CN112680375A

CN112680375A - 产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌hd及其应用

Info

Publication number: CN112680375A
Application number: CN202011579100.6A
Authority: CN
Inventors: 王志新; 贾英民; 宁亚维; 鲁雷震; 宏丹; 刘洋; 封成玲; 贾紫伟
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112680375B

Abstract

本发明属于发酵工程技术领域，公开了一种产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD及其应用，该菌株于2020年8月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20505。本发明提供的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD生长快、适应性好且发酵成本低，通过本发明的发酵方法产生的抗菌肽稳定性好、抗菌谱广，能够抑制多种细菌和真菌，尤其表现出优异的抗真菌活性，可有效抑制酵母菌和丝状真菌的活性；且该菌株还可用于生产生物防腐剂和抗菌剂，所得产品用于食品防腐和畜禽无抗养殖等生物防治领域。

Description

产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD及其应用

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种爱媛类芽孢杆菌，具体地说是一种产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD及其应用。

背景技术

细菌、真菌等微生物已造成如食物污染、植物病害、人类感染等各种问题，给人们的生活和生产带来极大危害，且随着微生物对抗菌药物耐药性的增加，导致其防治日益困难；传统的合成类抗菌药物具有药物残留和毒副作用，已不能满足需求，因此，无论在食品工业、畜禽养殖业，还是医药行业和植物防治领域，都急需开发安全高效的抗菌剂。

抗菌肽作为生物机体天然防御分子有着成为安全高效抗菌剂的前景广阔，目前，研究发现枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、苏云金杆菌、蜡状芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌等发酵产生的抗菌肽多具有抑制细菌作用，而抗真菌作用不足。

类芽孢杆菌分泌的多种胞外抗菌物质，对多种致病菌具有抑制活性，但国内外关于爱媛类芽孢杆菌抗菌性研究的报道还不多。2009年南京农业大学的陆承平教授团队报道了一株具有抗细菌的爱媛类芽孢杆菌NJ2008，但未见其抗真菌性描述，也未提及其代谢物质；公告号为CN110257269A的中国发明专利申请公开了一株产细菌素的爱媛类芽孢杆菌NPUST-1，该菌株所产细菌素蛋白对细菌具有抑制作用，但对真菌的抑制效果一般。目前对爱媛类芽孢杆菌抗真菌性多肽的开发远远不足，因此，抗真菌效果好的抗菌肽有着广阔的应用前景。

发明内容

本发明的一个目的，是要提供一种产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD，该菌株生长快、适应性好且发酵成本低，经发酵培养所生产抗菌肽的抗真菌效果优异；

本发明的另一个目的，是要提供上述产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的两种应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2020年8月7日，保藏编号是CGMCC No.20505，拉丁文名称为Paenibacillus ehimensis HD。

其16S rDNA序列全长为1374bp，具体序列为：

CTGGCTCCTTGCGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTCTTAGGATTGGCTCCATCTCGCGACTTCGCTTCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGTTCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCTCCTCTGTCCCGAAGGCCTACCCTATCTCTAGGATATTCAGAGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCACTCTTGCGAGCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGTGTTTACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGGCCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTCCTCTCCTGCACTCAAGCCGCCCAGTTTCCAGTGCGAACCGGGGTTGAGCCCCGGGCTTAAACACCAGACTTAAGCGGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGGCTTTCTTCTCAGGTACCGTCATTCGCAGAGCAGTTACTCTCCGCGACGTTCTTCCCTGGCAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTGCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCAGGCCCATCTGTAAGCCACAGGTTGCCCCGTGTTTCTTGATCCTCTCATGCGAGAAGATCACTTATCCGGTCTTAGCTACCGTTTCCGGTAGTTATCCCGGTCTTACAGGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAGC。

本发明还提供了产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的一种应用，所述产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD发酵时，产生含抗菌肽的发酵液。

