CN113699121B - 一种高压静电场协同1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽提高t4噬菌体效价的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高压静电场协同1,3‑甘油二酯和胶原蛋白肽提高T4噬菌体效价的方法，通过添加1,3‑甘油二酯和胶原蛋白肽，并在高压静电场下培养T4噬菌体，提高了T4噬菌体效价。本发明培养的T4噬菌体提高了对大肠杆菌AMC 198的噬菌效果，有望取代抗生素，使噬菌体领域具有更广泛的应用前景，在临床、食品和农业领域中防治细菌污染具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及高压静电场协同1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽共同作用于T4噬菌体，得到一种效价较高的T4噬菌体。
背景技术
细菌污染已经成为全球性问题，已经破坏了环境、食品、医疗系统的社会和经济稳定性。大肠杆菌病是导致全球畜禽业发病率、死亡率高和经济损失居高不下的原因。大肠杆菌被认为是一种重要的人畜共患病原体，食用受污染的家禽，会导致人类患食源性尿路感染（Goudarztalejerdi A, Mohammadzadeh A, Najafi S V, et al. Serogrouping,phylotyping, and virulence genotyping of commensal and avian pathogenicEscherichia coli isolated from broilers in Hamedan, Iran[J]. ComparativeImmunology, Microbiology and Infectious Diseases, 2020, 73:101558.）。噬菌体是感染细菌的病毒，在调节细菌种群的数量方面起着重要作用。由于噬菌体对宿主的高度特异性，它们已在临床、食品和农业领域中被用于对抗或预防细菌感染。近几十年来，抗生素耐药性的上升已经成为一个世界性的问题，噬菌体的疗法有望取代抗生素成为一种有前景的抗菌方法（Malone L M, Birkholz N, Fineran P C, et al. Conquering CRISPR:howphages overcome bacterial adaptive immunity[J]. Current Opinion inBiotechnology, 2021, 68：30–36.）。
甘油二酯（Diglyceride，DAG）是由丙三醇（甘油）与两个脂肪酸酯化后得到的产物，包括1,3-DAG和1,2-DAG两种异构体，特别是 1,3-DAG，在预防体内脂肪堆积、肥胖症等具有重要作用(Devi, B L A P, Gangadhar,K N, Prasad, R B N, et al.Nutritionally enriched 1,3-diacylglycerol-rich oil: Low calorie fat withhypolipidemic effects in rats［J］. Food Chemistry,2018
,248:210-216)。1,3-DAG不同于甘油三酯的独特代谢方式，使得其具有重要的潜在价值(Saito S，Hernandezono A，Ginsberg H N. Dietary 1,3-diacylglycerolprotects against diet - induced obesity and insulin resistance［J］．Metabolism clinical ＆ Experimental，2007，56(11):1566-1575)。1,3-DAG不仅可以作为保健油脂，还可以作为医药辅料、化妆品辅料、药物合成中间体、饲料添加剂等(Xu, TC， Li, J P，Zou, J Y, et al. Rat small intestinal mucosal epithelial cellsabsorb dietary 1,3-diacylglycerol via phosphatidic acid pathways［J］．Lipids,2018,53(3):335-344; Wang, J ,Choi, H , Kim,W K. Effects of dietary energylevel and 1,3-diacylglycerol on growth performance and carcass yield inbroilers［J］．Journal of Applied Poultry Research,2020,29(3):665-672)。1,2-DAG作为1,3-DAG的同分异构体，虽然代谢方式有别于1,3-DAG，但是其作为食用油脂的重要成分，同样被广泛地应用于食品行业中。
