KR101284719B1

KR101284719B1 - 살모넬라 엔테리티디스에 대한 특이적 사멸능을 가지는 신규한 박테리오파지 에이취와이9001비피 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품

Info

Publication number: KR101284719B1
Application number: KR1020110015716A
Authority: KR
Inventors: 명길선; 박세훈; 안영태; 이정희; 허철성
Original assignee: 주식회사한국야쿠르트
Priority date: 2011-02-22
Filing date: 2011-02-22
Publication date: 2013-07-17
Also published as: KR20120096347A

Abstract

본 발명은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enterica serovar Enteritidis)를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 가지는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 부분 유전자 서열로 표시되는 유전체를 갖는 신규한 박테리오파지(bacteriophage) HY9001BP 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서 살모넬라 감염증 치료 및 예방을 목적으로 한 약학적조성물, 사료첨가제 및 소독제로 이용될 수 있다.

Description

살모넬라 엔테리티디스에 대한 특이적 사멸능을 가지는 신규한 박테리오파지 에이취와이9001비피 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품{The New bacteriophage HY9001BP having bacteriolysis ability against Salmonella enterica serovar Enteritidis and products containing thereof as effective component}

본 발명은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enterica serovar Enteritidis)에 대한 특이적 사멸능을 가지는 신규한 박테리오파지(bacteriophage) HY9001BP 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enterica serovar Enteritidis)를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 가지는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 부분 유전자 서열로 표시되는 유전체를 갖는 신규한 박테리오파지(bacteriophage) HY9001BP 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 사료첨가제 및 소독제에 관한 것이다.

최근 축산업에서 항생제 내성균의 출현 및 증가에 관한 문제는 여러 측면에서 매우 중요시되고 있고, 가장 많은 관심이 집중되는 분야 중 하나이다. 항생제 내성에 대한 다양한 연구가 진행되면서, 최근 항생제를 대체할 수 있는 새로운 예방, 치료기술 개발에 초점을 맞춘 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구 중 하나가 박테리오파지(bacteriophage 또는 phage)를 이용하는 기법이다. 박테리오파지를 이용한 전염성 질병치료에 관한 연구는 1915년 Twort가 처음 박테리오파지를 발견한 직후인 1917년 d'Herelle 가 가금티푸스(avian typhoid)의 원인체인 살모넬라 골리나룸(Salmonella Gallinarum)에 적용함으로서 시작되었다. 이후 1930~1940년대에는 동물에서 뿐만 아니라 사람에서도 여러 나라에서 적용하여 왔다. 그러나, 항생제의 발견으로 박테리오파지의 이용이 급감하였으나, 최근 다시 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있는데 이는 항생제에 내성을 나타내는 많은 병원성 세균에 박테리오파지를 이용하는 기법이 매우 유용한 것으로 나타났기 때문이다.

박테리오파지는 자연계에 널리 존재하고 있고, 그들의 숙주인 세균들과 공동의 환경을 공유하면서 존재하고 있다. 즉, 이러한 박테리오파지는 사람과 동물의 장관, 음식물, 토양, 물, 습지 등과 관련된 여러 환경에 이미 존재하고 있다. 한편 박테리오파지를 치료 목적으로 사용하기 위해서는 숙주세포와 박테리오파지 간에 적절한 감염률을 나타내어야 하며, 또한 숙주세포와 박테리오파지 간에 특이성 (specificity)을 나타내어야 한다. 따라서, 인체는 물론 주변 생태계에 영향을 미치지 않으면서 유해균을 용균시킬 수 있는 특이성(specificity)을 가지는 박테리오파지의 개발이 매우 중요하다.