作为一种限定，它是将所述产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD接种于改良发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为220-240r/min的条件下发酵，即得所述含抗菌肽的发酵液。

作为进一步限定，所述发酵培养的时间为18-32h。

作为进一步限定，制成所述改良发酵培养基的有效成分的原料每100重量份包括：碳源0.25-2.0份、氮源0.5-2.5份、无机盐0.1-0.7份和余量的水。

作为再进一步限定，所述碳源为可溶性淀粉、蔗糖和甘露醇中的至少一种；所述氮源为玉米浆粉和/或蛋白胨；所述无机盐为硫酸镁和/或氯化镁。

作为更进一步限定，所述改良发酵培养基的初始pH值为6.5-7.5。

作为另一种限定，所述产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD产生的抗菌肽可抑制细菌和真菌生长，所述细菌和真菌包括：金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、志贺氏菌(Shigella Castellani)、沙门氏菌(Salmonella)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、产黄青霉(Penicillium Chrysogenum)、扩展青霉(Penicillium expansum)、总状毛霉(Mucorracemosus)、白假丝酵母(Candida albicans)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤克鲁维酵母(Pichia kluyveri)和胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。

本发明还提供了上述产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌的另一种应用，所述产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD用作制备抗生素替代品、食品防腐剂或饲料添加剂，应用于食品防腐和畜禽养殖。

由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

(1)本发明提供的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD生长快、适应性好、发酵成本低；

(2)本发明提供的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的发酵过程中培养基适合爱媛类芽孢杆菌HD生长，发酵方法简单易操作，能提高抗菌肽产量；发酵所得的抗菌肽具有广谱抗菌特性，能够抑制多种细菌和真菌生长，尤其表现出优异的抗真菌活性，能够很好地抑制酵母菌和丝状真菌生长；

(3)本发明提供的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD用途广泛，可用于制备抗生素替代品、食品防腐剂或饲料添加剂，对于食品的防腐、动物无抗养殖等，具有高效、安全的特点；

本发明提供的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD具有较高的工业应用潜力，尤其是在抑制腐败真菌方面表现出良好的抗菌效果，可应用于食品防腐和畜禽养殖等生物防治领域。

附图说明

图1是本发明实施例1中菌株HD在固体培养基上的菌落形态图；

图2是本发明实施例1中菌株HD的革兰氏染色结果图；

图3是本发明实施例1中菌株HD的系统发育树图；

图4是本发明实施例8中采用优化前/后发酵方法的抗菌肽产量结果图；

图5是本发明实施例9中X1-X8组蛋白酶处理后爱媛类芽孢杆菌HD的发酵液F2结果图；

图6是本发明实施例9中Y1-Y9组耐热性处理后爱媛类芽孢杆菌HD的发酵液F2结果图；

图7是本发明实施例10中爱媛类芽孢杆菌HD传代稳定性检测结果图；

图8是本发明实施例11中爱媛类芽孢杆菌HD抗菌肽对产黄青霉、毛霉、黑曲霉、黄曲霉、白假丝酵母和裂殖酵母产生抑菌圈的效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，应当理解，所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

实施例1产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的筛选与鉴定

(1)菌株的分离筛选

从河北、江苏等地采集40多份土壤样品，在营养琼脂培养基上，采用平板抗菌法，以金黄色葡萄球菌和产黄青霉作为指示菌，以能够产生抑菌圈作为筛选依据，进行菌株的初步筛选；经过筛选，获得5株能够抑制细菌和真菌指示菌生长的菌株，分别编号为MH、XM、YM、HD和GL；进一步对这5株菌株的发酵液进行抑菌圈实验，记录对金黄色葡萄球菌和产黄青霉的抑菌圈直径，结果如表1：

表1菌株的筛选

菌株编号	对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径(mm)	对产黄青霉的抑菌圈直径(mm)
			MH	9.67±0.22	11.0±0.147
XM	8.09±0.12	8.60±0.125
			YM	17.45±0.44	9.85±0.153
HD	13.75±0.32	15.50±0.146
			GL	10.45±0.12	14.35±0.214