胶原蛋白肽是通过酶处理降解胶原蛋白而产生的一种小分子产物。除了具有高生物活性，分子量小，易吸收，无毒无害等典型特征外，胶原蛋白肽还具有抗氧化性能以及促进愈合的能力（Zhang C, Yang X, Hu W, et al. Preparation and characterizationof carboxymethyl chitosan/collagen peptide/oxidized konjac composite hydrogel[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 149：31-40.），因此被广泛应用于化妆品、医疗、食品等领域。此外，有研究表明胶原蛋白肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌和沙门氏菌都有抑制作用（杨志荣，恒泰，莎丽娜. 羊软骨中Ⅱ型胶原蛋白肽的制备和抑菌活性[J]. 食品科技，2016，41(03)：134-138.）。
高压静电场技术已广泛用于食品工业中，用来控制病原微生物和腐败微生物。高压静电场可以电解空气产生臭氧，臭氧使细胞活性所需的酶失活，增加细胞膜的通透性，破坏细胞质中的遗传物质或使其失去功能（Huang H, Sun W, Xiong G, et al. Effects ofHVEF treatment on microbial communities and physicochemical properties ofcatfish fillets during chilled storage[J]. LWT-Food Science and Technology,2020, 131:109667.）。对大肠杆菌进行高压静电场处理，降低了大肠杆菌的存活率，可应用于工业消毒杀菌（白爱枝，赵巧燕，闫祖威，等. 不同处理方式下高压电场对大肠杆菌杀菌效应的比较研究[J].食品科学，2009，30(09)：56-58.）。但目前，关于高压静电场协同1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽，应用于T4噬菌体使其效价提高的研究未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种高压静电场协同1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽提高T4噬菌体效价的方法，通过添加1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽，并在高压静电场下培养T4噬菌体，提高了T4噬菌体效价，对安全预防和控制畜牧业疾病具有重要的意义。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种高压静电场协同1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽提高T4噬菌体效价的方法，包括如下步骤：
S1、将保存的大肠杆菌AMC 198挑取单菌落，接入5 mL LB液体培养基中，37 ℃160 r/min 振荡培养 8 h，得到1.00×108 cfu/mL浓度的大肠杆菌AMC 198菌悬液；
S2、制备1.0%的1,3-甘油二酯乳液1 mL，0.5%的胶原蛋白肽水溶液1 mL；
S3、将-80℃冻存的效价为5.00×108 pfu/mL的T4噬菌体原液置于4℃低温解冻，取T4噬菌体原液100 μL，大肠杆菌AMC 198菌悬液100 μL，接种于5 mL LB 液体培养基，加入1.0%的1,3-甘油二酯乳液200 μL和0.5%的胶原蛋白肽水溶液200 μL，均匀混合，静置15min，得到大肠杆菌AMC 198、T4噬菌体、1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽的混合液；
S4、将S3得到的大肠杆菌AMC 198、T4噬菌体、1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽的混合液置于绝缘塑料圆盘上，搅拌条件下，在0.15 MV/m的复合多重极板高压静电场中培养 8h，10000 r/min 离心 10 min，取上清液，得T4噬菌体增殖液；
S5、将T4噬菌体增殖液用LB液体培养基进行10倍稀释，得到T4噬菌体稀释液，取T4噬菌体稀释液100 µL加入大肠杆菌AMC 198菌悬液200 µL，静置15 min，采用双层平板法培养大肠杆菌AMC 198的T4噬菌体，在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形的T4噬菌体噬菌斑，大肠杆菌AMC 198的T4噬菌体效价=T4噬菌体噬菌斑数×稀释倍数×10（pfu/mL）；
