WO2018155813A2

WO2018155813A2 - 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 용균력을 가지는 신규한 항균단백질 efal-2

Info

Publication number: WO2018155813A2
Application number: PCT/KR2018/000510
Authority: WO
Inventors: 윤성준; 강명수; 전수연; 김종현; 정기모; 손지수; 백형록; 강상현
Original assignee: 주식회사 인트론바이오테크놀로지
Priority date: 2017-02-22
Filing date: 2018-01-11
Publication date: 2018-08-30
Also published as: US11492378B2; WO2018155813A3; CN110621690A; US20200055902A1; EP3587441B9; EP3587441B1; US20210070809A1; KR20180096921A; KR101957266B1; EP3587441A4; EP3587441A2

Abstract

본 발명은 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP)로부터 유래한 항균단백질 EFAL-2, 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 및 이 약학적 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

엔테로코쿠스 패슘에 대하여 용균력을 가지는 신규한 항균단백질 EFAL-2

본 발명은 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 용균력을 가지는 항균단백질 및 이를 유효성분으로 포함한 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘 감염을 예방 또는 처치하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP)의 유전정보를 이용하여 개발된 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 항균단백질 EFAL-2, 상기 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 및 이 약학적 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘의 감염 예방 또는 감염 처치 방법에 관한 것이다.

장알균(Enterococcus; Enterococci)은 위장관과 비뇨생식계에 상재하는 통성혐기성 그람양성 알균이다. 장알균 속(Genus)에는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium), 엔테로코쿠스 두란스(Enterococcus durans), 엔테로코쿠스 카쎄리프라부스(Enterococcus casseliflavus)를 포함하여 약 19가지 종(Species)이 보고되고 있으며, 이 중에 실제 감염을 일으키는 주요 균종으로는 엔테로코쿠스 패칼리스와 엔테로코쿠스 패슘을 제시할 수 있다. 과거에는 엔테로코쿠스 패칼리스에 의한 감염이 매우 흔하였지만 최근에는 엔테로코쿠스 패슘에 의한 감염이 상대적으로 늘고 있다.

장알균은 비교적 독성이 약하여 정상인에서는 질병을 일으키지 않으나 노인이나 면역저하 환자, 만성 기저질환자 또는 병원에 입원중인 환자에서는 요로감염, 창상감염, 균혈증, 심내막염 등의 각종 기회감염증을 유발한다. 또한, 장알균은 외부로부터 유전자 교잡을 통하여 병독인자(Virulence factor)를 획득하여 감염성 질환(Infectious disease)을 유발할 수도 있다. 장알균에 의한 감염증 중에 요로감염이 가장 빈번하며, 그 다음으로 창상감염이 흔하다. 장알균에 의한 그 밖의 주요감염으로 심내막염을 제시할 수 있는데, 세균성 심내막염의 5-20%가 장알균에 의한 것이다.

한편, 일반적으로 장알균 처치에 사용되는 항생제로는 아미노글리코사이드(aminoglycosides), 세팔로스포린(cephalosporins), 클린다마이신(clindamycin) 및 반합성 페니실린제제들이 사용되나, 이들 항생제에 대한 내성균 발생이 자주 보고 되고 있다. 장알균은 새로운 DNA(플라스미드, Transposons)를 얻거나, 돌연변이를 이용하여 항생제 내성을 획득한다고 알려져 있다. 특히 아미노글리코사이드에 대한 내성을 획득한 장알균이 심내막염이나 중증 감염을 일으킨 경우에는 이 장알균을 살균할 수 없기 때문에 치료에 성공하기 어렵다. 반코마이신 내성 장알균(Vancomycin-resistance enterococci, VRE)에 원인한 균혈증이 있는 경우는 사망률이 67%에 달하는 것으로 보고되고 있다. 1986년 프랑스에서 처음으로 반코마이신에 내성을 보이는 VRE가 보고되었고 국내에서는 1992년에 VRE가 처음으로 분리되었다. 미국의 경우, 1988년 처음으로 VRE가 분리된 이래, NNIS(National Nosocomial Infection Surveillance)의 자료에 따르면 1990-1997년 사이에 분리된 엔테로코쿠스 중 1-15%가 VRE였으며 1999년 25%, 2003년 28.5%로 증가되고 있는 추세이다. 최근에는 유럽, 미국 뿐 아니라 한국을 포함한 아시아 및 오세아니아를 비롯하여 전 세계적으로 VRE의 출현이 증가하고 있다. 이에 따라 항생제 내성 장알균 감염 예방 또는 치료에 활용할 수 있는 약제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

