JP2009533478A

JP2009533478A - 黄色ブドウ球菌感染症の治療用薬剤の製造のための活性成分としてｔｒａｐタンパク質自体の使用

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Publication number: JP2009533478A
Application number: JP2009505708A
Authority: JP
Inventors: 光 ▲朽▼; ▲宇▼生邵; ▲並▼萍高; 玉 ▲刈▼; ▲沽▼ 董; 少▲化▼ 李; 川柳; 倍▲苗▼ 沈; 明范
Original assignee: Hainan Gt Unipul Pharmaceutical CoLtd
Current assignee: Hainan Gt Unipul Pharmaceutical CoLtd
Priority date: 2006-04-17
Filing date: 2007-04-16
Publication date: 2009-09-17
Also published as: WO2007118431A8; CA2649768A1; US20090305975A1; KR101443233B1; EP2011508A1; KR20090012237A; CN100540047C; EP2011508A4; CN1872335A; WO2007118431A1; EP2011508B1

Abstract

本発明は、黄色ブドウ球菌感染症の治療用薬剤の製造のための活性成分としてＴＲＡＰ自体の使用を開示している。外来ＴＲＡＰ（天然ＴＲＡＰまたは組換えＴＲＡＰ）自体が黄色ブドウ球菌外毒素の産生を有効に阻害して、それにより黄色ブドウ球菌の病原性を減少させうる。加えて、ＴＲＡＰを含んでなる薬剤は、それが黄色ブドウ球菌感染症を治療するために用いられる場合、人体で対応抗体の産生も刺激し、これらの抗体が黄色ブドウ球菌外毒素の産生を更に阻害しうるのである。このような二重作用は薬剤の効果を増加させ、新規の薬剤作用様式をもたらす。更に、ＴＲＡＰは細菌の毒性に対して単に働き、細菌の増殖に影響を与えないため、それは細菌に容易に薬物耐性を獲得させることはなく、薬物耐性黄色ブドウ球菌にも有効である。更に、本発明のＴＲＡＰタンパク質の相同的配列はヒトゲノムにおいて見られず、そのためＴＲＡＰの薬剤はヒト免疫疾患を引き起こさない。

Description

発明の背景

発明の分野
本発明は生物系薬学分野に属する。特に、本発明は黄色ブドウ球菌感染症の治療用薬剤の製造のための活性成分としてＴＲＡＰタンパク質自体の使用に関する。

背景技術
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)は、ブドウ球菌に属し、肺炎、心内膜炎、火傷および戦傷、敗血症、並びに中毒性ショックなどの重篤な感染症を引き起こす主病原菌である。加えて、黄色ブドウ球菌は食中毒を引き起こす細菌の一種である。黄色ブドウ球菌は空気、土壌、水、および給仕用品類に広く存在し、そして動物およびヒトが主な媒介者である。黄色ブドウ球菌は、唾液と、群集中での大規模な接触とにより伝播される。１年当たり病院のみで黄色ブドウ球菌感染症に罹患する患者は百万人以上存在する。黄色ブドウ球菌は、グラム陽性敗血症、熱傷の感染症、および急性肝不全を引き起こす主病原菌である。

黄色ブドウ球菌の主病原物質は、ヘマトキシン、ロイコシジン、エンテロトキシンなどを含めた外毒素である。最近の研究においては、黄色ブドウ球菌におけるこれら病原性因子の合成が調節ＲＮＡ分子、即ちＲＮＡ IIIにより制御されることを示している。ＲＮＡ IIIは病原性因子の遺伝子転写を活性化し、塩基相補性により病原性因子の翻訳を調節している。ＲＮＡ IIIレベルは細菌増殖の初期対数期で比較的低いが、細菌増殖の後期対数期で４０倍に増加し、一方ＲＮＡ IIIのレベルは黄色ブドウ球菌自体から分泌されるタンパク質ＲＡＰ（ＲＮＡ III活性化タンパク質）により調節され、そのためＲＡＰは黄色ブドウ球菌病原性刺激因子とも称される。黄色ブドウ球菌はＲＡＰを継続的に分泌し、ＲＡＰがある濃度に達したときのみＲＡＰは病原性因子の産生を活性化させる。ＲＡＰの産生がなければ、黄色ブドウ球菌は疾患を引き起こさない（Balaban N.et al,Science,1995,280,438-440）。最近の研究では、ＲＡＰが２１ＫＤタンパク質ＴＲＡＰ（ＲＮＡ III活性化タンパク質の標的）の媒介でＲＮＡ IIIの転写を活性化させることを示している。ＴＲＡＰをコードする遺伝子が突然変異により不活性化されると、ＲＡＰはＲＮＡ IIIの転写を活性化できない。