살모넬라(Salmonella)는 사람과 동물의 급성 장관 내 감염을 유발하는 균으로, 오염된 식품을 통하여 사람에 전염될 수 있는 인수공통 전염병의 원인체이다. 돼지에 감염 시 급성패혈증, 또는 장염을 유발하여 폐사하거나 만성적인 설사 등으로 성장지연에 따라 양돈 산업에 막대한 경제적인 피해를 주는 질병이다. 이뿐만 아니라 돼지에 감염되어 있던 살모넬라균이 돈육 등에 오염되어 사람에 전파될 수 있는 매우 높은 위험성을 가진 균이다. 지금까지는 이 살모넬라균을 제거하기 위하여 대부분 항생제를 사용하여 왔다. 그러나, 양축농가에서 항생제 오용 및 남용에 따라 다양한 형태의 항생제 내성균이 출현 및 항생제 잔류 등으로 인한 안전축산물 생산에 문제점으로 부각되고 있어, 항생제를 사용한 치료가 매우 어려운 상태에 직면하고 있어서 대체 치료법이 요구되고 있고, 또한 다양한 시도들이 진행되고 있다.

이에 본 발명자들은 양돈 산업에 막대한 경제적인 피해를 주는 돼지 설사병의 효율적인 치료 대책을 수립함과 동시에 인체에 감염되었을 경우 살모넬라 감염증을 치료 목적으로, 국내 양돈장 주변 및 생활하수에서 분리한 박테리오파지 중 주요 병원균인 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enterica serovar Enteritidis)에 특이성을 나타내는 박테리오파지(bacteriophage) HY9001BP을 분리하고 살모넬라 엔테리티디스의 사멸능력을 시험관 시험 및 동물실험에서 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 인간을 포함한 동물의 감염성 병원균인 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enterica serovar Enteritidis)를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지, 이를 유효성분으로 함유하는 살모넬라 엔테리티디스에 의해 유발되는 인간 및 가축의 질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물, 사료첨가제 및 소독제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enterica serovar Enteritidis)를 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 가지는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 부분 유전자 서열로 표시되는 유전체를 갖는 신규한 박테리오파지(bacteriophage) HY9001BP 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 사료첨가제 및 소독제를 제공하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

양돈 농가 주변의 오수에서 분리한 본 발명의 박테리오파지는 이중가닥 DNA(double strand DNA)를 유전물질로 가지며, 기존의 밝혀진 Shigella boydii bacteriophage phiSboM-AG3와 염기 서열이 약 3kb 정도가 유사하나 동일하지 않은 염기서열도 존재하여 Shigella phage phiSboM-AG3와 동종에 가까운 신규한 박테리오파지임을 확인하여 박테리오파지 HY9001BP로 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2011년 1월 14일자로 기탁하였다(기탁번호:KCTC11847BP).

본 발명의 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enterica serovar Enteritidis)를 특이적으로 사멸시키는 박테리오파지 HY9001BP를 유효성분으로 함유하는 살모넬라 질환 치료 및 예방용 약학적 조성물은 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 젤라틴 등의 부형제들과 함께 이용될 수 있으며, 상기의 성분 외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 질환부위에 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구투여 또는 비경구투여를 통해 투여할 수도 있다.

본 발명의 박테리오파지 HY9001BP은 살모넬라 엔테리티디스에만 특이적으로 작용하는 것으로 경구투여 및 기타 투여방법으로 복용하였을 시에도 다른 유익균에는 영향을 미치지 않으므로 안전하다.

또한, 본 발명의 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enterica serovar Enteritidis)를 특이적으로 사멸시키는 박테리오파지 HY9001BP을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제는 건조 또는 액체상태의 제제 형태일 수 있고, 박테리오파지 HY9001BP을 단일 또는 다른 미생물과 복합으로 혼합하여 이용할 수 있으며, 사료자체 혹은 음용수에 혼합하여 공급함으로써 가축의 살모넬라 감염증을 예방 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enterica serovar Enteritidis)를 특이적으로 사멸시키는 유효성분으로 함유하는 소독제는 식품 산업에서 살모넬라 오염 방지용 소독제 및 식품첨가제로 활용될 수 있으며, 생활하수처리장에서 방류수 내 살모넬라 엔테리티디스 제거를 위한 살포에도 이용될 수 있고, 조리설비의 소독제로도 유용하게 사용될 수 있다.