최근 세균성 감염질환의 대처 방안으로 박테리오파지(Bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 항생제 내성균에 대한 우수한 항균력 때문에 더욱 큰 관심을 받고 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(Phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 세균에 감염(Infection)한 후 세균의 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 세균 밖으로 나올 때 숙주인 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 세균을 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 세균 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 세균에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 세균에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 항균효과를 제공할 수 있다.

이러한 비교적 좁은 항균범위의 극복 방안으로 박테리오파지가 세균에 대하여 항균효과를 발휘할 때 실제로 작용하는 항균단백질을 이용하는 방안이 제안되고 있다. 박테리오파지 유래의 항균단백질을 리신(Lysin) 또는 엔도리신(Endolysin) 등의 이름으로 부른다. 일반적으로 박테리오파지 유래의 항균단백질은 그 모체가 되는 박테리오파지에 비교하여 보다 넓은 항균범위를 제공할 수 있다.

박테리오파지나 박테리오파지로부터 유래한 항균단백질은 통상의 항생제들에 비교하여 작용하는 세균 종에 대한 특이성이 높다. 즉, 목적하는 세균 종 외에 다른 세균 종에는 영향을 주지 않는다. 이러한 박테리오파지 및 박테리오파지 유래 항균단백질의 세균 특이성은 목적으로 하는 세균에 대해서만 항균효과(용균력)를 제공하고 환경이나 동물 내의 상재균들에게는 영향을 초래하지 않는다. 통상적으로 세균 처치에 널리 활용되던 기존의 항생제들은 여러 종류의 세균들에 대하여 동시에 영향을 끼쳤다. 이로 인하여 환경오염이나 동물의 정상 세균총 교란 등의 문제를 초래하였다. 이와는 달리 박테리오파지나 박테리오파지 유래 항균단백질은 특정 세균에 대해서만 작동하므로 박테리오파지나 박테리오파지 유래 항균단백질의 사용에 의해서 체내 정상균총 교란 등이 발생하지 않는다. 따라서 박테리오파지나 박테리오파지 유래 항균단백질 사용이 항생제 사용에 비교하여 매우 안전하다고 할 수 있고, 그 만큼 사용에 의한 부작용 초래 가능성이 상대적으로 크게 낮다.

이에, 본 발명자들은 본 발명자들에 의해 분리된 박테리오파지의 유전정보를 활용하여 유해 병원성 박테리아인 장알균 중에 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 항균단백질을 제공하고, 더 나아가 이를 활용하여 개발한 항균단백질을 유효성분으로 포함하고 있고 엔테로코쿠스 패슘 균의 감염을 예방 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 약학적 조성물을 제공하고, 이 약학적 조성물을 활용한 엔테로코쿠스 패슘 균의 감염 예방 또는 처치에 효과적으로 활용될 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

따라서 본 발명의 목적은 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP)의 유전정보를 활용하여 개발된 항균단백질 EFAL-2를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP) 유래의 항균단백질 EFAL-2를 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 박테리오파지 Ent-FAP-4 유래의 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는, 엔테로코쿠스 패슘 감염 예방 또는 처치 목적의 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 박테리오파지 Ent-FAP-4 유래의 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘의 감염을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 박테리오파지 Ent-FAP-4 유래의 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘의 감염을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 발명자들은 본 발명의 상기 목적들을 달성하고자 본 발명자들에 의해 분리되었던 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP)의 유전 정보를 활용하여 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 우수한 용균력을 갖는 항균단백질 EFAL-2를 개발하고, 더 나아가 이를 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 개발하고, 마지막으로 이를 유효성분으로 하는 엔테로코쿠스 패슘 감염에 대한 예방 또는 치료 목적으로 활용될 수 있는 약학적 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 용균력을 갖는 항균단백질 EFAL-2의 아미노산 서열을 제공한다. 구체적으로는 상기 항균단백질 EFAL-2는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 유전자는 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 염기 서열을 가진다. 이 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 항균단백질 EFAL-2는 324개의 아미노산으로 구성되며 분자량은 약 35.7 kDa이다.

