CN102948336A

CN102948336A - 给番茄接种番茄黄化曲叶病毒的方法

Info

Publication number: CN102948336A
Application number: CN2012104509878A
Authority: CN
Inventors: 罗晨; 田兆丰; 刘伟成; 张帆; 卢向阳; 吴慧玲; 刘德文
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2012-11-12
Filing date: 2012-11-12
Publication date: 2013-03-06

Abstract

本发明公开了一种给番茄接种番茄黄化曲叶病毒的方法。本发明的给番茄接种番茄黄化曲叶病毒的方法，包括如下步骤：将生长至4片真叶的待鉴定番茄植株放入40目网袋内，一个网袋内放入一株所述待鉴定番茄植株，将带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱放入所述网袋内，每个所述网袋内放入6头所述带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱进行接种传毒，完成番茄黄化曲叶病毒的接种。本发明给生长至4片真叶的番茄植株以6头/株的虫口密度单株接种番茄黄化曲叶病毒，对番茄黄化曲叶病毒敏感的植株在接种1周后就发病，2周后发病率达100%。

Description

给番茄接种番茄黄化曲叶病毒的方法

技术领域

本发明涉及一种给番茄接种番茄黄化曲叶病毒的方法。

背景技术

番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）,属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒，因该属病毒在自然条件下只能由烟粉虱（Bemisia tabaci）以持久方式传播，又被称为粉虱传双生病毒。由于气候变暖和农业种植结构的改变，番茄黄化曲叶病毒的传毒介体烟粉虱近几年在北方地区大爆发，使得番茄黄化曲叶病毒近年来在我国各地空前爆发，自南向北迅速扩散和蔓延，给番茄生产造成严重危害。所以，番茄黄化曲叶病毒病的防治已是刻不容缓。抗病品种的应用是植物病毒病最有效防治措施之一，不同的番茄品种对病毒病的抗性程度不一，了解品种的抗、耐病程度，对现有品种的利用、抗性材料的筛选和抗病品种的选育都具有重要的意义。而给番茄接种番茄黄化曲叶病毒是鉴定选育番茄抗病品种的前提。

发明内容

本发明的目的是提供一种给番茄接种番茄黄化曲叶病毒的方法。

本发明所提供的给番茄接种番茄黄化曲叶病毒的方法，包括如下步骤：将生长至4片真叶的待鉴定番茄植株放入40目网袋内，一个网袋内放入一株所述待鉴定番茄植株，将带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱放入所述网袋内，每个所述网袋内放入6头所述带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱进行接种传毒，完成番茄黄化曲叶病毒的接种。

其中，所述方法在室内进行。

上述方法中，所述室内的温度可为25-27℃，空气的相对湿度可为50-60%，光照条件可为每天14小时光照10小时黑暗，所述光照的强度为9千勒克司。

实验证明，本发明给生长至4片真叶的番茄植株以6头/株的虫口密度单株接种番茄黄化曲叶病毒，对番茄黄化曲叶病毒敏感的植株在接种5-7天就初现发病症状，2周后发病率达100%。6头/株的虫口密度单株接种病毒，可以避免由于粉虱头数少接种后发病缓慢和发病率偏低以及粉虱头数多造成虫害的影响；4片真叶时进行烟粉虱接种病毒，可以避免由于幼苗太小，烟粉虱在植株上繁殖造成植株生长迟缓，影响病毒病的发展和症状的观察。番茄抗病材料的选育及其准确有效的抗性鉴定方法是番茄抗病育种的关键，此方法在人工控制的温湿度及设施条件下，采用烟粉虱接种侵染技术，使用大小均匀一致的番茄植株及单位植株上统一的虫口密度，应用发病时间、发病率及病情指数三项参数，结合PCR及ELISA两项检测指标，对不同番茄品种抗番茄黄化曲叶病毒的抗、耐病水平做了全面科学的评鉴，对抗性材料的筛选和抗病品种的选育具有科学的指导意义。

附图说明

图1为各番茄品种中病毒含量的ELISA检测结果。图示为每个品种的三次检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中的基本材料和方法如下：

1.TYLCV毒原及其保存

番茄毒原植株来源于北京房山区韩村河，经PCR检测鉴定为感染TYLCV。鉴定后的毒原植株移栽于直径为15cm的塑料盆内，在养苗笼中活体培养保存。（养苗笼：长40cm×宽40cm×高70cm的钢制框架，底层垫塑料板，四周及顶层罩以40目纱网，该养苗笼也作为养虫笼用于烟粉虱的饲养、同时也用于传毒后的番茄植株的培养）。

该番茄黄化曲叶病毒（周涛等.北京地区番茄黄化曲叶病毒病的鉴定及防治对策.植物保护.2010年第02期），公众可从野外采集，也可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。