ＴＲＡＰは１６７のアミノ酸からなり、Ｈｉｓキナーゼ活性を有する。ＴＲＡＰは黄色ブドウ球菌の増殖の初期段階においてリン酸化され、中間対数増殖期に最大レベルへ達する。ＲＡＰ作用後、シグナル伝達が自己リン酸化により行われ、それによりＲＮＡ IIIの細胞内レベルを増加させて、黄色ブドウ球菌外毒素の分泌を促進する（Namomi B.et al,J.Biol.Chem.,2001,276:2658-2667）。ＴＲＡＰは黄色ブドウ球菌の表面タンパク質であり、ブドウ球菌において高度に保存される。ＴＲＡＰの主な生物学的機能は、黄色ブドウ球菌外毒素の調節に関与することである。黄色ブドウ球菌外毒素のレベルは、ＴＲＡＰのリン酸化レベルの増加で上方調節される（Gov Y.et al,J.Biol.Chem.,2004,279:14665-72）。

配列アライメント解析に基づき、ＴＲＡＰタンパク質は三つのファミリーに分けられ、それらは互いに８０％以上の相同性を有することが現在見出されている（Yang G.et al,J.Biol.Chem.,2005,280:27431-27435）。特に、ＴＲＡＰタンパク質が黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）において高度に保存されることが、配列アライメントに基づき、見出された。現在、GeneBankには１０の黄色ブドウ球菌株および二つの表皮ブドウ球菌株のＴＲＡＰ配列が記録されている。

ＴＲＡＰタンパク質は配列保存に基づき次の三つのファミリーに分けられる：ファミリー１は、ＤＮＡＭＡＮによる解析に基づくと９９．４９％の同一性を有する、黄色ブドウ球菌からの７種のＴＲＡＰタンパク質を含み（図１）、ファミリー２は、ＤＮＡＭＡＮによる解析に基づくと９９．８０％の同一性を有する、黄色ブドウ球菌からの三種のＴＲＡＰタンパク質を含み（図２）、およびファミリー３は、９８．２０％の同一性を有する、黄色ブドウ球菌からの二種のＴＲＡＰタンパク質を含む（図３）。加えて、上記三つのファミリーにおいて、黄色ブドウ球菌ＲＮ６３９０Ｂ、黄色ブドウ球菌０４０１８、および表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ１２２２８からのＴＲＡＰタンパク質は、ＤＮＡＭＡＮによる配列アライメント解析に基づくと８４．７２％の同一性を有する（図４）。

最近の研究においては、外来ＲＡＰおよびＴＲＡＰ阻害剤を用いることで黄色ブドウ球菌外毒素の産生に関する経路を阻害することにより、黄色ブドウ球菌の病原効果が効果的に減少させれることを示している。公知のＲＡＰおよびＴＲＡＰ阻害剤、例えば小分子阻害ペプチド（ＲＮＡＳ III阻害ペプチド、以下ＲＩＰと称する）および抗体は、黄色ブドウ球菌外毒素の分泌を効果的に減少させることができる。ＴＲＡＰのＣ末端は、黄色ブドウ球菌感染から生物を防御するために有効なペプチドワクチンとして用いられる（Oleny V.et al,Peptides,2001,22:1621-1627、Yang G.et al,Peptides,2003,24:1823-1828、Yang G.et al,J.Biol.Chem.,2005,280:27431-27435）。

現在、例えばＲＩＰ、ＲＡＰ抗体などにより、黄色ブドウ球菌毒素の産生を減少させるために、上記の黄色ブドウ球菌毒素の産生に関する経路を阻害し、それにより黄色ブドウ球菌の病原効果を減少させることで、黄色ブドウ球菌の感染症が主に治療される。

黄色ブドウ球菌ＲＮ６３９０ＢからのＲＮＡ III活性化タンパク質の標的（ＴＲＡＰ）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は当業界において知られている（ＵＳＰ６６８９８７８）。加えて、該ＴＲＡＰは抗体の産生を誘導するために用いられ、該抗体が薬剤として用いられ（ＵＳＰ６７４７１２９）、そこでは黄色ブドウ球菌感染症の発生を抑制するためにＴＲＡＰの機能がＴＲＡＰに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体により阻害される、と報告されていた。

一方、黄色ブドウ球菌を含む病原菌の薬物耐性が抗生物質の乱用により、継続的に出現および増加し、β-ラクタム抗生物質に耐性のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、糖ペプチド抗生物質に耐性の糖ペプチド耐性黄色ブドウ球菌（ＧＩＳＡ）、およびバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）などを含めた薬物耐性株に多くの抗生物質が無効である。他方、黄色ブドウ球菌自体も容易に薬物耐性を獲得する。

現在黄色ブドウ球菌感染症の治療で存在する上記の問題を解決するために、黄色ブドウ球菌感染症を有効に制御できて、黄色ブドウ球菌に容易に薬物耐性を獲得させない方法を開発することは緊急の課題である。