서열번호 2로 제시한 아미노산 서열은 당업자에 의해 공지의 기술을 이용하여 일부 변형될 수 있음은 자명하다. 이러한 변형에는 아미노산 서열의 일부 치환, 아미노산 서열의 일부 첨가, 및 아미노산 서열의 일부 결실을 포함한다. 그렇지만 본 발명에서 개시하고 있는 서열번호 2의 아미노산 서열을 준용하는 것이 가장 바람직하다.

본 명세서에서 사용된 "유전자"라는 용어는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 유전자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Chemical Reviews 90:543-584, 1990).

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 항균단백질 EFAL-2의 생산에 이용될 수 있는 형질전환 대장균 균주인 대장균 TOP10-pBAD-EFAL-2를 제공한다. 이 대장균 TOP10-pBAD-EFAL-2는 본 발명자들에 의해 개발되어 2016년 12월 27일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 13177BP).

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고 엔테로코쿠스 패슘에 대한 용균력을 갖는 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는, 엔테로코쿠스 패슘의 감염 예방 또는 감염 후 치료에 효과적으로 활용될 수 있는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물의 예로는 소독제나 항생제를 제시할 수 있으나 이에 국한되지 않음은 자명하다.

본 발명의 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 포함되는, 본 발명의 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 항균단백질 EFAL-2는 엔테로코쿠스 패슘에 대한 용균력을 가지므로, 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 요로감염, 창상감염, 균혈증, 심내막염 등의 질병의 예방(감염 방지) 또는 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 또는 치료 목적으로 활용될 수 있다. 본 명세서에서의 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환은 요로감염, 창상감염, 균혈증, 심내막염 등을 총칭한다.

본 명세서에서의 엔테로코쿠스 패슘은 기존 항생제에 대하여 민감하든지 또는 기존 항생제에 대하여 내성을 가진 내성균이든지 상관이 없다. 즉, 기존 항생제에 대한 내성 획득 여부는 상관이 없다.

본 명세서에서 사용된 “방지” 또는 “예방”이라는 용어는 (i) 엔테로코쿠스 패슘 감염의 방지; 및 (ii) 엔테로코쿠스 패슘 감염에 의한 질병으로의 발전을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (i) 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ii) 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발된 질환의 병적상태를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 유효성분으로서 본 발명의 항균단백질 EFAL-2를 0.0001-10% (w/v 또는 w/w) 포함하며, 바람직하게는 0.001-1% (w/v 또는 w/w), 가장 바람직하게는 0.1% (w/v 또는 w/w)를 포함한다.

본 발명의 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만, 소독제나 항생제로 구현될 수 있다. 본 명세서에 있어서, '항생제’라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.

이러한 활용 목적에서의 효율성을 높이기 위하여 다른 세균종에 대하여 항균활성을 제공할 수 있는 항균물질들이 본 발명의 약학적 조성물에 추가될 수 있다. 또한, 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 항균활성을 갖는 다른 종류의 박테리오파지유래의 항균단백질(엔도리신)들도 추가될 수 있다. 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 항균활성을 갖는 박테리오파지 유래의 항균단백질이라 하더라도 항균력의 세기나 발휘 양태에 있어 서로 간에 차이가 있으므로 이들의 적절한 조합은 그 효과를 극대화 할 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP) 유래의 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이용한 엔테로코쿠스 패슘의 감염 예방 또는 치료 방법은 기존의 항생제 등에 기반을 둔 방식에 비하여 엔테로코쿠스 패슘에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 엔테로코쿠스 패슘의 감염 예방 또는 치료 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다는 것을 의미한다. 통상적으로 항생제 등을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 사용에 따른 다양한 부작용이 나타난다.

도 1은 박테리오파지 Ent-FAP-4의 전자현미경 사진이다.

도 2는 항균단백질 EFAL-2의 분리정제 과정을 보여주는 전기영동 사진으로서, 레인 M은 단백질 크기 마커이고, 레인 1은 정제 전 시료이고, 레인 2는 정제 시의 크로마토그라피 통과액이고, 레인 3부터 레인 9는 정제 분획이다.