S6、将S4获得的T4噬菌体增殖液用LB液体培养基稀释，得到效价分别为1.00×105 pfu/mL、1.00×106 pfu/mL、1.00×107 pfu/mL、1.00×108 pfu/mL、1.00×109 pfu/mL的T4噬菌体稀释液；
S7、初始感染时加入T4噬菌体的数量与大肠杆菌AMC 198的数量的比值称为感染复数，培养得到的T4噬菌体最高效价对应的比值为最佳感染复数，取S6中各效价的T4噬菌体稀释液100 µL分别与1.0×108 cfu/mL浓度的大肠杆菌AMC 198菌悬液100 µL混匀培养，即感染复数分别为0.001、0.01、0.1、1、10。再加入LB液体培养基使不同感染复数的培养基体系总体积为10 mL，37 ℃ 160 r/min 振荡培养 8 h，10000 r/min 离心 10 min，取上清液，双层平板法分别测定不同感染复数下T4噬菌体稀释液与大肠杆菌AMC 198菌悬液混合液的效价，获得最高效价的感染复数为T4噬菌体的最佳感染复数。
进一步地，步骤S1中的大肠杆菌AMC 198保藏号为ATCC 11229，步骤S3中的T4噬菌体保藏号为ATCC 11303-B4；步骤S2中1.0%的甘油二酯乳液为1.0mL1,3-甘油二酯加入100mL水中，加100mg卵磷脂作为乳化剂，振荡混匀。
进一步地，步骤S5中的双层平板法具体方法如下，培养基下层为1.5%琼脂的LB 固体培养基，上层为0.5%琼脂的LB半固体培养基；将T4噬菌体和大肠杆菌AMC 198的混合液吸到融化的LB 半固体培养基中，混匀后立即倒入下层平板，37 ℃培养6 h，在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形的T4噬菌体噬菌斑。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种高压静电场协同1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽提高T4噬菌体效价的方法，通过添加1.0%的1,3-甘油二酯乳液和0.5%的胶原蛋白肽水溶液，并在高压静电场下培养T4噬菌体，获得的T4噬菌体效价明显提高，为噬菌体替代抗生素应用于畜牧业奠定了基础。本发明培养方法易于控制，操作简便。
具体实施方式
以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例
一种高压静电场协同1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽提高T4噬菌体效价的方法，包括如下步骤：
S1、将保存的大肠杆菌AMC 198挑取单菌落，接入5 mL LB液体培养基中，37 ℃160 r/min 振荡培养 8 h，得到1.00×108 cfu/mL浓度的大肠杆菌AMC 198菌悬液；
S2、制备1.0%的1,3-甘油二酯乳液1 mL，0.5%的胶原蛋白肽水溶液1 mL；
S3、将-80℃冻存的效价为5.00×108 pfu/mL的T4噬菌体原液置于4℃低温解冻。取T4噬菌体原液100 μL，大肠杆菌AMC 198菌悬液100 μL，接种于5 mL LB 液体培养基，加入1.0%1,3-的甘油二酯乳液200 μL和0.5%的胶原蛋白肽水溶液200 μL，均匀混合，静置15min，得到大肠杆菌AMC 198、T4噬菌体、1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽的混合液；
S4、将S3得到的大肠杆菌AMC 198、T4噬菌体、1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽的混合液置于绝缘塑料圆盘上，搅拌条件下，在0.15 MV/m的复合多重极板高压静电场中培养 8h，10000 r/min 离心 10 min，取上清液，得T4噬菌体增殖液；
S5、将T4噬菌体增殖液用LB液体培养基进行10倍稀释，得到T4噬菌体稀释液。取T4噬菌体稀释液100 µL加入大肠杆菌AMC 198菌悬液200 µL，静置15 min，采用双层平板法培养大肠杆菌AMC 198的T4噬菌体，在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形的T4噬菌体噬菌斑。大肠杆菌AMC 198的T4噬菌体效价=T4噬菌体噬菌斑数×稀释倍数×10（pfu/mL）；
S6、将S4获得的T4噬菌体增殖液用LB液体培养基稀释，得到效价分别为1.00×105 pfu/mL、1.00×106 pfu/mL、1.00×107 pfu/mL、1.00×108 pfu/mL、1.00×109 pfu/mL的T4噬菌体稀释液；