発明の概要

一つの態様において、本発明は、黄色ブドウ球菌感染症の治療用薬剤の製造のための、活性成分としてＴＲＡＰ自体の使用に関する。

特に、外来ＴＲＡＰ自体は細胞モデルおよび動物モデルにおいて黄色ブドウ球菌外毒素の産生を有効に阻害しうることが、インビトロ試験（ＭＤＢＫ細胞モデル）およびインビボ試験（黄色ブドウ球菌感染症の動物モデル）から意外にも見出された。黄色ブドウ球菌感染症を治療して発病を減少させるために外来ＴＲＡＰ自体が活性成分として用いられ、その治療効果はＴＲＡＰに対するポリクローナル抗体の場合と類似している。

本発明において、“外来ＴＲＡＰ”という用語は、黄色ブドウ球菌感染後黄色ブドウ球菌外毒素の産生時に黄色ブドウ球菌感染症の該細胞または動物モデルで産生される外来ＴＲＡＰについて、黄色ブドウ球菌感染症の治療のために人為的に加えられまたは投与されるＴＲＡＰタンパク質に関する。本発明において、黄色ブドウ球菌から手作業で抽出されたまたは遺伝子工学で組換え発現された単離ＴＲＡＰに関して、それが黄色ブドウ球菌感染症を引き起こす特定の黄色ブドウ球菌株から直接にまたはそれと高い相同性を有する株から由来するのか否かにかかわらず、該単離ＴＲＡＰが黄色ブドウ球菌感染症の治療のため付加的に加えられまたは投与されるのみであれば、それは外来ＴＲＡＰとして認められる。

特に、本発明の一つの態様においては、ＭＤＢＫ細胞モデルが用いられ、外来ＴＲＡＰがＭＤＢＫ細胞培養液へ加えられまたは加えられず、その場合に黄色ブドウ球菌が該液へ加えられる。結果は、黄色ブドウ球菌外毒素の産生が外来ＴＲＡＰの添加により有効に阻害されることを示す。本発明の他の態様では、黄色ブドウ球菌がマウスへ腹腔内注射された後で、外来ＴＲＡＰタンパク質が投与されまたは投与されず、各群のマウスの生存期間および状態が観察される。結果は、マウスの黄色ブドウ球菌感染症が外来ＴＲＡＰの注射により減少し、それによりマウスの生存率を延ばすことを示す。

本発明において、該ＴＲＡＰタンパク質には、異なる種類の黄色ブドウ球菌からの天然ＴＲＡＰタンパク質、例えば遺伝子工学処理法で製造される組換えＴＲＡＰタンパク質または融合ＴＲＡＰタンパク質、および例えば化学合成法により得られるＴＲＡＰタンパク質および／または化学的修飾ＴＲＡＰタンパク質誘導体がある。本発明のＴＲＡＰタンパク質には、完全または部分的な生物活性を留めた、原ＴＲＡＰタンパク質から誘導される生物活性断片も含む。ＴＲＡＰタンパク質の該断片も、黄色ブドウ球菌感染症を治療するために用いられる。

ＵＳＰ６６８９８７８およびＵＳＰ６７４７１２９は、引用することにより本明細書の開示の一部とされ、ＴＲＡＰタンパク質のアミノ酸配列とそれらをコードするポリヌクレオチド配列がこれらの書類において開示される。

本出願において、該ＴＲＡＰタンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２またはＳＥＱＩＤＮＯ：４と配列同一性を有するタンパク質またはそれらのオルソログ、例えばそれらと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質に関する。本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２または４で示されているような配列の１-１６７、３０‐１６７、または５０‐１６７のアミノ酸残基と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の配列同一性を有するＴＲＡＰタンパク質も含む。

本発明の一つの態様において、該ＴＲＡＰタンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４において示されているような配列と、図１〜３において示されているような異なる三つのタンパク質ファミリーに属する１２の異なる起源からのＴＲＡＰタンパク質とから選択される。

二つのアミノ酸配列間の同一率は、例えば、タンパク質およびＤＮＡのアライメントで用いられるNeedelman-Wunschアライメントにより調べられる。タンパク質アライメントの場合、用いられるデフォルトスコアリングマトリックスは、スペーサー中におけるある残基のペナルティが−１２であり、他の残基の場合が−２であるＢＬ０ＳＵＭ５０であり、該アライメントはバージョンｖ２０ｕ６のアライメントソフトウェア、ＦＡＳＴＡパッケージにより行われる（W.R.Pearson and D.J.Lipman,“Improved tools for Biological Sequence Analysis”,PNAS,2005,85:2444-2448およびW.R.Pearson,“Rapid and Sensitive Sequence Comparison using FASTP and FASTA”,Methods in Enzymology,1990:183:63-98）。

本発明のＴＲＡＰタンパク質はいかなる公知のＴＲＡＰタンパク質から選択してもよい。構造および起源に関して、該ＴＲＡＰタンパク質は、治療すべき黄色ブドウ球菌感染症を引き起こす黄色ブドウ球菌により産生される内在性ＴＲＡＰタンパク質と同一でもまたは異なっていてもよい。本発明者らは、多種の異なる黄色ブドウ球菌株からのＴＲＡＰタンパク質が黄色ブドウ球菌外毒素の産生阻害と、黄色ブドウ球菌の病原性の減少とに同一または類似の効果を有することを見出した。