도 3은 항균단백질 EFAL-2의 엔테로코쿠스 패슘에 대한 항균활성(용균활성)을 보여주는 결과로서, 투명한 부분은 항균단백질 EFAL-2의 항균활성(용균활성)에 의해 생성된 것이다.

도 4는 탁도 감소 조사법(Turbidity reduction assay)의 실험 결과를 보여주는 결과이다. 음성대조는 항균단백질 EFAL-2를 포함하지 않은 완충액 자체이다. 가로축은 시간(분)이고 세로축은 600 nm에서의 흡광도이다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리

엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 선별에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 엔테로코쿠스 패슘은 본 발명자들에 의해 미리 분리되어 엔테로코쿠스 패슘으로 동정(Identification)된 것이다.

박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 엔테로코쿠스 패슘을 1/1000 비율로 접종한 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L)에 수집된 시료를 함께 첨가한 다음 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 엔테로코쿠스 패슘을 1/1000 비율로 접종한 다음에 37℃에서 3-4시간동안 또 다시 진탕배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우 박테리오파지의 수(Titer)가 충분히 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 5회 반복 실시 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액에 대하여 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 이렇게 하여 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(Spot assay)을 통하여 엔테로코쿠스 패슘을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.

상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. TSB 배지에 엔테로코쿠스 패슘을 1/1000 비율로 접종한 다음에 37℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 엔테로코쿠스 패슘의 배양액 3 ml(OD₆₀₀이 1.5)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(Spreading)하였다. 도말한 평판배지를 클린벤치(Clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후에 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 엔테로코쿠스 패슘이 도말된 평판배지 위에 점적하였다. 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판배지를 37℃에서 하루 동안 정치 배양한 다음에 여과액이 떨어진 위치에 투명환(Clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 엔테로코쿠스 패슘을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 엔테로코쿠스 패슘에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.

엔테로코쿠스 패슘에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(Plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음에 이를 엔테로코쿠스 패슘 배양액에 첨가해 주어 4-5 시간 동안 37℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 엔테로코쿠스 패슘 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 37℃에서 4-5 시간 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음에 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회만으로는 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 반복 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복 수행하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경 분석을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 분석에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 설명한 과정을 반복하였다. 전자현미경 분석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(Copper grid)에 묻히고 2% 유라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(Negative staining)과 건조를 수행한 후 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 관찰하였다. 순수 분리한 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때 신규 확보된 박테리오파지는 시포비리대(Siphoviridae) 박테리오파지에 속함을 확인할 수 있었다.

이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액에 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 엔테로코쿠스 패슘 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 4-5 시간 동안 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음에 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ml에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO₄, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ㎖로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.

상기 과정을 통하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Ent-FAP-4로 명명한 뒤, 2015년 6월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 12854BP).

실시예 2: 박테리오파지 Ent - FAP -4의 유전체 서열 분석 및 항균 단백질 서열 확보

박테리오파지 Ent-FAP-4의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 엔테로코쿠스 패슘의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ml에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음에 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분의 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음에 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/ml) 100 μl를 첨가한 후 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(Phenol) : 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀알코올(Isoamylalcohol)의 혼합액 10 ml를 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음에 분리된 층들 중에서 위층을 취하고 여기에 1.5 부피비의 아이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)을 첨가한 다음에 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(Ethanol)을 첨가한 다음에 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음에 이를 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 Ent-FAP-4의 유전체를 다량 확보하였다.

이렇게 얻어진 유전체를 이용하여 서울대학교 농생명과학공동기기원(National Instrumentation Center for Environmental Management)에서 illumina Mi-Seq 기기를 이용하여 차세대염기서열 분석(Next generation sequencing analysis)을 수행하여 박테리오파지 Ent-FAP-4의 유전체 서열 정보를 확보하였다. 상기 얻어진 박테리오파지 Ent-FAP-4 유전체 서열로부터 NCBI GLIMMER와 BLAST를 이용해 박테리오파지 Ent-FAP-4의 항균단백질에 해당하는 유전자 서열을 추정할 수 있었다. 추정된 항균단백질의 유전자 서열에서 시그널 펩타이드에 상응하는 부분을 제외한 부분의 유전자 서열(975 bp)을 박테리오파지 Ent-FAP-4 유래의 항균단백질에 대한 재조합 생산 기술 개발에 이용하였다. 이용한 항균단백질의 유전자 서열에서 시그널 펩타이드에 상응하는 부분을 제외한 부분의 유전자 서열을 서열번호 1로 제시하였다. 참고로, 이 서열번호 1의 유전자 서열에 해당하는 항균단백질의 아미노산 서열(324개 아미노산 잔기로 구성)이 서열번호 2로 제시되어 있다.

