CN111057741A - 一种猕猴桃对溃疡病抗性的鉴定方法 - Google Patents

一种猕猴桃对溃疡病抗性的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猕猴桃对溃疡病抗性的鉴定方法，涉及农业栽培技术领域，该方法包括以下步骤：首先制备接菌器官，在春季将猕猴桃不同种类品种一年生嫁接苗盆栽，新梢长至3‑6个月后，选择完全木质化的新梢节间作为接种器官；然后进行菌株活化和定量，之后将活化后的细菌悬浮液穿刺接入接种器官，20天后在发病部位剖去长度为15mm、宽5mm的韧皮部，测量发病病斑纵径大小，并做差异显著性分析；本发明提供的方法具有操作简便、鉴定快速、结果准确等特点。

Description

一种猕猴桃对溃疡病抗性的鉴定方法
技术领域
本发明涉及农业栽培技术领域，尤其涉及的是一种猕猴桃对溃疡病抗性的鉴定方法。
背景技术
猕猴桃细菌性溃疡病(kiwifruit bacterial canker)是一种由丁香假单胞菌猕猴桃致病种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)引起的毁灭性病害，严重威胁猕猴桃生产发展。其发生范围广、传播快、致病性强、防治难度大，可在短期内造成大面积树体死亡，已被列为我国森林植物检疫性病害。该病于1989年在日本静冈首次发现并鉴定其病原物，目前已在美国、日本、法国，新西兰，韩国、伊朗、意大利、葡萄牙及智利等国，及我国陕西、安徽、重庆、四川、湖北、湖南、河南和河北等省市发生，给世界猕猴桃产业造成了严重的经济损失。
自2008年以来，猕猴桃溃疡病突然在新西兰、意大利、中国、智利等猕猴桃主要生产大国大规模爆发，主要为害‘Hort16A’、‘红阳’等具有重要经济价值的品种。以新西兰为例，2010年11月出现严重危害，截至2013年2月20日，已有2073个猕猴桃园确认感染了致病力最强的溃疡病病原菌PSA-V，约占新西兰猕猴桃园总面积的70％；受溃疡病的影响，2012年新西兰猕猴桃出口量从2011年的41.47万吨降至32.40万吨，同比减少21％；2013-2014年猕猴桃出口量将进一步减少。该病害在我国陕西、四川、贵州等猕猴桃主产区普遍发生，不同地域、海拔、栽培品种的果园均可能感染，病株率普遍达到20％左右，感染严重的果园达到70％以上，很多果园因死树率过高而导致毁园，损失惨重。
目前，猕猴桃溃疡病的感染范围正逐渐扩大，其远距离传播主要通过苗木、接穗的引种，对于该病的侵染原理、流行规律、快速鉴定及防治等方面研究，虽然取得一些进展，但由于此病害流行迅速、难以防控、危害巨大，选择抗性种质资源、培育抗病品种显得尤为重要。然而，对于猕猴桃对溃疡病抗性的鉴定技术及其应用，国内外迄今尚未见报道。
新西兰学者初步研究表明，‘红阳’感病率最高，‘Hort16A’、‘Gold3’、‘Gold9’、‘海沃德’的感病率逐渐降低，‘Green14’的抗病性最好。在我国，张学武等(2000年)研究表明，‘秦美’溃疡病发病最严重，而‘秦香’、‘秦翠’发病率很低；李淼等(2004年)对安徽省内主栽的7个猕猴桃品种进行溃疡病的抗性研究，发现‘金魁’与‘魁蜜’为抗病的品种，‘早鲜’、‘华美2号’、‘海沃德’中感，‘秦美’、‘金丰’最感病；申哲、高小宁等(2009-2011年)分别对陕西省不同品种猕猴桃溃疡病的发生率进行研究表明，‘红阳’感病率最高，‘海沃德’、‘亚特’及‘秦美’感病率依次降低，‘徐香’抗性较强。
但是，由于上述各项研究主要通过田间抗性实际调查方法，采用的操作和统计方法存在差异，且植株的生长环境，园区管理程度不同，因此，还无法对猕猴桃各个品种资源的抗溃疡病的能力做出系统与客观的评价。另外，国内外对猕猴桃品种抗病机理研究较少，基于猕猴桃抗病的形态学、细胞学及生理生化等特征虽有研究报道，目前尚不能用于品种资源的抗性准确鉴定。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种猕猴桃对溃疡病抗性的鉴定方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种猕猴桃对溃疡病抗性的鉴定方法，该方法包括以下步骤：
步骤1、制备接菌器官
在春季时将猕猴桃不同种类品种一年生嫁接苗进行盆栽，当新梢生长至3-6个月时，选择完全木质化的新梢节间作为猕猴桃溃疡病菌的接种器官，每个新梢节选定3-5个接种点
步骤2、菌株活化定量
菌株活化：将猕猴桃溃疡病菌的菌株置于-80℃冰箱长久保存，接种前取出部分-80℃保存的菌种，置于液体KB培养基中，25℃活化48小时，获得活化后的菌液，然后取部分活化后的菌液接种于固体KB培养基斜面，25℃培养，48小时，4℃保存，获得准备液；其余活化后的菌液加入甘油置于-80℃留作备份
菌株定量：调整准备液的浓度至108CFU/mL，获得接种细菌悬浮液
步骤3、接种
用洁净的牙签，蘸取约2μL的细菌悬浮液，穿刺嫁接苗新梢第二、三、四节间，深达木质部，单盆小区，三次重复，清水对照；各品种盆栽苗顺序排列，置于温度20℃、相对湿度90％的人工气候室培养；接种后一周，开始观察其发病情况
步骤4、鉴定抗性
接菌20天后，在发病部位剥去长约15mm、宽约5mm的韧皮部，用游标卡尺测量每个品种各接种点发病病斑纵径大小，并对数据做差异显著性分析；新梢病斑纵径越大，表示该品种对猕猴桃溃疡病抗性越弱。