本発明の一つの態様においては、黄色ブドウ球菌ＲＮ６３９０ＢからのＳＥＱＩＤＮＯ：２において示されているようなＴＲＡＰタンパク質（GenBankのヌクレオチド配列ＡＦ２０２６４１に対応する）が、インビトロ試験およびインビボ試験で黄色ブドウ球菌外毒素の産生を有効に阻害するために、活性成分として用いられる。他の態様においては、黄色ブドウ球菌０４０１８からのＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されているようなＴＲＡＰタンパク質（GenBankのヌクレオチド配列ＡＹ２４８７０３に対応する）が、インビトロ試験およびインビボ試験で黄色ブドウ球菌外毒素の産生を阻害し、それにより黄色ブドウ球菌感染症を治療するために、活性成分として用いられる。本発明の他の態様においては、ＴＲＡＰタンパク質と１２アミノ酸のポリペプチドからなる融合タンパク質が、インビトロ試験およびインビボ試験で黄色ブドウ球菌外毒素の産生を阻害し、それにより黄色ブドウ球菌感染症を治療するために用いられる。

本発明の他の態様においては、活性成分として上記ＴＲＡＰタンパク質および場合により薬学上許容される担体または賦形剤を含んでなる医薬組成物に関する。本発明によると、黄色ブドウ球菌感染症の治療のためのＴＲＡＰタンパク質またはその断片が１回分または複数回分で単独投与されるか、あるいは薬学上許容される担体または賦形剤と組合せて投与されてもよい。本発明で黄色ブドウ球菌感染症の治療のためにＴＲＡＰタンパク質またはその活性断片を含んでなる医薬組成物は、文献（Remington,Science and Practice of Pharmacology,19^th edition,Genearo,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995）において開示されているような伝統的技術により、薬学上許容される担体または希釈物およびいずれか公知のアジュバントまたは賦形剤と一緒に処方され、溶液、懸濁液、凍結乾燥粉末、カプセル、錠剤、またはエアロゾルなどのような伝統的な形態をとる。

医薬組成物は、いずれか適切な経路、例えば非経口（皮下、筋肉内、髄腔内、静脈内、および皮内を含む）、経口、直腸、鼻、肺、局所（頬および舌下を含む）、皮膚、槽内、腹腔内、および膣経路で投与されるように、特に処方される。好ましい経路は、治療を受ける対象者の一般状態および年齢、治療される症状の種類、および用いられる活性成分に依存する、と理解されるべきである。投与経路はいかなる経路でもよく、活性成分がこのような経路により適切なまたは期待される作用部位へ効果的に運ばれさえすればよい。

非経口投与用の医薬組成物には、無菌水性または非水性注射溶液、分散液、懸濁液、または乳濁液と、それらが用いられる前に注射または分散用の無菌溶液で再調製される無菌粉末または凍結乾燥粉末がある。注射用の貯蔵処方物も本発明の範囲内に属する。

経口投与用の医薬組成物には、固体剤形、例えば硬または軟カプセル、錠剤、トローチ、糖衣錠、丸剤、ロゼンジ、粉末、または顆粒がある。適切であれば、それらはコーティング、例えば腸溶コーティングを施しても、あるいは徐放または持続放出のような活性成分の放出を制御するために当業界において公知の技術により処方してもよい。

経口投与用の液体剤形には、溶液、乳濁液、水性または油性懸濁液、シロップ、およびエリキシルがある。

坐剤、エアロゾル、軟膏、クリーム、ゼラチン、吸入剤、皮膚用パスタ、およびインプラントなどを含めた他の適切な剤形もある。

典型的な投与量は約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内であり、例えば約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重が１日に１回以上、例えば１〜３回で投与される。正確な用量は、治療される黄色ブドウ球菌感染症の状態、投与頻度および様式、治療を受ける対象者の性別、年齢および一般状態、治療される症状の種類および重篤度、治療される合併症および当業者に知られている他の要因に依存する。

処方剤は当業界で知られている方法により単位剤形を便宜上とってもよい。髄腔内、静脈内および筋肉内投与などのような非経口投与用の処方剤は、約０．００１〜約１０００ｍｇ、例えば約０．０１〜約５００ｍｇ、例えば約０．１〜約１００ｍｇの典型的用量で、１日に１回以上（例えば、１日１〜３回）投与される。

経口投与用の処方剤は、約０．０５〜約１０００ｍｇ、例えば約０．１〜約５００ｍｇ、例えば約０．５〜約２００ｍｇの典型的用量で、１日に１回以上（例えば、１日１〜３回）投与される。