이상에서와 같이, 본 발명의 박테리오파지(bacteriophage) HY9001BP는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enterica serovar Enteritidis)를 특이적으로 사멸시키는 활성을 가지고 있으며, 이를 유효성분으로 함유하는 살모넬라 감염증 치료 및 예방을 목적으로 한 약학적조성물, 사료첨가제 및 소독제로 이용될 수 있다.

도 1은 박테리오파지 HY9001BP의 유전물질에 DNA 분해효소, RNA 분해효소를 처리하여 전기 영동한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 박테리오파지 HY9001BP의 유전물질에 S1 nuclease를 처리하여 전기 영동한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 박테리오파지 HY9001BP의 유전자 염기서열 BLAST 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 박테리오파지 HY9001BP가 살모넬라 엔테리티디스에 형성한 플라크 사진이다.
도 5는 마우스의 간에서 발견된 살모넬라 엔테리티디스 균수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 박테리오파지 HY9001BP의 효능을 검사한 돼지의 폐 사진이다.
도 7은 살모넬라 엔테리티디스를 감염시킨 돼지의 폐에서 재분리한 살모넬라 엔테리티디스 검출 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.

<실시예 1>

1-1. 살모넬라 엔테리티디스에 대한 특이적 사멸능을 가지는 박테리오파지 HY9001BP의 분리

본 발명에 따른 박테리오파지는 양돈농장의 오수에서 분리되었다. 양돈 농가 주변의 오수를 희석수(saline)에 적정량 희석한 후 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액만 취하였다. 수거한 상등액을 0.45μm pore size의 필터로 여과한 후 미리 영양배지(nutrient broth)에 배양한 살모넬라 엔테리티디스 배양액 100 μL과 1:1로 반응시켰다. 37℃에서 20분간 반응시킨 후 영양배지(nutrient agar 0.7% agar) 7 mL에 섞어 영양 평판배지(Nutrient agar plate)에 도말하였다. 이 배지를 37℃에서 1일간 배양한 후 박테리오파지가 세균을 용균한 흔적인 플라크(plaque) 생성을 확인하고 멸균된 팁(tip)으로 플라크를 선발하여 다시 숙주인 살모넬라 엔테리티디스와 반응시켜 순수배양 하였다.

1-2. 박테리오파지 HY9001BP의 유전물질 확인

상기 실시예 1-1의 박테리오파지 HY9001BP의 유전물질을 알아보기 위해 숙주인 살모넬라 엔테리티디스와 박테리오파지 HY9001BP를 반응시켜 박테리오파지 HY9001BP를 대량 배양하였다. 영양배지(nutrient broth) 100mL에 미리 살모넬라 엔테리티디스 1mL와 박테리오파지 HY9001BP 분리액 10mL를 동시에 접종하여 37℃ 배양기에서 1일간 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 4000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액만 수거하고, 상층액을 다시 0.45μm pore size의 필터로 여과하여 박테리오파지 HY9001BP만 순수 분리하였다. 남아있는 살모넬라의 DNA와 RNA를 제거하기 위해 여과한 배양액 10mL을 DNase I과 RNase A를 각각 200 Units 씩 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이 용액에 0.5M EDTA를 500μL 첨가하여 다시 37℃에서 10분간 반응시키고 여기에 20mg/mL의 proteinase K를 100μL, 10% SDS solution을 500μL 첨가하고 55℃에서 3시간 동안 반응시켜 박테리오파지 HY9001BP의 단백질 캡시드(protein capsid)를 제거하고 유전물질을 노출시켰다. 이 용액에 동량의 PCI(phenol:chloroform:isoamylalchol=25:24:1)용액을 첨가하여 잘 섞어주고 4,000rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 분리된 용액 중 상층액을 취하여 2배량의 에탄올을 첨가하여 순수한 유전체(genome)를 추출하였다. 추출한 박테리오파지 HY9001BP의 유전물질이 DNA인지 RNA인지 확인하기 위해 DNase I 과 RNase A를 각각 처리하여 37℃에서 30분간 반응시키고 0.8% 아가로즈(agarose) 젤을 이용한 전기영동을 실시하여 각 효소에 의한 절단 양상을 조사하여 유전물질의 상태를 확인하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