从5株菌株中筛选获得菌株HD，该菌株对两种指示菌产生的抑菌圈直径较大、综合抗菌效果好，尤其对真菌的抑制能力最好。

(2)菌株的鉴定

A1)形态鉴定：

将菌株HD接种到营养琼脂平板上，划线倒置37℃培养24h，观察菌落边缘特征、透明度、隆起形状、光泽度、颜色、形态、大小，并进行革兰氏染色，在显微镜下观察其状态，菌落形态如图1所示，革兰氏染色结果如图2所示；

观察与染色结果为：菌株HD在营养琼脂平板上菌落形态较大，呈圆形，表面湿润，菌落隆起，颜色为乳白色；经革兰氏染色为革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状，产芽孢。

A2)分子鉴定：

委托上海生物工程股份有限公司进行菌株HD的分子鉴定，经过菌株的16S rDNA序列同源性分析，菌株HD 16S rDNA序列全长为1374bp，具体序列如下：

利用NCBI进行BLAST分析比对，结果如表2所示，菌株HD与Paenibacillusehimensis进化距离最近，同源性最高，均达到99％，将菌株HD的16S rDNA序列提交GenBank，登录号为MT186159；

表2 16S rDNA序列同源性鉴定结果

根据上述结果构建菌株HD的系统发育树，结果如图3所示，菌株HD与Paenibacillus ehimensis HNSQJYH 130和Bacillus ehimensis KCTC3747同源性高，进一步与Paenibacillus ehimensis的标准菌株进行比对，发现菌株HD与Paenibacillusehimensis KCTC3748^T(AY116665)的同源性为98.76％，综合该菌株的16S rDNA序列比对结果、生理生化特性以及形态特征，鉴定该菌株为爱媛类芽孢杆菌Paenibacillusehimensis，将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2020年8月7日，保藏编号是CGMCC No.20505，拉丁文名称为Paenibacillus ehimensis HD。

实施例2-7产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的发酵方法

实施例2-7分别为一种产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌的发酵方法，具体为：按照表3称取碳源、氮源、无机盐、蒸馏水后，混匀，调节pH值，121℃灭菌25min后制得改良发酵培养基；将爱媛类芽孢杆菌HD接种于相应改良发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为220-240r/min的条件下发酵18-32h；它们的不同之处仅在于原料、用量、初始pH值及工艺参数的不同，具体详见表3：

表3产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的发酵方法参数一览表

其中，发酵时间为短时间发酵时发酵产物产量较高的时间。

实施例8产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的发酵方法效果鉴定

分别采用实施例2的发酵方法(优化后)和传统发酵方法(优化前)利用爱媛类芽孢杆菌HD进行长时间发酵生产抗菌肽，在发酵时间0-60h中每隔10h分别记录采用优化前/后发酵方法的抗菌肽产量，结果如图4所示；

由图4可知，相较于采用优化前的传统发酵方法，采用本发明实施例2的优化后发酵方法抗菌肽产量在发酵15-35h均显著更高，发酵32h活性达到最高值，与未优化前相比提高了3.63倍，表明本发明的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的发酵方法提高抗菌肽产量效果明显。