이렇게 확보된 아미노산 서열을 공지된 다른 박테리오파지 유래의 항균단백질 서열들과 비교해 본 결과, 박테리오파지 Ent-FAP-4로부터 유래한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항균단백질은 박테리오파지가 아닌 Enterococcus durans 세균 유래 오토리신(WP_016176409.1)과만 상동성을 가졌으며, 그 정도는 57%로 매우 낮았다. 이러한 점은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항균단백질이 현재까지 기능이 보고된 바 없는 신규한 항균단백질임을 확인할 수 있었다. 이 신규한 항균단백질을 EFAL-2로 명명하였다.

이러한 사실과 함께 통상적으로 박테리오파지 유래 항균단백질의 종류가 다르면 제공할 수 있는 항균특성이 다르다는 사실로부터 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항균단백질 EFAL-2는 기존에 보고된 다른 박테리오파지 유래의 항균단백질들과는 다른 항균효과를 제공해 줄 수 있다고 판단하였다.

실시예 3: 항균단백질 EFAL -2의 발현 플라스미드 제작

항균단백질 EFAL-2의 생산을 위하여 항균단백질 EFAL-2의 발현 플라스미드를 제작했다. 앞서 실시예 2에서의 확인된 항균단백질 EFAL-2의 유전자를 Nco I과 Not I 제한효소 자리를 이용하여 pBAD-TOPO 벡터(Invitrogen 사)에 PCR(Polymerase chain reaction) 클로닝하였다. 이를 위해 클로닝 전에 미리 pBAD-TOPO 벡터 내에 존재했던 엔테로키나아제 자리(Enterokinase cleavage site)를 없애고 Not I 제한효소 자리를 삽입시킨 것을 제작한 다음에 이를 PCR 클로닝에 이용하였다. 또한 클로닝 후에 스타트 코돈(Start codon)을 맞추기 위해 위치특이적 돌연변이 유발 키트(Site-directed mutagenesis kit; iNtRON Biotechnology 사)를 이용하였으며, 이러한 과정을 통하여 최종적으로 항균단백질 EFAL-2의 발현 플라스미드를 제작하였다. 이렇게 제작된 항균단백질 EFAL-2의 발현 플라스미드를 pBAD-EFAL-2로 명명하였다. pBAD-EFAL-2의 염기 서열을 서열번호 3으로 제시하였다. 이 pBAD-EFAL-2를 사용하여 대장균 TOP10을 형질전환시켜 항균단백질 EFAL-2의 생산 균주를 제작하였고, 이 생산균주를 TOP10-pBAD-EFAL-2로 명명하였다. 제작한 항균단백질 EFAL-2의 생산균주 TOP10-pBAD-EFAL-2는 2016년 12월 27일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 13177BP).

실시예 4: 항균단백질 EFAL -2의 제조

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 항균단백질 EFAL-2의 제조에 대하여 이하에 설명한다. 본 실시예에서는 본 발명자들에 의해 2016년 12월 27일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁된 형질전환 대장균 균주인 대장균 TOP10-pBAD-EFAL-2(수탁번호 KCTC 13177BP)를 생산균주로 사용하였다.