lane 1은 DNA marker를 나타내며, lane 2는 박테리오파지 HY9001BP 유전물질의 전기 영동한 결과를 나타내고, lane 3은 박테리오파지 HY9001BP의 유전물질에 DNase I 처리한 후 전기 영동한 결과를 나타내며, lane 4는 박테리오파지 HY9001BP의 유전물질에 RNase A를 처리한 후 전기 영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 박테리오파지 HY9001BP의 유전물질이 DNase I에 의해서만 분해되는 것으로 보아 박테리오파지 HY9001BP은 DNA를 유전물질로 가지는 박테리오파지임을 알 수 있었다.

1-3. 박테리오파지 HY9001BP의 DNA 특성

상기 실시예 1-2에서 박테리오파지 HY9001BP의 유전물질이 DNA임을 확인하고, 이 DNA에 한가닥 DNA(single strand DNA)만을 선택적으로 분해시키는 S1 nuclease를 처리하여 37℃에서 10분간 반응시키고 0.8% 아가로즈(agarose) 젤을 이용한 전기영동을 실시하여 DNA의 상태를 확인하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다.

lane 1은 DNA marker를 나타내며, lane 2는 박테리오파지 HY9001BP DNA를 전기 영동한 결과를 나타내고, lane 3은 박테리오파지 HY9001BP의 DNA에 S1 nuclease를 처리한 후 전기 영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 한가닥 DNA 특이적 뉴클리아제(nuclease)에 분해되지 않은 것으로 보아 박테리오파지 HY9001BP의 유전물질은 이중가닥 DNA임을 알 수 있었다.

1-4. 박테리오파지 HY9001BP의 일부 유전자 서열분석

상기 실시예 1-2의 분리된 박테리오파지의 DNA를 제한효소인 Sau3A I 효소로 잘라 작은 조각의 DNA로 만들고 DNA 라이브러리를 통상의 방법에 따라 구축하였다. 또한, 제한효소인 BamH I으로 pBlue KS(+) 벡터를 자르고 CIAP(calf intestinal alkaline phosphate)를 처리하여 벡터 조각을 준비하였다. 이렇게 준비된 박테리오파지 HY9001BP의 유전자 단편과 벡터를 섞어 T4 ligase를 이용하여 통상의 방법대로 결합시켰다. 이렇게 준비된 박테리오파지 HY9001BP의 유전자 단편이 도입된 재조합 벡터를 대장균의 한 종인 DH5α에 도입시켜 형질전환시켰다. 이렇게 형질전환된 콜로니(colony)를 대량 배양한 후 플라스미드를 정제하고 통상의 염기서열 분석법에 따라 염기서열을 분석하였다. 이렇게 확보한 박테리오파지 HY9001BP의 일부 유전자 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 5로 제시하였다.

1-5. 확보된 박테리오파지 HY9001BP의 유전자 서열과 기존 박테리오파지의 유전자 서열과의 비교

상기 실시예 1-4의 박테리오파지 HY9001BP의 일부 유전자 서열을 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)를 이용하여 기존의 알려진 유전자와의 상동성을 조사하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 서열번호 1은 Salmonella phage Vi01 complete sequence와 94%, Shigella phage phiSboM-AG3와 89%, Serratia phge KSP90 orf1 to orf11과 83%의 상동성을 보였다. 서열번호 4는 Esherichia phage PhaxI topoisomerase II medium subunit과 97% 상동성을, Shigella phage phiSboM-AG3와 86%의 상동성을 보이며, Salmonella phage Vi01 compelete sequence와도 80%의 상동성을 보였다. 서열번호 5는 Salmonella phage Vi01 complete sequence와 82%의 상동성을, Shigella phage phiSboM-AG3와 92%(상동성을 보인 부분의 길이가 짧음)의 상동성을 보인 반면에, 서열번호 2와 서열번호 3은 어떤 미생물의 유전자와도 상동성이 없음을 나타내었다.