適切な薬学上許容される担体には、不活性固体希釈物またはフィラー、無菌水溶液および各種有機溶媒がある。例えば、固体担体には、ラクトース、石膏粉末、スクロース、シクロデキストリン、タルク粉末、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、およびセルロース低級アルキルエーテルがある。液体担体の例は、シロップ、ピーナツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン、および水である。同様に、担体または希釈物には当業界で知られている徐放性物質、例えば単独でまたはワックスと一緒に用いられるモノステアリンまたはジステアリンがあってもよい。ＴＲＡＰタンパク質またはその断片と、薬学上許容される担体との組合せにより得られ、黄色ブドウ球菌感染症の治療に用いられる、本発明の医薬組成物は、開示された投与経路によりマルチドース型で便宜上投与されてもよい。処方物は当業界で知られている方法により単位剤形を便宜上とってもよい。

水性懸濁液は、水性懸濁液の生産に適した賦形剤と混合されるＴＲＡＰタンパク質またはその断片を含んでもよい。賦形剤は、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、バソラゴム、およびアラビアゴムであり、分散剤または湿潤剤には天然リン脂質、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合産物、例えばポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合産物、例えばヘプタデカニルエチレンオキシヘキサデカノール、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合産物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールグリコシドから誘導される部分エステルとの縮合産物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。水性懸濁液は更に一種以上のトナー、一種以上の香味剤および一種以上の甘味剤、例えばスクロースまたは糖質を含んでもよい。

油性懸濁液は、活性成分を植物油（例えば、ピーナツ油、オリーブ油、ゴマ油、またはヤシ油）または鉱油（例えば、流動パラフィン）へ分散させることにより製造されてもよい。油性懸濁液は、蜜蝋、固形パラフィン、またはスパーモル（spermol）のような増粘剤を含んでもよい。上記の甘味剤および香味剤も嗜好性の経口処方剤を得るために加えてよい。加えて、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）も保存用に本組成物へ加えてよい。

水を加えて水性懸濁液を製造するために適した分散性粉末または顆粒は、活性成分、分散または湿潤剤、懸濁剤および一種以上の保存剤を混合することにより得られる。上記の分散または湿潤剤が適切な分散または湿潤剤の例として用いられてもよい。他の賦形剤、トナー、香味剤、および甘味剤も懸濁液へ加えてよい。

本発明によると、黄色ブドウ球菌感染症の治療のためにＴＲＡＰタンパク質またはその断片を含んでなる医薬組成物は、油相が植物油（例えば、オリーブ油またはピーナツ油）、鉱油（例えば、流動パラフィン）またはそれらの混合物である、水中油型エマルジョンで存在してもよい。適切な乳化剤としては、天然ゴム、例えばアラビアゴム、バソラゴム、天然リン脂質、例えば大豆およびレシチン、脂肪酸およびヘキシトールグリコシドから誘導されるエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、および該部分エステルとエチレンオキシドとの縮合産物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートがある。乳化剤は甘味剤および香味剤を含んでもよい。

組成物は直腸投与用の坐薬形態で存在してもよい。この組成物は薬物および適切な非刺激賦形剤を混合することにより製造されてもよく、該賦形剤は常温において固体だが直腸温度で液化されるため、それは直腸で溶融されて薬物を放出しうる。このような賦形剤には、カカオ脂およびポリエチレングリコールなどがある。

外用の場合には、本発明の化合物を含んでなるクリーム、軟膏、ゼリー、および懸濁物が考えられる。この適用目的のために、洗口剤および含嗽剤(gargarismas)もそこに含まれる。

本発明によると、黄色ブドウ球菌感染症の治療のためのＴＲＡＰタンパク質またはその断片は、小単層ベシクル、大単層ベシクル、または多層ベシクルのようなリポソームデリバリーシステムで投与してもよく、該リポソームはコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンのような異なるホスファチドからなる。

加えて、本発明によると、黄色ブドウ球菌感染症の治療のためのＴＲＡＰタンパク質またはその断片の一部は、溶媒和物を形成するために、水または一般有機溶媒と混合させてもよい。このような溶媒和物も本発明の範囲内に含まれる。

固体担体が経口投与用であれば、処方剤は錠剤、薬物が粉末またはペレット形で充填される硬ゼラチンカプセル、トローチ、またはロゼンジの形態をとってもよい。固体担体の量は非常に異なるが、それは通常約２５ｍｇ〜約１ｇである。液体担体が用いられるならば、処方剤はシロップ、エマルジョン、ゼラチンの軟カプセル、または無菌注射液、例えば水性または非水性液体懸濁液または溶液の形態をとってもよい。

本発明によると、黄色ブドウ球菌感染症の治療のためのＴＲＡＰタンパク質またはその活性断片が、このような治療の必要な哺乳類、特にヒトへ投与されてもよい。該哺乳類には動物も含むが、それらは飼育動物（例えば、家庭のペット）でもまたは非飼育動物（例えば、野生動物）でもよい。