进一步，步骤2中还包括为保证菌种活性，在试验期间4℃保存的菌液需每两周更新一次；步骤2所有的操作均需在超净工作台中完成。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明在对猕猴桃溃疡病致病菌株分离培养、类型快速鉴别基础上，研究确定了猕猴桃对溃疡病抗性鉴定的“接菌器官、菌株活化定量、接种方法与评价依据”等指标，形成了一套完整系统的技术。
附图说明
图1猕猴桃品种各接种点发病病斑纵径大小对比图；图中1-28，猕猴桃不同种类品种；CK1-CK4，清水对照。
图2为猕猴桃品种接种病斑纵径大小差异显著性分析图；图中不同小写字母表示差异达到显著水平(α＝0.05)
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书中的术语“包括”，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤的方法不必限于清楚地列出的那些步骤，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些方法固有的其它步骤。在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考实施例来详细说明本申请。
1、接菌器官
春季将猕猴桃不同种类品种一年生嫁接苗进行盆栽，当新梢生长至3-6个月时，选择完全木质化的新梢节间，作为猕猴桃溃疡病菌的接种器官，每个新梢选定3-5个接种点。
2、菌株活化定量
(1)菌株活化：将分离得到的菌株JF8(本次使用的菌株由安徽农业大学果树学重点实验室提供，由安徽省岳西县‘金丰’猕猴桃园分离得到)置于-80℃冰箱长久保存，接种前取少量-80℃保存的菌种，置于适量液体KB培养基中，25℃活化48小时，取适量菌液接种于固体KB培养基斜面，25℃培养，48小时，4℃保存备用，获得准备液；其余菌液加入甘油置于-80℃留作备份。为保证菌种活性，在试验期间4℃保存的菌液需每两周更新一次。以上操作均需在超净工作台中完成。
(2)菌株定量：调整准备液浓度为108CFU/mL，每个接种点接菌2μL。
3、接种方法
用洁净的牙签，蘸取约2μL的细菌悬浮液，穿刺嫁接苗新梢第二、三、四节间，深达木质部，单盆小区，三次重复，清水对照；各品种盆栽苗顺序排列，置于温度20℃、相对湿度90％的人工气候室培养；接种后一周，开始观察其发病情况。
4、评价依据
接菌20天后，在发病部位剥去长约15mm、宽约5mm的韧皮部，用游标卡尺测量每个品种各接种点发病病斑纵径大小其结果如表1和图1，统计数据并对数据做差异显著性分析(图2)；新梢病斑纵径越大，表示该品种对猕猴桃溃疡病抗性越弱。
接菌20天后猕猴桃种类品种病斑纵径大小
Figure BDA0002349225350000041
表1
实际应用结果发现，软枣猕猴桃对溃疡病抗病能力最强、毛花猕猴桃次之、中华猕猴桃抗性较弱、种间杂种抗性介于亲本之间；中华猕猴桃原变种与美味变种中，均存在抗病能力相对较强及较弱的品种；鉴定结果与品种田间实际抗性表现基本一致(表1)。与现有技术相比，该技术具有操作简便、鉴定快速、结果准确等特点。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
本发明不限于以上对实施例的描述，本领域技术人员根据本发明揭示的内容，在本发明基础上不必经过创造性劳动所进行的改进和修改，都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种猕猴桃对溃疡病抗性的鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1、制备接菌器官
在春季时将猕猴桃不同种类品种一年生嫁接苗进行盆栽，当新梢生长至3-6个月时，选择完全木质化的新梢节间作为猕猴桃溃疡病菌的接种器官，每个新梢节选定3-5个接种点
步骤2、菌株活化定量
菌株活化：将猕猴桃溃疡病菌的菌株置于-80℃冰箱长久保存，接种前取出部分-80℃保存的菌种，置于液体KB培养基中，25℃活化48小时，获得活化后的菌液，然后取部分活化后的菌液接种于固体KB培养基斜面，25℃培养，48小时，4℃保存，获得准备液；其余活化后的菌液加入甘油置于-80℃留作备份
菌株定量：调整准备液的浓度至108CFU/mL，获得接种细菌悬浮液
步骤3、接种
用洁净的牙签，蘸取约2μL的细菌悬浮液，穿刺嫁接苗新梢第二、三、四节间，深达木质部，单盆小区，三次重复，清水对照；各品种盆栽苗顺序排列，置于温度20℃、相对湿度90％的人工气候室培养；接种后一周，开始观察其发病情况
步骤4、鉴定抗性
接菌20天后，在发病部位剥去长约15mm、宽约5mm的韧皮部，用游标卡尺测量每个品种各接种点发病病斑纵径大小，并对数据做差异显著性分析；新梢病斑纵径越大，表示该品种对猕猴桃溃疡病抗性越弱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中还包括为保证菌种活性，在试验期间4℃保存的菌液需每两周更新一次；步骤2所有的操作均需在超净工作台中完成。
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