实施例9爱媛类芽孢杆菌HD所产抗菌物质的化学本质鉴定

为证明爱媛类芽孢杆菌HD采用本发明实施例2的发酵方法产生的发酵液F2中抗菌物质的化学本质为多肽类，即所产抗菌物质确实为抗菌肽，进行如下实验：

B1)过氧化氢的排除

将发酵液F2在80℃条件下水浴加热15min，再加入10mg/mL的过氧化氢酶液，以未处理的发酵液F2作对照，利用琼脂扩散法测定发酵液抗菌活性的变化；

结果显示，对发酵液F2水浴、加过氧化氢酶处理后，发酵液抗菌活性受到的影响很小，可初步确定发酵液F2中抗菌物质的化学本质不是过氧化氢。

B2)蛋白酶处理

分别配制10mg/mL的蛋白酶E溶液、蛋白酶K溶液、木瓜蛋白酶溶液、碱性蛋白酶溶液、胃蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液和过氧化氢酶溶液，将发酵液F2与各种酶溶液分别等量混合，在各种酶最适温度下温浴2h，100℃下水浴灭酶5min，pH调至初始值，利用琼脂扩散法测定抗菌活性的变化，作为X1-X7组，以未处理的溶液作为对照组X8。

结果如图5所示，发酵液F2对蛋白酶E敏感，抗菌活性消失；对碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶较敏感，抗菌活性降低较少；表明发酵液F2中抗菌物质的化学本质主要为蛋白质或多肽。

B3)耐热性处理

取发酵液F2分成12组，每组5ml，分别放置于20℃、30℃、37℃、50℃、60℃、80℃、100℃条件下静置2h，作为Y1-Y7组，以在121℃静置20min和常温条件下静置2h的发酵液F2作对照组Y8-Y9，利用琼脂扩散法测定抗菌活性的变化；

结果如图6所示，Y4-Y7组的发酵液F2，抗菌活性分别为72.46％、63.46％、53.51％和54.53％；Y8组的发酵液F2仍然保留28.90％的抗菌活性，高温下未被灭活；进一步证明发酵液F2中抗菌物质即爱媛类芽孢杆菌HD菌株所产抗菌物质以多肽类为主。

实施例10爱媛类芽孢杆菌HD传代稳定性鉴定

菌株在传代过程中易发生变异，导致其产生抗菌肽的性状消失，为了保证爱媛类芽孢杆菌HD的稳定性，对菌株进行了传代稳定性测定；

将爱媛类芽孢杆菌HD依次进行8次传代培养，37℃培养24h观察菌落及菌体形态；

结果显示，菌落及菌体形态未发生变化，菌落呈乳白色，表面光滑；革兰氏染色为紫色，为革兰氏阳性细菌、杆状；菌株在传代培养过程中，所产抗菌肽抗菌活性如图7所示，均未发生明显变化，与原始菌株保持相同的特征，因此，爱媛类芽孢杆菌HD传代稳定性高，具有良好的遗传稳定性，适于大规模生产使用。

实施例11爱媛类芽孢杆菌HD抗菌肽抗菌效果鉴定

采用琼脂扩散法测定爱媛类芽孢杆菌HD抗菌肽的抑菌谱，指示菌主要包括常见的腐败真菌和病源性细菌，具体如表4所示，对真菌抑制效果见图8；

表4爱媛类芽孢杆菌HD所产抗菌肽的抑菌效果

注：“+++”表示抑菌圈直径>15mm，“++”表示15mm≥抑菌圈直径≥10mm，“+”抑菌圈直径<10mm

结果表明，爱媛类芽孢杆菌HD抗菌肽抑菌谱广，对所测定的菌株均有抑制作用，尤其对产黄青霉、扩展青霉、黑曲霉、总状毛霉、白假丝酵母、裂殖酵母、毕赤克鲁维酵母和胶红酵母这些真菌抑菌效果好；

根据菌种特性，爱媛类芽孢杆菌HD抗菌肽对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、志贺氏菌属(Shigella Castellani)、沙门氏菌属(Salmonella)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、产黄青霉(Penicillium Chrysogenum)、扩展青霉(Penicillium expansum)、总状毛霉(Mucor racemosus)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤克鲁维酵母(Pichia kluyveri)和胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，均有一定的抑菌效果。