2.Q型烟粉虱的饲养

Q型烟粉虱均采自房山韩村河，饲养于温室养虫笼内的棉花寄主上。饲养温度26±1℃，相对湿度50％～60％，光照周期每天14小时光照10小时黑暗。

该Q型烟粉虱（徐艳霞等.番茄黄化曲叶病毒对B型和Q型烟粉虱雌虫体长及卵大小的影响.中国蔬菜.2012年第10期），公众可从野外采集，也可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验。

3.带毒烟粉虱的获得

将棉花上饲养的Q型烟粉虱用捕虫器转移到保存有毒原植株的养苗笼内。在26℃、相对湿度50％～60％，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养3天，使原先不带毒的Q型烟粉虱感染TYLCV，同时经PCR检测鉴定确定Q型烟粉虱感染TYLCV，成为带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱。

4.番茄黄化曲叶病毒病的调查

番茄黄化曲叶病毒病的发病症状按严重程度划分为0、0.5、1、3、5、7、9共7个等级，分级标准为：

0级：不发病，无症状；

0.5级：新叶叶缘轻微黄化或轻花叶；

1级：新叶叶缘明显黄化，约1/3叶片黄化，叶变小；

3级：1/3-1/2叶片黄化，顶稍叶片进一步变小（约1/2正常叶），病株比健株矮约1/3；

5级：1/2-2/3叶片黄化，顶稍叶片变得更小（约1/3正常叶），病株比健株矮约1/2；

7级：整个植株叶片黄化、变小，病株比健株矮约1/2—3/4；

9级：植株枯死或接近枯死；

发病率及病情指数公式：

发病率=发病的植株数/调查总植株数×100％；

病情指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级数）×100。

5.PCR检测鉴定为感染TYLCV的方法如下：

首先提取番茄基因组总DNA或Q型烟粉虱的基因组总DNA作为PCR反应体系的模板；PCR引物序列为：TYLCV-R：5’-CCAATAAGG CGT AAG CGT GTA GAC-3'（序列1）；TYLCV-F：5’-ACG CAT GCC TCT AAT CCA GTG TA-3’（序列2），根据TYLCV基因组特异性保守序列设计；PCR反应程序：94℃ 2min；94℃ 30sec，55℃ 45sec，72℃ 30sec，共32个循环；72℃ 10min，4℃保存。反应完毕后，从PCR产物中取5μl，以1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统上观察结果，扩增的目标序列大小应为543bp，如得到543bp的条带，该番茄植株感染TYLCV。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、烟粉虱传毒时间（幼苗苗龄）的优化

以对番茄黄化曲叶病毒敏感的番茄品种仙客6号作为测试品种来确定烟粉虱传毒的最佳时间，具体的实验方法如下：

番茄种子播种于直径25cm的花盆中，待番茄第1片真叶长出时，移栽于直径约10cm的塑料杯内，并将其置于防虫网室内培养，以避免受烟粉虱或病毒的侵染，待生长至2片、3片、4片真叶时分别用于烟粉虱传毒实验。

将番茄小苗移栽于直径约10cm的塑料杯，缓苗5天左右，生长至2片、3片、4片真叶片时，每个处理挑选出20～30株生长状况良好，株高一致的植株，放入用于烟粉虱传毒的微型纱笼内（传毒微型纱笼：由40目尼龙纱网、皮筋等材料制作而成，做成袋子的形状，以罩住番茄幼苗，粉虱可以从袋子下部吹入，再通过皮筋扎紧），每个微型纱笼放入1株幼苗，再用捕虫器捕捉6头带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱吹入微型笼内，进行单株接种传毒，然后将传毒后的番茄幼苗放入养苗笼内用常规方法培养。详细观察和记录番茄幼苗的虫害症状及番茄黄化曲叶病毒病症状的出现时间和病情发展情况。同时设20株未经传毒处理的对照。

其中，整个传毒过程均在室内进行，室内的温度为25-27℃，空气的相对湿度为50-60%，光照条件为每天14小时光照10小时黑暗，光照的强度为9千勒克司。

结果表明，烟粉虱传毒给2片真叶的仙客6号幼苗时，2周后，仙客6号的发病率为100%，但有明显的虫害症状，植株生长不良；烟粉虱传毒给仙客6号3片真叶幼苗时，2周后，仙客6号的发病率为100%，但有轻微虫害症状，植株生长及病毒病症状部分受到虫害影响；烟粉虱传毒给仙客6号4片真叶幼苗时，2周后，仙客6号的发病率为100%，没有发现明显的虫害症状，呈现典型的番茄黄化曲叶病毒病症状。未经传毒处理的对照均生长正常，无虫害症状也无番茄黄化曲叶病毒病症状。