Salmonella phage Vi01은 총 유전자 염기서열이 157kb로 염기서열은 모두 알려져 있으나, 기능성과 분류학적 위치는 연구된 바 없다. Shigella phage phiSboM-AG3는 이중가닥 바이러스로 Caudovirales, Myoviridae에 속하는 박테리오파지로서, 역시 염기서열 분석만 되어 있고, 기능성은 밝혀진 바가 없다. 본 발명에서의 박테리오 파지 HY9001BP은 염기서열 중 약 3kb 정도가 Salmonella phage Vi01과 Shigella phage phiSboM-AG3와 유사하나 전혀 동일하지 않은 염기서열도 존재하므로 이들에 가까운 신규의 박테리오파지임을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 신규한 박테리오파지를 HY9001BP로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2011년 1월 14일자로 기탁하였다(기탁번호:KCTC11847BP).

<실시예 2>

박테리오파지 HY9001BP를 포함한 동결건조분말제조

상기 실시예 1의 박테리오파지 HY9001BP를 영양배지(nutrient broth)에 숙주인 살모넬라 엔테레티디스와 100:1의 비율로 섞어 접종하고 37℃ 배양기에서 20시간 동안 진탕배양하였다. 이것을 4000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 수거하고, 수거한 상층액을 다시 여과하여 숙주인 살모넬라를 제거하였다. 박테리오파지 용액과 보존제인 덱스트로스를 1:1의 비율로 섞어 동결건조하여 분말을 만들었다.

한편, 본 발명의 박테리오파지 HY9001BP는 상기와 같이 동결건조된 분말 형태 또는 배양물 형태로 제공될 수 있다.

<실시예 3>

박테리오파지 HY9001BP을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제조

액상 제제의 제조

본 발명의 박테리오파지 HY9001BP을 숙주인 살모넬라 엔테리티디스에 감염시켜 수득한 상등액을 여과하여 여과액을 준비하였다. 박테리오파지 HY9001BP의 농도를 측정하고 영양배지(nutrient broth)에 1X10⁹pfu/mL의 양으로 준비하여 살모넬라 사멸용 액상제제를 제조하였다.

분말형 제제

상기 실시예 2의 박테리오파지 HY9001BP의 동결건조분말 100㎎에 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<실시예 4>

박테리오파지 HY9001BP을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제의 제조

상기 실시예 2의 박테리오파지 HY9001BP의 동결건조분말 0.01~10중량% 범 위내로 일반적인 사료첨가제의 조성에 따라 첨가하였다. 사료첨가제는 가축의 종류에 따라 그 조성 및 제조방법을 달리하므로 본 발명에서는 그 조성 및 제조방법을 특별히 한정하지 않는다.

<실시예 5>

박테리오파지 HY9001BP을 유효성분으로 함유하는 소독제의 제조

상기 실시예 1의 박테리오파지 HY9001BP의 동결건조분말 0.01~10중량% 범위 내로 포함하고, 통상적으로 이용되는 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 미네랄 오일, 유화제, 윤활제, 향미제, 현탁제 등을 포함하는 소독제를 일반적인 소독제 제조방법에 따라 제조하였다. 그러나, 본 발명에서는 그 조성 및 제조방법을 특별히 한정하지 않는다.

<시험예 1>

박테리오파지 HY9001BP의 배양 및 플라크(plaque) 형성도 확인

박테리오파지 HY9001BP 배양액 100μL를 준비하고, 살모넬라 엔테리티디스( Salmonella enterica serovar Enteritidis)를 영양평판배지(Nutrient agar plate)에 도말하고 그 위에 5μL의 박테리오파지 HY9001BP 배양액를 떨어뜨린 후 37℃에서 24시간 배양하여 플라크의 형성을 확인하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 박테리오파지 HY9001BP의 살모넬라 엔테리티디스의 특이적 사멸능에 의하여 평판 배지에 뚜렷한 플라크를 형성함을 확인할 수 있었다.