本発明の化合物を含んでなる医薬組成物は１日または１週間に１回以上投与されてもよい。医薬組成物の有効量は臨床的に有意な効果に達するほどの量である。このような用量は、治療の必要な具体的症状、対象者の年齢、体重、および一般健康状態、並びに当業者により明らかに考えられる他の要因に一部依存する。

本発明の他の態様においては、活性成分として上記のＴＲＡＰタンパク質を含んでなる医薬組成物の治療有効量を黄色ブドウ球菌感染症に罹患した対象者へ投与することを含んでなる、黄色ブドウ球菌感染症の治療のための方法に関する。

ここで“治療”という用語は、黄色ブドウ球菌感染症から患者を治すための、患者の治療または看護に関する。この用語は、症状および合併症の軽減および緩和、および／または疾患、障害、および症状の治癒もしくは消失を含む黄色ブドウ球菌感染症の治療の全範囲を包含する意味である。このような治療を受ける対象者は、好ましくは哺乳類、特にヒトである。

本発明において、“治療有効量”という用語は該病状の治療に十分な量に関し、それは患者、治療される疾患および用いられる治療法に基づき変化する。細菌感染症、特に黄色ブドウ球菌感染症の場合、該治療有効量は感染の発生後に該感染症をうまく抑制または消失させるために十分な量に関する。

本発明によると、黄色ブドウ球菌感染症の治療のためのＴＲＡＰタンパク質またはその生物活性断片は、単独でまたは他の確立された治療法と組み合わせて投与されてもよい。

ＴＲＡＰは、黄色ブドウ球菌感染症に対して二重効果を有し、即ち該タンパク質自体とその阻害剤またはその中和抗体は同様の効果を有して、それが薬剤のある種の新規作用様式を表すことが、本発明において見出された。

ＴＲＡＰが、黄色ブドウ球菌の感染症を治療するために用いられる場合、ＴＲＡＰが細菌由来の外来タンパク質であるため、それが人体でＴＲＡＰに対する抗体の産生を確実に誘導することも、本発明において見出された。伝統的な薬剤の場合、抗体の産生は薬剤の効果の阻害を意味する。しかしながら、ＴＲＡＰに関して、抗体の産生は有用である。

本発明の利点は次の通りである。
（１）薬剤の製造におけるＴＲＡＰの新規使用が見出され、治療薬を製造するために細菌細胞膜に付随したタンパク質の使用に関する新規分野が開発され、それが新規薬剤様式を表す。
（２）本発明のＴＲＡＰタンパク質の相同的配列はヒトゲノムにおいて見られず、そのためＴＲＡＰの薬剤はヒト免疫疾患を引き起こさない。
（３）ＴＲＡＰが黄色ブドウ球菌外毒素の産生を阻害する場合に、それが対応抗体も産生するように体を刺激し、産生された抗体が黄色ブドウ球菌外毒素の生成を更に阻害しうる。ＴＲＡＰが最初に機能し、次いで産生された抗体が同様の役割を更に果たすという様式が、新規の薬剤作用様式をもたらす。
（４）ＴＲＡＰタンパク質を含んでなる薬剤が黄色ブドウ球菌感染症を治療するために用いられる場合、それは外毒素の産生を主に阻害して黄色ブドウ球菌の病原性を減少させることから、それは細菌の生存に影響を与えず、それが薬物耐性の獲得を生じさせにくくする。そのため、該薬剤は薬物耐性ブドウ球菌においても機能しうる。

本出願は以下のいくつかの実施例により更に詳細に説明されているが、それらはいかなる形態によっても、本発明を限定するものではない。

製造例１
黄色ブドウ球菌ファミリーの二種ＴＲＡＰタンパク質（ＴＲＡＰタンパク質（GenBank Accession Ｎｏ．ＡＦ２０２６４１およびＡＹ２４８７０３））の製造。
Yang G.ら(2005)により開示された方法によりGenBankの塩基配列に従いプライマーを設計し、ＰＣＲ工程により株ＲＮ６３９０Ｂまたは０４０１８のゲノムからＴＲＡＰ遺伝子を各々増幅させ、それらをｐＥＴ-２８ａベクターへクローニングし、E.coliを形質転換させ、ＩＰＴＧで発現を誘導し、Ｎｉ^２＋親和性樹脂で精製することにより、二種のＴＲＡＰタンパク質を別々に得た。

製造例２
天然ＴＲＡＰタンパク質の製造
ポリクローナル抗体を組換えＴＲＡＰタンパク質により製造した。アフィニティカラムで精製抗体を製造するために、組換えＴＲＡＰタンパク質をＣＮＢｒで活性化されたSepharose ４Ｂとカップリングさせた。ＣＮＢｒで活性化されたSepharose ４Ｂと、精製抗体とをカップリングさせ、アフィニティ精製により黄色ブドウ球菌ＲＮ６３９０Ｂの超音波処理上澄からＴＲＡＰタンパク質を精製し、更にＨＰＬＣで精製することにより、９５％超の純度を有する精製天然ＴＲＡＰタンパク質を得た。