实施例2、烟粉虱传毒虫口密度的优化

以对番茄黄化曲叶病毒敏感的番茄品种仙客6号作为测试品种来确定烟粉虱传毒的最佳虫口密度，具体的实验方法如下：

1、人工接种带毒烟粉虱于番茄幼苗

番茄种子播种于直径25cm的花盆中，待番茄第1片真叶张出时，按品种划分，分别移栽于直径约10cm的塑料杯内，并将其置于防虫网室内培养，以避免受烟粉虱或病毒的侵染，待生长至4片真叶时用于烟粉虱传毒实验。

将番茄小苗移栽于直径约10cm的塑料杯，缓苗5天左右，生长至4片真叶片时，挑选出100株生长状况良好，株高一致的植株，放入用于烟粉虱传毒的微型纱笼内（传毒微型纱笼：由40目尼龙纱网、皮筋等材料制作而成，做成袋子的形状，以罩住番茄幼苗，粉虱可以从袋子下部吹入，再通过皮筋扎紧），每个微型纱笼放入1株幼苗，再用捕虫器捕捉带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱吹入微型笼内，进行单株接种传毒。将这100株幼苗（每株幼苗的总叶面积为8平方厘米）分为5个处理，每个处理均为25株。处理1中，每个微型纱笼均分别吹入2头带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱；处理2中，每个微型纱笼均分别吹入4头带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱；处理3中，每个微型纱笼均分别吹入6头带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱；处理4中，每个微型纱笼均分别吹入8头带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱；处理5为未经传毒处理的对照，每个微型纱笼均不吹入烟粉虱。

传毒后，将番茄幼苗放入养苗笼内用常规方法培养。详细观察和记录番茄幼苗的烟粉虱虫害症状和番茄黄化曲叶病毒病症状的出现时间和病情发展情况。

结果表明，处理1，当使用2头烟粉虱传毒给4片真叶的仙客6号幼苗时，2周后，仙客6号的发病率较低，仅为50%，没有可见的虫害症状；处理2，当使用4头烟粉虱传毒给4片真叶的仙客6号幼苗时，2周后，仙客6号的发病率也较低，仅为75%，没有明显的虫害症状；处理3，当使用6头烟粉虱传毒给4片真叶的仙客6号幼苗时，2周后，仙客6号的发病率为100%，没有发现明显的虫害症状，不影响病毒病病级的判断；处理4，当使用8头烟粉虱传毒给4片真叶的仙客6号幼苗时，2周后，仙客6号的发病率为100%，但有较明显的虫害症状发生，此时虫害症状已经可以影响到病毒病病级的判断。未经传毒处理的对照均生长正常，无虫害症状也无番茄黄化曲叶病毒病症状。

实施例3、给番茄接种番茄黄化曲叶病毒鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒的抗性

1.基本材料和方法

1.1番茄品种及其幼苗培育

如表1所示，包括仙客6号、金棚1号等13个番茄品种，番茄品种来自北京市农林科学院蔬菜研究中心；

1.2烟粉虱传毒（人工接种带毒烟粉虱于番茄幼苗）

每个番茄品种挑选出30株生长状况良好，株高一致的4片真叶植株，放入用于烟粉虱传毒的微型纱笼内（传毒微型纱笼：由40目尼龙纱网、皮筋等材料制作而成，做成袋子的形状，以罩住番茄幼苗，粉虱可以从袋子下部吹入，再通过皮筋扎紧），每个微型纱笼放入1株幼苗，再用捕虫器捕捉6头带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱吹入微型笼内，进行单株接种传毒。然后将传毒后的番茄幼苗按品种分类，放入养苗笼内用常规方法培养。详细观察和记录番茄幼苗病毒病症状的出现时间和病情发展情况，同时定期进行番茄黄化曲叶病毒的PCR检测。

1.3番茄病毒病的调查与分析

番茄传毒后，定期观察不同番茄品种的初发病时间及病情发展情况，人工接种传毒较田间自然传毒发病快，感病品种在传毒1周后个别植株表现出极其轻微发病症状。分别在传毒1、2、3周后进行PCR检测，并在2周、3周后调查发病率及症状病级，计算其病情指数，同时在3周后对番茄各品种进行病毒含量水平的ELISA检测,确定TYLCV在不同品种中增值情况的差异。

1.4番茄黄化曲叶病毒病的PCR检测

烟粉虱接种传毒1周后，感病品种通常已经开始显现很轻微的发病症状。所以，分别在传毒1、2、3周后，各品种中随机选择5株，进行PCR检测，确定病毒对不同品种感染时间的相对差距，以此判断不同品种对TYLCV的易感性。

1.5ELISA对番茄黄化曲叶病毒的定量检测

烟粉虱传毒3周后，番茄开始开花坐果，株高已接近养苗笼顶部，不同番茄品种的病情发展及差异已经十分明显，这时对不同番茄品种进行病毒含量水平的ELISA检测,确定TYLCV在不同品种中增值的差异，作为判断番茄抗、耐病程度的指标之一。