50 μg/ml이 되게 카나마이신이 포함된 LB배지(트립톤, 10 g/L; 효모 추출물, 5 g/L; 염화나트륨, 10 g/L) 20 ml에 대장균 TOP10-pBAD-EFAL-2를 접종(20 μl 첨가)한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕 배양하였다. 다음날, 50 μg/ml이 되게 카나마이신이 포함된 LB배지 1 L가 들어 있는 배양기에 한밤 배양한 배양액을 OD₆₀₀(600 nm에서의 흡광도)이 1/100 부피비로 첨가하였다. 200 rpm, 5 L/min aeration, 37℃ 조건에서 배양을 실시하였다. 세포 농도가 600 nm에서의 흡광도 기준으로 1.8-2.0이 되었을 때, 배양온도를 16℃로 낮추고 최종 농도가 0.2%가 되도록 L-아라비노즈를 첨가하여 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 항균단백질 EFAL-2의 발현을 유도하였다. 발현 유도 후에 16℃에서 한밤배양을 실시하였다. 배양 종료 후, 세포 배양액을 회수하여 7,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 세포 침전물을 회수하였다. 회수한 세포 침전물은 세포 침전물 1 g 당 20 ml의 50 mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 7.0) 완충액을 사용하는 방식으로 부유시켰다. 이렇게 준비된 세포 부유액에 대하여 초음파 분쇄법을 적용하여 세포 파쇄를 실시하였다. 초음파 분쇄법의 적용 조건은 3초간 초음파를 가하여 세포를 깨고 3초간 멈추는 것을 총 15분간 반복하여 실시하였다. 이때 ice bath 상태로 실시하였다. 세포 파쇄 후에 세포 파쇄액을 13,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 얻어진 상등액을 통상의 양이온-교환 크로마토그래피(Cation-exchange chromatography) 정제공정을 통하여 정제하였다. 정제공정을 간단히 설명하면 다음과 같다. 양이온-교환수지(Cation-exchange resin)로는 5 ml의 HiTrap^TM SP FF(GE Healthcare사)를 사용하였다. 크로마토그래피는 칼럼을 Buffer A(50 mM 트리스-염산, pH 7.0)로 미리 평형화시킨 다음 실시하였고, 시료를 칼럼에 적하한 다음에는 5 ml/min의 유속(Flow rate)으로 buffer A를 10 CV(Column volume) 흘려주어 세척을 실시하였다. 세척 후에는 5 ml/min의 유속으로 buffer A에서 buffer B(50 mM 트리스-염산, 1 M NaCl, pH 7.0)로의 농도구배(Gradient)가 0%에서 100%가 되게 하는 조건으로 크로마토그래피를 수행하였다. 이 과정에서 목적하는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 항균단백질 EFAL-2의 용출이 달성되었다. 정제한 항균단백질 EFAL-2를 전기영동을 통하여 분석한 결과가 도 2에 제시되어 있다.

확보된 정제 분획 중에 항균단백질 EFAL-2를 고농도로 포함하고 있는 분획들(도 2에서의 레인 5, 레인 6, 및 레인 7에 상응하는 정제 분획들)을 모았고, 이를 완충액(50 mM 트리스-염산, pH 7.0)에 대하여 투석을 실시하여 매질 교환을 수행하였다. 이를 통하여 90% 이상의 순도를 갖는 항균단백질 EFAL-2 용액을 확보할 수 있었다.

실시예 5: 점적 실험을 통한 항균단백질 EFAL -2의 항균활성 조사

본 발명자들은 항균단백질 EFAL-2의 항균활성을 통상의 점적 실험을 통하여 조사해 보았다. 실험에서는 엔테로코쿠스 패슘 5주, 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 4주, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 3주, 살모넬라(Salmonella) 5주, 및 대장균 7주를 대상으로 하였다. 상기 박테리아는 항생제내성균주은행(Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes; CCARM; 서울시 노원구 공릉 2동 126 서울여자대학교 제 1 과학관 429호) 또는 미국의 The American Type Culture Collection(ATCC)로부터 분양을 받았거나 본 발명자들에 의해 분리확보되어 동정된 것들이었다.

실험방법은 TSA 배지에 600 ㎚에서 흡광도가 1 정도 되는 각 박테리아 배양액 2 ml을 각각 다른 평판배지에 도말하여 말린 후에 37℃ 배양기에서 7시간 동안 배양하였다. 균이 자란 것을 확인한 후에 항균단백질 EFAL-2 용액(EFAL-2 농도 1 mg/ml) 10 μl씩을 떨어뜨렸다. 음성대조로는 EFAL-2가 포함되지 않은 완충액(50 mM 트리스-염산, pH 7.0)을 떨어뜨렸다. 점적 후에 37℃ 배양기에서 30분에서 1시간 정도 배양하면서 각 박테리아의 용균 정도를 관찰하였다. 그 결과, 항균단백질 EFAL-2는 엔테로코쿠스 패슘에 대해서만 항균활성(용균력)이 있었고 다른 균종들에 대해서는 항균활성이 없었다. 엔테로코쿠스 패슘에 대한 항균활성은 시험에서 대상이 된 엔테로코쿠스 패슘 5주 모두에 대해서 확인되었다. 엔테로코쿠스 패슘 대상의 대표적 실험 결과를 도 3에 제시한다.