S7、初始感染时加入T4噬菌体的数量与大肠杆菌AMC 198的数量的比值称为感染复数，培养得到的T4噬菌体最高效价对应的比值为最佳感染复数。取S6中各效价的T4噬菌体稀释液100 µL分别与1.00×108cfu/mL浓度的大肠杆菌AMC 198菌悬液100 µL混匀培养，即感染复数分别为0.001、0.01、0.1、1、10。再加入LB液体培养基使不同感染复数的培养基体系总体积为10 mL，37 ℃ 160 r/min 振荡培养 8 h，10000 r/min 离心 10 min，取上清液，双层平板法分别测定不同感染复数下T4噬菌体稀释液与大肠杆菌AMC 198菌悬液混合液的效价，获得最高效价的感染复数即为T4噬菌体的最佳感染复数。
进一步地，步骤S1中的大肠杆菌AMC 198保藏号为ATCC 11229，步骤S3中的T4噬菌体保藏号为ATCC 11303-B4；步骤S2中1.0%1,3-的甘油二酯乳液为1.0mL1,3-甘油二酯加入100mL水中，加100mg卵磷脂作为乳化剂，振荡混匀。
进一步地，步骤S5中的双层平板法具体方法如下，培养基下层为1.5%琼脂的LB 固体培养基，上层为0.5%琼脂的LB半固体培养基。将T4噬菌体和大肠杆菌AMC 198的混合液吸到融化的LB 半固体培养基中，混匀后立即倒入下层平板，37 ℃培养6 h，在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形的T4噬菌体噬菌斑。
本实施例培养的T4噬菌体提高了对大肠杆菌AMC 198的噬菌效果，有望取代抗生素用于畜牧业疾病的预防和控制，从而使T4噬菌体具有广泛的应用前景。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种高压静电场协同1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽提高T4噬菌体效价的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将保存的大肠杆菌AMC 198挑取单菌落，接入5 mL LB液体培养基中，37℃ 160 r/min振荡培养8h，得到1.0×108cfu/mL浓度的大肠杆菌AMC 198菌悬液；
所述大肠杆菌AMC 198的保藏号为ATCC 11229；
S2、制备1.0%的1,3-甘油二酯乳液1mL，0.5%的胶原蛋白肽水溶液1mL；
通过将1.0mL1,3-甘油二酯加入100mL水中，加100mg卵磷脂作为乳化剂，振荡混匀制得所述1.0%的1,3-甘油二酯乳液；
S3、将-80℃冻存的效价为5.0×108pfu/mL的T4噬菌体原液置于4℃低温解冻，取T4噬菌体原液100μL，大肠杆菌AMC 198菌悬液100μL，接种于5mL LB液体培养基，加入1.0%的1,3-甘油二酯乳液200μL和0.5%的胶原蛋白肽水溶液200μL，均匀混合，静置15min，得到大肠杆菌AMC 198、T4噬菌体、甘油二酯和胶原蛋白肽的混合液；
所述T4噬菌体的保藏号为ATCC 11303-B4；
S4、将S3得到的大肠杆菌AMC 198、T4噬菌体、1,3-甘油二酯和胶原蛋白肽的混合液置于绝缘塑料圆盘上，搅拌条件下，在0.15 MV/m的复合多重极板高压静电场中培养8h，10000r/min离心10min，取上清液，得T4噬菌体增殖液；
S5、将T4噬菌体增殖液用LB液体培养基进行10倍稀释，得到T4噬菌体稀释液，取T4噬菌体稀释液100µL加入大肠杆菌AMC 198菌悬液200µL，静置15min，采用双层平板法培养大肠杆菌AMC 198的T4噬菌体，所述双层平板法的培养基下层为1.5%琼脂的LB固体培养基；上层为0.5%琼脂的LB半固体培养基；将T4噬菌体和大肠杆菌AMC 198的混合液吸到融化的LB半固体培养基中，混匀后立即倒入下层平板，37℃培养6h，在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形的T4噬菌体噬菌斑；
大肠杆菌AMC 198的T4噬菌体效价=T4噬菌体噬菌斑数×稀释倍数×10 pfu/mL；
S6、将S4获得的T4噬菌体增殖液用LB液体培养基稀释，得到效价分别为1.0×105pfu/mL、1.0×106pfu/mL、1.0×107pfu/mL、1.0×108pfu/mL、1.0×109pfu/mL的T4噬菌体稀释液；
S7、初始感染时加入T4噬菌体的数量与大肠杆菌AMC 198的数量的比值称为感染复数，培养得到的T4噬菌体最高效价对应的比值为最佳感染复数，取S6中各效价的T4噬菌体稀释液100µL分别与1.0×108cfu/mL浓度的大肠杆菌AMC 198菌悬液100µL混匀培养，即感染复数分别为0.001、0.01、0.1、1、10；
再加入LB液体培养基使不同感染复数的培养基体系总体积为10mL，37℃ 160 r/min振荡培养8h，10000 r/min离心10min，取上清液，双层平板法分别测定不同感染复数下T4噬菌体稀释液与大肠杆菌AMC 198菌悬液混合液的效价，获得最高效价的感染复数即为T4噬菌体的最佳感染复数。
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