<시험예 2>

마우스 생체 내에서의 박테리오파지 HY9001BP의 효능 실험

살모넬라 엔테리티디스와 박테리오파지 HY9001BP을 각각 그룹별로 표 1에서와 같이 각각의 CFU와 그에 따른 MOI(Multiplicity of Infection)로 경구투여 시킨 후, 4일간 임상증상과 사료, 음수 섭취현황을 측정하였으며, 마지막 날 안락사 시킨 후, 간·비장·소장·분변 등 장기를 채취하여 병변을 관찰하였고, 엑스엘디 평판배지(XLD agar)를 이용하여 투여한 균의 존재여부를 확인하였다.

실험쥐에 살모넬라 엔테리티디스와 박테리오파지 HY9001BP를 접종하고 4일간 임상증상을 관찰한 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 4일 째에 살모넬라 엔테리티디스 병원균만 접종한 대조군에서는 2마리의 쥐가 높은 병징을 보였고, 비교적 낮은 농도로 박테리오파지 HY9001BP를 접종한 실험군 1(MOI 값 1)은 1마리에서 낮은 임상증세를 보였으며, 높은 농도로 박테리오파지 HY9001BP를 접종한 실험군 2(MOI 값 10)에서는 아무런 병징이 나타나지 않았다.

또한, 살모넬라 엔테리티디스와 박테리오파지 HY9001BP를 투여한 후 5일째에 마우스를 부검하여 간에서의 살모넬라 엔테리티디스의 균수를 측정하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군에 비하여 박테리오파지 HY9001BP를 고농도로 처리한 실험군 2의 마우스의 간에서는 살모넬라 엔테리티디스가 발견되지 않았다.

실 험 군	두 수	병원균의 수 (cfu/mL)	MOI(박테리오파지/병원균)
무처리군	5	-	-
대조군	5	10⁹	-
실험군 1	5	10⁹	1
실험군 2	5	10⁹	10

* Physical condition: (body texture, food, water and movement)

a = normal, b= sick, c= bad, D= dead

<시험예 3>

돼지 생체 내에서의 박테리오파지 HY9001BP의 효능 실험

공시돼지로는 국내 양돈장에서 구입한 교잡종으로, 5~6주령의 돼지 9마리를 사용하였다. 공시돼지의 실험군 설정은 아래의 표 3과 같고 각각의 실험군에 3두씩 공시하였다.

무처리군	식염수 5 mL 경구투여
대조군	식염수 5 mL + 살모넬라 배양액 5 mL 경구투여
실험군	박테리오파지 HY9001BP 배양액 5 mL + 살모넬라 배양액 5 mL 경구투여

* 박테리오파지 HY9001BP 배양액: 1.5 x 10¹¹ PFU/mL,

살모넬라 엔테리티디스 : 1.5 x 10⁸ CFU/mL

위의 표 3에서와 같이, 투여 후 5일, 10일, 15일째 되는 날 각 돼지의 체온을 측정하고, 육안적 임상증상 및 사료, 음수 섭취현황을 관찰하였다. 투여 후 15일째 되는 날 돼지를 안락사 시킨 후 폐, 장, 림프절 등 장기를 채취하여 균 검색을 위한 공시재료로 사용하였고, 또한 육안적인 병변 검사를 통하여 박테리오파지 HY9001BP의 효능 평가를 위한 자료로 사용 하였다.

살모넬라 엔테리티디스와 박테리오파지 HY9001BP을 경구 투여한 후 각 그룹별 돼지의 임상증상 발현 양상을 관찰한 결과, 살모넬라 엔테리티디스만을 투여한 대조군에서는 투여 5일째부터 외형 및 분변의 상태에서 변화를 보이기 시작하여 관찰 15일째에서는 증상이 더욱 악화되었다. 그러나, 살모넬라 엔테리티디스와 박테리오파지 HY9001BP를 동시에 투여한 실험군에서는 관찰 15일째에 피모만 다소 거칠어지는 것을 확인할 수 있었고 다른 병징은 없었다.