ELISA采用三抗体夹心检测法（TAS-ELISA）。检测的具体步骤参照安德珍生物技术(北京)有限公司ELISA试剂盒提供的步骤进行。结果使用酶联检测仪在405nm光度下读取吸光值OD405，吸光值OD405的大小可反映不同品种的病毒含量水平（见图1）。

2结果与分析

2.1病毒的PCR检测及番茄病情发展调查

对13个番茄品种进行了烟粉虱室内人工接种传毒试验，传毒时间是番茄幼苗4片真叶时，烟粉虱接种6头/株。人工接种后感病品种在传毒1周后就表现出轻微发病症状。采用定期观察的方式，对各番茄品种的发病时间和发病病级进行了详细记录，计算其发病率及病情指数。同时采集各品种样品，针对番茄黄化曲叶病毒进行PCR分子鉴定，传毒后不同时间进行的PCR检测及病情调查综合结果见表1。

表1不同番茄品种病情调查及PCR检测结果

传毒1周后，每周对试验番茄品种进行了PCR跟踪检测，结果表明，尽管所有试验品种在传毒3周后都有病毒感染，但不同品种的初感染时间不同。易感品种的初感染病毒的时间较早，较抗病的品种初感染病毒的时间较晚，不同番茄品种感染病毒的PCR检测结果详见表1。表1中，PCR检测样品为5个植株的混合样品；.“…”表示发病率或病情指数没有进一步发展；“+”表示得到543bp的PCR条带，“-”表示未得到543bp的PCR条带。

病情指数反应了植株发病的严重程度，是反应不同番茄品种耐、抗病性的重要指标。烟粉虱传毒2、3周后分别进行两次发病率及病级调查，计算发病率及病情指数；结果发现不同品种间发病率和病情指数不一定呈正相关，如抗病性较好品种欧冠粉色虽然发病率较高，但病情发展慢，最终病情指数低于发病率较低的浙粉702，所以，从最终病情指数的高低来考虑，欧冠粉色的抗病性高于浙粉702。

2.2ELISA检测各番茄品种资源的带毒量

采用三抗体夹心ELISA检测技术，对各番茄品种的病毒增值水平进行了测定。ELISA检测的吸光值OD405与番茄各品种的病毒含量水平相对应，图1可以直观反应不同番茄品种中病毒的相对含量。图1中，阳性对照样为感染TYLCV的烟粉虱;阴性对照为未感染TYLCV的番茄植株。

如图1可见，仙客6号、金棚1号病毒含量最高，可见病毒在这两个品种的植株中增值量最大，结合之前的病情调查结果表明，这两个品种为较典型的感病品种；其次是迪粉尼，其病毒增殖的量也较高；DRK599、埃特串收83病毒增值的量中等；其他各番茄品种带毒量都很低。在此要说明的是，除个别品种，如埃特串收83外，病毒在植株内增值的量的水平和病毒病症状的严重性基本呈正相关，所以，ELISA检测的病毒含量水平是番茄对TYLCV抗性水平的重要指标之一。

PCR检测的灵敏度很高，可以在病毒感染初期检测到病毒的侵染，从而确定不同番茄品种对TYLCV的易感程度；ELISA的灵敏度则较差，但能对病毒增值水平进行定量，从而根据病毒含量判断不同番茄品种对TYLCV的抗、耐病性的强弱；经PCR检测病毒的初感染时间和病毒病症状的进一步发展有较强的正相关，这点在感病品种金棚1号、仙客6号上有明显表现；但从抗病品种来看，不同品种有不同表现，有的品种初感染时间早，但病情发展却很缓慢，而且后期病情不再发展（如抗病品种DRK599），还有的品种如红罗曼2号，虽然后期检测到病毒侵染，但却一直未表现发病症状，属于健康带毒；同样，ELISA测定的病毒含量水平和病毒病症状严重性在感病品种上呈正相关，而在抗病品种上表现不一致，如埃特串收83带毒量虽然高于浙粉701、浙粉702，但其症状（病情指数）却明显轻于后者，表明前者有很好的耐病性。

Claims

1.给番茄接种番茄黄化曲叶病毒的方法，包括如下步骤：将生长至4片真叶的待鉴定番茄植株放入40目网袋内，一个网袋内放入一株所述待鉴定番茄植株，将带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱放入所述网袋内，每个所述网袋内放入6头所述带番茄黄化曲叶病毒的Q型烟粉虱进行接种传毒，完成番茄黄化曲叶病毒的接种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法在室内进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述室内的温度为25-27℃，空气的相对湿度为50-60%，光照条件为每天14小时光照10小时黑暗，所述光照的强度为9千勒克司。

4.权利要求1-3中任一所述的方法在鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒的抗性中的应用。