实施例12产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD在食品防腐中的应用

一)在草莓保鲜中的应用

草莓在放置过程中容易引起腐烂，主要是由于丝状真菌如黑曲霉、青霉等造成的。

将爱媛类芽孢杆菌HD的发酵液应用于草莓保鲜：

实验组C：将重量一致的60个草莓随机分3个小组，每小组20个，分别

浸没于发酵液F2中5min；

对照组C：将重量一致的60个草莓分3个小组，每小组20个，分别浸没

于无菌水5min；

实验组C和对照组C的草莓浸泡后捞出分别滤去水分，摆放于泡沫盘中，置于室温，在第1、2、3天定期观察草莓重量的变化和腐烂情况，计算各小组草莓保鲜过程中的腐烂率，整理实验组C和对照组C腐烂率，结果见表5；

表5草莓保鲜过程中的腐烂率

由表5可知，3天内对照组C的腐烂率均明显高于对照组，且第3天对照组C的腐烂率是实验组C的2.8倍；结果表明，产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的发酵液F2在草莓保鲜中防腐效果明显，即爱媛类芽孢杆菌HD可用于延长果蔬保藏期。

二)在低糖玫瑰花酱防腐中的应用

在玫瑰花酱的腌制中一般加入60％-70％的糖，但对高糖人群不适用，低糖含量的花酱更适应现代低糖、低盐的健康饮食需求，低糖食品糖含量一般低于40％，但在腌制或保藏中容易发生真菌污染，引起腐败；

将爱媛类芽孢杆菌HD的发酵液应用于低糖玫瑰花酱防腐：

实验组D：腌制1kg蔗糖量为30％的低糖重瓣红玫瑰花酱过程中添加发酵液F2150g；

对照组D：腌制1kg蔗糖量为30％的低糖重瓣红玫瑰花酱过程中添加150g蒸馏水；

在添加后第1-7天每天观察腐烂情况；

结果记录：添加后的第3-4天，对照组D开始出现腐败真菌，玫瑰花酱上观察到白色菌丝，实验组D未出现真菌污染；第6-7天对照组D产生黑色孢子；

结果表明，爱媛类芽孢杆菌HD的发酵液F2在低糖玫瑰花酱腌制过程中防腐效果明显，有效抑制腐败真菌出现，表明爱媛类芽孢杆菌HD的发酵液F2对真菌污染具有一定的控制作用，爱媛类芽孢杆菌HD可用于低糖玫瑰花酱防腐，用于制备食品防腐剂。

实施例13产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD在畜禽无抗养殖中的应用

以肉鸡为研究对象，将爱媛类芽孢杆菌HD的发酵液应用于肉鸡无抗养殖；

取体重相近的150只1日龄健康肉雏鸡，随机分为3组，每组50只，

E1组的饮用水中添加爱媛类芽孢杆菌HD的发酵液F2，发酵液F2占饮用水质量的30％；

E2组的饮用水中添加爱媛类芽孢杆菌HD的发酵液F2，发酵液F2占饮用水质量的50％；

E3组的饮用水不做处理；

饲养过程为无抗养殖，不添加抗生素，肉鸡正常饮水，饲养6周，各组的肉鸡体重达2kg以上后达出栏标准，并计算出栏成活率；

表6肉鸡出栏的增重及成活率

	E1组	E2组	E3组
				初始数(只)	50	50	50
出栏数(只)	41	45	36
				出栏成活率(％)	82	90	72

表6结果显示，E1组和E2组的出栏成活率高于E3组，表明肉鸡无抗饲养中添加爱媛类芽孢杆菌HD的发酵液可以明显提高肉鸡的免疫力和抗病力，从而促进肉鸡的生长，提高其出栏率，表明爱媛类芽孢杆菌HD可用于畜禽无抗养殖，用于制备抗生素替代品或饲料添加剂。

需要说明的是，上述实施例仅是本发明的较佳实施例，并非是对本发明所作的其他形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员都可能利用上述技术内容作为启示，加以变更或改型为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北科技大学