이로부터 항균단백질 EFAL-2는 엔테로코쿠스 패슘에 대하여 우수한 용균력을 제공할 수 있으며, 또한 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 탁도 감소 조사법을 통한 항균단백질 EFAL -2의 항균활성 조사

항균단백질 EFAL-2 용액을 사용하여 탁도 감소 조사법(Turbidity reduction assay)을 통하여 항균단백질 EFAL-2의 항균활성을 조사하였다. 시험에 있어 대상이 된 박테리아는 실시예 5와 동일하였다.

탁도 감소 조사법의 실험방법은 다음과 같았다. 생리식염수에 시험대상 박테리아를 600 ㎚에서 흡광도가 0.6-0.7 정도가 되도록 부유시킨 다음에 이 부유액 0.9 ml에 항균단백질 EFAL-2 용액(EFAL-2 농도: 40 μg/ml) 0.1 ml을 첨가(최종 EFAL-2 농도: 4 μg/ml)한 후에 600 ㎚에서 흡광도를 30분간 측정하는 방식으로 실시하였다. 음성대조로는 항균단백질 EFAL-2를 포함하지 않은 완충액(50 mM 트리스-염산, pH 7.0)을 사용하였다.

실험 결과로, 항균단백질 EFAL-2는 엔테로코쿠스 패슘에 대해서만 용균활성을 보였고 다른 시험 대상 박테리아에 대해서는 용균활성을 갖고 있지 않았다. 엔테로코쿠스 패슘 균에 대한 대표적 실험 결과를 도 4에 제시하였다. 탁도 감소 조사법을 통한 항균단백질 EFAL-2의 항균활성 조사에서 항균단백질 EFAL-2의 항균활성 발휘가 매우 빠르다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 신속한 항균활성 발휘는 기존의 어떤 항생제들도 제공하지 못했던 특성이라 할 수 있다.

실시예 7: 항균단백질 EFAL -2의 엔테로코쿠스 패슘 감염 예방에 대한 적용예

9 ml의 영양배지(Nutrient broth: 소고기 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L)를 담은 하나의 튜브에는 약 1 mg/ml의 항균단백질 EFAL-2 용액 100 μl를 넣어주고, 대조실험으로는 같은 조성의 배지 9 ml을 담은 튜브에 항균단백질 EFAL-2 용액 대신에 100 μl의 영양배지를 추가로 첨가하였다. 여기에 최종적으로 600 nm에서 흡광도가 0.5 정도가 되도록 엔테로코쿠스 패슘 배양액을 각각 넣어준 다음에 37℃ 배양기에 옮겨 진탕 배양하면서 엔테로코쿠스 패슘의 성장 상태를 관찰해 보았다. 표 1의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 항균단백질 EFAL-2 용액을 첨가해 주지 않은 튜브에서는 60분 후 600 nm에서의 흡광도가 1.4 정도가 될 정도로 엔테로코쿠스 패슘이 매우 잘 성장한 반면에, 항균단백질 EFAL-2 용액을 첨가해 준 튜브에서는 10분 경과 후 600 nm에서의 흡광도가 0.1 정도 수준으로, 60분 후에는 0.05 수준으로 점차 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.

엔테로코쿠스 패슘의 성장억제(OD₆₀₀ 흡광도 값)

구분	배양 0시간	배양 후 10분	배양 후 60분
대조군(무처리)	0.5	0.6	1.4
실험군 (항균단백질 EFAL-2 용액 첨가)	0.5	0.1	0.05

이 결과로부터 본 발명의 항균단백질 EFAL-2가 엔테로코쿠스 패슘의 성장을 저해할 뿐만 아니라 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 항균단백질 EFAL-2가 엔테로코쿠스 패슘의 감염을 예방하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.