製造例３
ＴＲＡＰタンパク質と１２アミノ酸のポリペプチドからなる融合タンパク質の製造
非関連ペプチド配列（ＴＰＳＩＰＳＬＷＷＴＴＰ,Shen Tong et al.,Journal of Cellular and Molecular Immunology,2002,18:623-636）を選択し、プライマーを設計し、ＰＣＲによりＴＲＡＰ非関連ペプチドの融合タンパク質を発現する遺伝子配列を得、それをｐＥＴ-２８ａベクターへクローニングし、ＩＰＴＧで発現を誘導し、E.coliを形質転換させ、Ｎｉ^２＋親和性樹脂で精製することにより、ＴＲＡＰタンパク質と１２アミノ酸のポリペプチドからなる融合タンパク質を製造した。

実施例１
ＭＴＴ法によるＭＤＢＫ細胞モデルで黄色ブドウ球菌外毒素に及ぼす複数起源からのＴＲＡＰタンパク質の効果の検証（Normano G.et al,2001,Microbiological,24,341-346）
具体的な工程は次の通りであった：
（１）黄色ブドウ球菌を３７℃において一晩培養し、製造例１、２、または３において製造および精製された様々なタンパク質を生理塩水へ各々溶解させて、最終濃度２μｇ/μＬの溶液を得、
（２）一晩培養された黄色ブドウ球菌を５０００ｒｐｍ／５ｍｉｎで遠心して細菌を集め、ＴＨＢ培地（Todd Hewitt Broth,Difico Corporation）でＯＤ_{６００ｎｍ}＝８まで再懸濁かつ希釈し、０．９ｍＬＴＨＢ培地に１：１００の比率で接種し、
（３）工程（２）において得られた黄色ブドウ球菌で接種された培地へ工程（１）において調製された１００μＬのＴＲＡＰタンパク質を加え、コントロールとして１００μＬの生理塩水を用い、３７℃において６時間インキュベートし、
（４）１００００ｒｐｍ／５ｍｉｎで遠心して上澄を集め、１０分間煮沸し、そして１００００ｒｐｍ／５ｍｉｎで遠心して上澄を再び集め、
（５）９６ウェルプレート（培養液は１０％の牛胎児血清を含んでなるＤＭＥＭである）にＭＤＢＫ細胞を１×１０^４／ウェルで接種し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃において４時間接着培養を行い、
（６）工程（４）から得られた上澄をＭＤＢＫ培養液へ加え（１０μＬ／ウェル）、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃において２４時間培養し、そして
（７）ＭＴＴにより細胞の生存状態を検証する。

図５において、縦座標は細胞の生存状態を表し、ここで高ＯＤ値は細胞の高生存率と黄色ブドウ球菌外毒素の低生成率を意味する。

細胞の各群は外来ＴＲＡＰタンパク質の存在下において高い生存率を示し、一方外来ＴＲＡＰタンパク質の非存在下においては低い生存率を示すことが図５に表され、このことは外来ＴＲＡＰタンパク質が黄色ブドウ球菌外毒素の生成を減少させうることを実証している。加えて、黄色ブドウ球菌外毒素の生成を阻害する効果に関して、異なる起源からのＴＲＡＰタンパク質の間に有意差はない。

実施例２
腹腔内感染動物モデルにおいて黄色ブドウ球菌感染症に及ぼすＴＲＡＰタンパク質の治療効果の検証
材料の準備：
ＢＡＬＢ／ｃマウス：Animal Center of the Academy of Military Medical Sciencesから購入、および他の材料：製造例１および３のものと同様
具体的検出工程は次の通りである：
（１）黄色ブドウ球菌を３７℃において一晩培養し、製造例１において製造および精製された二種の遺伝子工学処理組換えタンパク質と、製造例３において製造および精製されたＴＲＡＰ融合タンパク質とを生理塩水へ各々溶解させて、最終濃度２μｇ/μＬの溶液を得、
（２）工程（１）の一晩培養黄色ブドウ球菌を５０００ｒｐｍ／５ｍｉｎで遠心して細菌を集め、ＴＨＢ培地（Todd Hewitt Broth,Difico Corporation）でＯＤ_{６００ｎｍ}＝８まで再懸濁かつ希釈し、１ｍＬＴＨＢ培地に１：１００の比率で接種し、３７℃においてＯＤ_{６００ｎｍ}＝５まで培養し、遠心して細胞を集め、等容量の生理塩水で再懸濁し、
（３）ＢＡＬＢ／ｃマウス（２０〜２５ｇ，雄性）を４群に分け：各群はマウス２０匹を有し、
（４）１００μＬの黄色ブドウ球菌をマウスへ腹腔内注射し、５時間後に様々なＴＲＡＰタンパク質をマウスへ腹腔内注射し、コントロールとして生理塩水を用い、そして
（５）各群のマウスの生存時間および状態を記録する。

