주의 고추 유묘 검정 결과를 나타낸 그래프이다.

Claims

식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 갖는 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis) 1A 균주(수탁번호 KACC 91342P).
제1항에 있어서,

상기 식물병원성 진균은 고추역병균(Phytophthora capsici), 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides), 잿빛곰팡이균(Botrytis cinerea) 및 시들음병균(Fusarium oxysporum)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis) 1A 균주(수탁번호 KACC 91342P).
제1항에 따른 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis) 1A 균주(수탁번호 KACC 91342P)의 배양액을 포함하는 고추역병 발생 억제제.
제1항에 따른 저영양세균 바실러스 발리스모르티스(Bacillus vallismortis) 1A 균주(수탁번호 KACC 91342P)의 배양액을 이용한 고추역병 발생 억제 방법.