실시예 8: 항균단백질 EFAL -2의 엔테로코쿠스 패슘 감염에 대한 치료적 효과 조사

항균단백질 EFAL-2 용액을 이용하여 항균단백질 EFAL-2의 엔테로코쿠스 패슘 감염에 대한 치료적 효과를 감염 동물 모델을 사용하여 조사하였다.

약 20 g 내외 체중의 5주령 ICR 마우스[specific pathogen-free(SPF) grade]를 실험동물로 사용했다. 총 20마리를 2 개의 군으로 분리(군당 10마리씩)한 다음에 정맥투여 방식으로 마우스 당 엔테로코쿠스 패슘 균 1× 10⁸ cfu(즉, 1× 10⁸ cfu/mouse)를 투여하여 감염을 유도하였다. 하나의 군(처치군)에 대해서는 균 강제 감염 후에 30 분 경과 시점, 12 시간 경과 시점, 및 24 시간 경과 시점에 항균단백질 EFAL-2 용액(10 mg/ml)을 0.2 ml을 투여하였다. 또 다른 군(대조군)에 대해서는 완충액(50 mM 트리스-염산, pH 7.0)만을 동일 부피 투여하였다. 완충액 투여는 항균단백질 EFAL-2 용액 투여와 동일하게 균 강제 감염 후에 30 분 경과 시점, 12 시간 경과 시점, 및 24 시간 경과 시점에 실시하였다. 균 강제 감염 후로부터 5일 동안 매일 사망 개체 수를 조사하였고, 특이 현상의 관찰여부도 매일 오전 및 오후로 하루에 2번씩 조사하였다.

결과로 확연한 치료 효과가 확인되었다. 사망 개체 수는 다음의 표 2와 같았으며, 본 발명의 항균단백질 EFAL-2의 투여가 감염 동물의 생존율에서 확연한 개선을 제공하였다. 또한, 대조군에서는 안검염의 발적(Erythema of lid margin), 활동성 감소 등의 다양한 특이 반응들이 관찰됨에 비교하여 항균단백질 EFAL-2 투여군에서는 그러한 특이 반응이 관찰되지 않았다.

군	사망 개체 수					사망 개체 수 /시험 개체 수	폐사율 (%)
	균 강제 감염 후 경과 일
	1	2	3	4	5
대조군	0	3	2	1	0	6/10	60
처치군	0	0	0	0	0	0/10	0

이상의 결과로 본 발명의 항균단백질 EFAL-2가 엔테로코쿠스 패슘 감염 치료에 효과적임을 확인할 수 있다. 이러한 특성은 항균단백질 EFAL-2가 유효성분으로 포함된 약학적 조성물이 엔테로코쿠스 패슘 감염 치료 목적으로 활용될 수 있음을 보여주고, 또한 엔테로코쿠스 패슘 감염 치료 목적으로 통상의 항생제와 같은 방식으로 활용될 수 있음을 보여 준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

[수탁번호]

기탁기관명: KCTC

수탁번호: KCTC 13177BP

수탁일자: 20161227

Claims

엔테로코쿠스 패슘에 대한 용균력을 갖는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 항균단백질 EFAL-2.
제1항에 있어서, 상기 항균단백질 EFAL-2는 박테리오파지 Ent-FAP-4(수탁번호 KCTC 12854BP)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 항균단백질 EFAL-2.
제1항의 항균단백질 EFAL-2를 코딩하는 유전자.
제3항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
제1항 또는 제2항의 항균단백질 EFAL-2의 생산에 이용될 수 있는 대장균 형질전환체 TOP10-pBAD-EFAL-2(수탁번호 KCTC 13177BP).
대장균 TOP10-pBAD-EFAL-2(수탁번호 KCTC 13177BP)를 이용하여 제1항 또는 제2항의 항균단백질 EFAL-2를 제조하는 방법.
제1항 또는 제2항의 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는, 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용의 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항생제를 포함한 약학적 조성물 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는, 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용의 약학적 조성물.
제7항 또는 제8항에 의한 항균단백질 EFAL-2를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 치료 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 약학적 조성물이 항생제를 포함한 약학적 조성물 형태로 치료 대상에 투여되는 것을 특징으로 하는, 엔테로코쿠스 패슘에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.