結果は、ＴＲＡＰタンパク質が、マウスにおける黄色ブドウ球菌感染症を効果的に減少させ、感染マウスの生存率を増加させることを示す（表１参照）。

実施例３
マウスにおいてインビボでの抗体の産生に及ぼすＴＲＡＰの複数回注射の効果
（１）材料および方法は製造例１および２の場合と同様であるが、ＴＲＡＰタンパク質（GenBank Accession Ｎｏ．ＡＦ２０２６４１）が７日毎に１回の腹腔内注射で３回にわたりマウスへ投与されたという違いがある。１カ月後、マウス血清を集め、マウスにおいてインビボでのＴＲＡＰに対する抗体の産生を検証した。
（２）結果：ＴＲＡＰの複数回注射はマウスにおいてインビボでのＴＲＡＰに対する抗体の産生を誘導しうるが、このような注射を受けなかったマウスにおいて産生される抗体はほとんどなく、このことは外来ＴＲＡＰがインビボでＴＲＡＰに対する抗体を産生するように動物を誘導しうることを示す（図６参照）。

参考文献

図１はＴＲＡＰファミリー１における異なる起源からの７種のＴＲＡＰタンパク質の配列アライメント結果を表す。図２はＴＲＡＰファミリー２における異なる起源からの３種のＴＲＡＰタンパク質の配列アライメント結果を表す。図３はＴＲＡＰファミリー３における異なる起源からの２種のＴＲＡＰタンパク質の配列アライメント結果を表す。図４は三つのＴＲＡＰファミリーにおける３種の異なる株からのＴＲＡＰタンパク質の配列アライメント結果を表す。図５は黄色ブドウ球菌外毒素の産生に及ぼす異なる起源からの外来タンパク質の効果のヒストグラムを表す：数値は各々ＴＲＡＰの起源を表し、即ち１はGenBank Accession Ｎｏ．ＡＦ２０２６４１のプロテオームを表し、２はGenBank Accession Ｎｏ．ＡＹ２４８７０３のプロテオームを表し、３は黄色ブドウ球菌から精製された天然ＴＲＡＰプロテオームを表し、４はＴＲＡＰタンパク質と１２アミノ酸のポリペプチドからなる融合タンパク質を表し、５は正常細胞コントロールを表し、そして６は生理塩水コントロール群を表す。図６はＴＲＡＰに対する抗体の産生に及ぼす外来ＴＲＡＰタンパク質の効果のヒストグラムを表す：１はＴＲＡＰで処置された群を表し、２は塩水コントロール群を表し、および３は陰性コントロールを表す。

Claims

黄色ブドウ球菌感染症の治療のための薬剤の製造における、活性成分としてのＴＲＡＰ自体の使用。
前記ＴＲＡＰが、天然ＴＲＡＰ、組換えＴＲＡＰ、原ＴＲＡＰ、ＴＲＡＰを含んでなる融合タンパク質、ＴＲＡＰの化学修飾物、またはそれらの生物活性断片からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の使用。
前記ＴＲＡＰがブドウ球菌由来のものである、請求項１に記載の使用。
前記ＴＲＡＰのタンパク質が黄色ブドウ球菌由来のものである、請求項３に記載の使用。
前記ＴＲＡＰが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２または４において示されている配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは９５％超、更に好ましくは９８％超、または１００％の配列同一性を有するものである、請求項１に記載の使用。
前記薬剤が、ＴＲＡＰと、場合により薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物である、請求項１に記載の使用。
前記薬剤が、非経口投与用の無菌水性もしくは非水性注射溶液、分散液、懸濁液もしくは乳濁液、無菌粉末、および凍結乾燥粉末、経口投与用の硬もしくは軟カプセル、錠剤、トローチ、糖衣錠、丸剤、ロゼンジ、粉末、および顆粒、乳濁液、水性もしくは油性懸濁液、シロップ、およびエリキシル、並びに坐剤、エアロゾル、軟膏、クリーム、ゼラチン、吸入剤、皮膚用のパスタ、および外用のインプラントを含めた剤形である、請求項１に記載の使用。
黄色ブドウ球菌感染症に罹患した対象者へ治療有効量のＴＲＡＰを投与することを含んでなる、黄色ブドウ球菌感染症を治療するための方法。
前記ＴＲＡＰが、天然ＴＲＡＰ、組換えＴＲＡＰ、原ＴＲＡＰ、ＴＲＡＰを含んでなる融合タンパク質、ＴＲＡＰの化学修飾物、またはそれらの生物活性断片からなる群より選択されるものである、請求項８に記載の方法。
前記ＴＲＡＰのタンパク質が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２または４において示されている配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは９５％超、更に好ましくは９８％超または１００％の配列同一性を有するものである、請求項８に記載の方法。