또한, 살모넬라 엔테리티디스와 박테리오파지 HY9001BP를 투여한 후 15일째에 부검을 실시하여 육안적 병리학적 검사를 실시하였다.

그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 무처리군에서는 모든 장기가 정상적이었으나, 살모넬라 엔테리티디스만을 투여한 대조군에서는 모든 돼지의 장간막 임파적이 크게 증대되고 염증반응이 진행되고 있었으며 심한 폐렴이 나타났고(도 6 참조) 부검한 폐로부터 살모넬라 엔테리티디스를 분리할 수 있었다(도 7 참조). 그러나 살모넬라 엔테리티디스와 박테리오파지 HY9001BP를 동시에 투여한 실험군에서는 폐장 등 다른 장기에 어떠한 변화도 관찰할 수 없었다.

한국생명공학연구원

KCTC11847BP

20110114

<110> KOREA YAKULT CO.,LTD <120> The New bacteriophage HY9001BP having bacteriolysis ability against Salmonella enterica serovar Enteritidis and products containing thereof as effective component <130> P10-59 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 828 <212> DNA <213> Bacteriophage HY9001 partial gene <400> 1 gcgcctttgt atgccagggt gatatattct gctacagcat acgggtcaac agccagttta 60 gtgttttcct gcagaaccgg agcatagtcc agcatgccag acatcgccag agcggatgcc 120 acgttcggag aacacagaac acggttgcct ttaccacgac gggtgtcaac accgataccg 180 ttcgcttcaa cttccagcat gaaagtcagg aacttccatt tttccagcgc ccaacgaccg 240 gagatgtcct gcgcgatatc aacaacaccg ttggtgccga attttttgaa gcgaacagca 300 ctgaagttca tggtacggat gaattcacgg ttcatttccg cctgaatttc agttaccatc 360 acgtcagaca ggatattatc cacgtcttcg ccgtgaattg ccatcatgtc ctgacgcagt 420 tcatggctgt aatcagcgta caggccgcga gacttggcag taacggtcgc tttctgaaca 480 gtgataccaa cacgcgccca cggattggtg gtagtaccca gcagttcagc gtcacttgac 540 ggcatacctt taccgatagt ggtcacgcca gagccagaac cttcgatttc agcctgacta 600 aagccagacg ggtcgccagc ctgtacagta ccatcaccgg aatagccgga atcggcttcc 660 tgcatgaaac agttctttac gagactgtgc ggtgttggaa ctgtcaccaa cgccctggcg 720 agcgcgcagt gcaaagatct gaccgtcagg accagacagc ggctgaacac cgaagaagtc 780 catcgcgatg ttgatcagcg ccagacgttt ttgccatgtc gatcagaa 828 <210> 2 <211> 300 <212> DNA <213> Bacteriophage HY9001 partial gene <400> 2 ggagttgccg atggttaatt ttgaaggtac tggtagcttg aaggcaaatt ctggtagtag 60 cttccttatc aaaaccggtg ggacattatc attaattggg cttgctggta tatctacaga 120 tggcggccat atgtttagag tctccaccac ggaaaaagta aacatacata ctaactgccc 180 agtggattct ggtgcggcct atgttgtact aagtgagatt cagggtaata ttgaatacag 240 gcaattattc tattctgtaa attgttctaa gtatgtaggt gcaacagctg gacaaactat 300 300 <210> 3 <211> 338 <212> DNA <213> Bacteriophage HY9001 partial gene <400> 3 attgataaaa tagggactcc agaattaaaa gagtccctga aataatcaat gtctagcggg 60 gagaactccc actggttcga taccttccat caccagggag ttcaccccaa catcactcat 120 tcgaatccat actttaccgc ctggtcttat ttcatagatg ttcatttcat tacccacagc 180 agatccatta acgaaaacac cctgagtggc aattcgaatc ggagatttgg tgttattaac 240 tatctgaaat gatattgcaa cgtctctggt gatttcgacg tcccttgctt gagtattcct 300 tctgagtttg tcaaagaaag aaggattgaa agtcgcta 338 <210> 4 <211> 985 <212> DNA <213> Bacteriophage HY9001 partial gene <400> 