<120> 产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD及其应用

<130> 2020

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1374

<212> DNA

<213> Paenibacillus ehimensis HD

<400> 1

ctggctcctt gcggttaccc caccgacttc gggtgttgta aactctcgtg gtgtgacggg 60

cggtgtgtac aagacccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg attactagca 120

attccgactt catgcaggcg agttgcagcc tgcaatccga actgagaccg gctttcttag 180

gattggctcc atctcgcgac ttcgcttccc gttgtaccgg ccattgtagt acgtgtgtag 240

cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc 300

ggcagtcaac ttagagtgcc caactgaatg ctggcaacta agttcaaggg ttgcgctcgt 360

tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtct 420

cctctgtccc gaaggcctac cctatctcta ggatattcag agggatgtca agacctggta 480

aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catactccac tgcttgtgcg ggtccccgtc 540

aattcctttg agtttcactc ttgcgagcgt actccccagg cggagtgctt attgtgttta 600

cttcggcacc aagggtatcg aaacccctaa cacctagcac tcatcgttta cggcgtggac 660

taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc gcctcagcgt cagttacagg 720

ccagaaagcc gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc tacgcatttc accgctacac 780

gtggaattcc gctttcctct cctgcactca agccgcccag tttccagtgc gaaccggggt 840

tgagccccgg gcttaaacac cagacttaag cggccgcctg cgcgcgcttt acgcccaata 900

attccggaca acgcttgccc cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccggg 960

gctttcttct caggtaccgt cattcgcaga gcagttactc tccgcgacgt tcttccctgg 1020

caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc cgtcagactt 1080

gcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag 1140

tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg gtgagccgtt 1200

accccaccaa ctagctaatg cgccgcaggc ccatctgtaa gccacaggtt gccccgtgtt 1260

tcttgatcct ctcatgcgag aagatcactt atccggtctt agctaccgtt tccggtagtt 1320

atcccggtct tacaggcagg ttgcctacgt gttactcacc cgtccgccgc tagc 1374

Claims

1.一种产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD，其特征在于，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2020年8月7日，保藏编号是CGMCC No. 20505，拉丁文名称为Paenibacillus ehimensis。

2.根据权利要求1所述的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD，其特征在于，其16S rDNA序列为：

3.权利要求1所述的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的一种应用，其特征在于，所述产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD发酵时，产生含抗菌肽的发酵液。

4.根据权利要求3所述的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的应用，其特征在于，它是将所述产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD接种于改良发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为220-240 r/min的条件下发酵，即得所述含抗菌肽的发酵液。

5.根据权利要求4所述的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的应用，其特征在于，所述发酵的时间为18-32 h。

6.根据权利要求4所述的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的应用，其特征在于，制成所述改良发酵培养基的有效成分的原料每100重量份包括：碳源0.25-2.0份、氮源0.5-2.5份、无机盐0.1-0.7份和余量的水。

7.根据权利要求6所述的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的应用，其特征在于，所述碳源为可溶性淀粉、蔗糖和甘露醇中的至少一种；所述氮源为玉米浆粉和/或蛋白胨；所述无机盐为硫酸镁和/或氯化镁。

8.根据权利要求4、6或7所述的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的应用，其特征在于，所述改良发酵培养基的初始pH值为6.5-7.5。

9.根据权利要求3、4、6或7所述的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的应用，其特征在于，所述抗菌肽抑制细菌和真菌生长；所述细菌和真菌包括：金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲菌、志贺氏菌、沙门氏菌、荧光假单胞菌、黑曲霉、黄曲霉、产黄青霉、扩展青霉、总状毛霉、白假丝酵母、裂殖酵母、毕赤克鲁维酵母和胶红酵母。

10.权利要求1所述的产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD的另一种应用，其特征在于，所述产抗菌肽的爱媛类芽孢杆菌HD用于制备抗生素替代品、食品防腐剂或饲料添加剂。