4 tctagaacta gtggatcctc ttcgctgctc ttgaatacaa caaggaggag attgttgacc 60 gccttggcat gttcgccgcc gctcgcacga attacaaatc tggtggtgag aacatgagcg 120 gtacgatcgt gaacatggct caggggttcc caggtacgaa caacatccca tactttgacc 180 gcgatggcca gtttggttca atcatggggc gcgaagcgtc ttccgctcgt tatatttcag 240 tggcagtgtc tgaagttatc cgtaagatct tccgaaagga ggacgatggg atattggaat 300 acaattatct tggggaagag aaactggagc cgaaattctt tttacccatc ctgcccatgt 360 ttctcgtgaa tggtatcaat ggtatcggct cgggttatgc caccgacacc ccatgccact 420 gcgttaagtc cgtgctcagt gccctgagag cacttctccg tggcgaagac ccgaaggact 480 taaaaccgta ctggaatggt ttcaaaggag agacaggcta tactgaggaa ggaagagcat 540 acagtcgtgg attgttcacc cgcgttaatg caaccacttt gaacatcacc gaggttccta 600 ttggttggtt ctctaaaacc tatgagacca aagtgctgtt gcctctgtac aaggcgggtg 660 tcctcactga gtacgccaac gatacgaccg aagatggttg ggatatcact gttgtattca 720 agcggggtga attgtctaag ttgaatgacg aacaggttga acagatgttc cgtctctact 780 cagctaataa gcccgtgtgg acagcttggg atgaagatgg tgttattcac cgttacgatg 840 gttggaaaga tatgttgctt ccatttttca attatcgcct gagtcgctat gaagataaac 900 gtcagtatct tatcaaggaa ttgaccgaca aaatacaccg tttgaacaat cgtgccatat 960 tcattgggtg ggctgtcgtt acaga 985 <210> 5 <211> 888 <212> DNA <213> Bacteriophage HY9001 partial gene <400> 5 ccattcgtcc tcctttcgga agacttacgg ataacttcag acactgccac tgaaatataa 60 cgagcggaag acgcttcgcg ccccatgatt gaaccaaact ggccatcgcg gtcaaagtat 120 gggatgttgt tcgtacctgg gaacccctga gccatgttca cgatcgtacc gctcatgttc 180 tcaccaccag atttgtaatt cgtgcgagcg gcggcgaaca tgccaaggcg gtcaacaatc 240 tcctccttgt tgtattcaag agcagcgaag aggatcttgc gctggcttgg cttcaggctg 300 tcaatcagct gagggatttg acggatgctg ttgaccacgg aaaactcctt gtggtcggtg 360 ttgacaaagt ccgttacagt aatgctcttg gcaaccatct tattcatcct cggtttcaaa 420 taggcaaaca tcgctaaacc aggttttgcg gtaatcggcg gcctcatcac cgaagccatt 480 cttcagtgac tgcttgtatc catcgtccag cgtgaccgtc gtagtatacg catccaggtt 540 gtttagaata cgcttgaagt cttcagtgct gttaccgcca agacctttca gatatttctt 600 cttcgtgatc ttcttggcgt ctggtgtctt caggaactcc tcatattcgg cattgttcat 660 gaattcatgc attatattac cacaccacac gcgcatgtat ggagtacgaa ggagcttcag 720 cctaccctga cgaacgtatt caggccagaa cgtacaatac agagttatta acaacccacg 780 gatgtgaatg ccgtcgtcat ccgcgtctgt tgccacgacg gtctgtggat agcgactgat 840 atcaagcggc tggcctggca cagcaccgcc gtgaatgggt gcataaat 888

Claims

삭제
살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enterica serovar Enteritidis)에 대한 특이적 사멸능을 가지며, 서열번호 1 내지 서열번호 5의 유전자 서열로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지 HY9001BP(기탁번호: KCTC11847BP).
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제2항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제.
제2항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제.