CN101115838A - 产生和分泌修饰的肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在重组宿主细胞中生产异源多肽。更特别地，本发明涉及由一或多种lantibiotic合成酶修饰的肽如生物学活性肽的产生和分泌。本发明提供了一种编码多肽的核酸构建体，所述多肽包含1)由非lantibiotic输出系统识别的非lantibiotic输出信号，2)至少由lantibiotic脱水酶如LanB识别的lantibiotic前导肽，以及在所述输出信号和所述前导肽的C末端的3)含有一或多个丝氨酸或苏氨酸残基的感兴趣的肽，其可以通过所述脱水酶进行翻译后脱水。本发明还提供了一种在宿主细胞中生产多肽的方法，包括提供具有本发明核酸构建体的宿主细胞，使得所述宿主细胞表达和分泌所编码的多肽，其中所述宿主细胞包含能修饰所述编码的多肽的至少一种脱水酶及能分泌所述经修饰多肽的非lantibiotic输出系统。

Description

产生和分泌修饰的肽的方法

本发明涉及在重组宿主细胞中生产异源多肽。本发明更特别涉及由一或多种lantibiotic-合成酶具体是脱水酶LanB修饰的肽、如生物活性肽的产生和分泌。

有许多种生物学活性肽是已知的，如激素、生长因子、酶抑制剂、抗原、抗生素和离子载体。已经表明肽的环化对于获得生物学活性肽等的稳定类似物是一种颇为有价值的方法。另外，通过构象限制，可以获得肽与其结合配体(例如受体或酶)之间增强的或被调节的相互作用(Li et al.(2002)Curr.Top.Med.Chem.2，325；Osapay et al.(1997)J.Med.Chem.40，2241；Rew Y.et al.(2002)J.Med.Chem.45，3746-3754)。硫醚环可以有助于增强肽的稳定性，增强对蛋白水解的抗性(Bierbaum et al.(1996)Appl.Environm.Microbiol.62，385；Van derMeer et al.(1993)J.Bacteriol.175，2578)及调节受体相互作用(Osapayet al.(1997)J.Med.Chem.40，2241)。

Lantibiotic是具有分子内硫醚环的细菌肽。它们的大多数具有抗生素活性并且在Lantibiotic中均存在羊毛硫氨酸残基即含硫醚的氨基酸，由此而得名。Lantibiotic是由革兰氏阳性菌产生的并主要作用于革兰氏阳性菌(参见Chatterjee，C，et al.(2005)Chem Rev 105，633-684)。

Lantibiotics源自核糖体合成的前肽，这些前肽在翻译后被修饰产生含有(甲基)羊毛硫氨酸和/或脱水残基的肽。脱水丙氨酸和脱水三丁酸甘油酯分别得自lantibiotic酶介导的对丝氨酸和苏氨酸的脱水。由硫醚氨基酸羊毛硫氨酸(Lan)和3-甲基羊毛硫氨酸(MeLan)形成的分子内硫醚桥或环得自lantibiotic酶介导的脱水残基与半胱氨酸的连接。

熟知的lantibiotics包括枯草菌素和食品防腐剂乳酸链球菌肽，它们的结构非常相似。硫醚环保护lantibiotics免于蛋白水解。例如，lantibiotic乳酸链球菌肽在经胰蛋白酶处理后仍保留活性。硫醚环对于一些lantibiotic活性是必需的。乳酸链球菌肽中硫醚环A或C的开环导致膜通透能力丧失。乳酸链球菌肽的环A对于其自身诱导自体合成的能力及对于乳酸链球菌肽通过与脂质II的相互作用而阻断细菌肽聚糖合成的能力是必需的。在这些情况中必须具有硫醚环而非二硫环，因为硫醚环由二硫键的置换导致抗微生物活性丧失。

鉴于硫醚环可有助于生物学活性肽的稳定性和活性，已经提议lantibiotic合成酶(lantibiotic-synthesizing enzymes)可有利地用于在通常不含有硫醚桥的肽中导入硫醚环，以改良所述肽的稳定性和/或改变其活性(Kuipers et al.2004.J.Biol.Chem.279，22176-22182)。

已经描述了Lantibiotic合成酶可组构为膜结合的复合物(Siegerset al.1996.J.Biol.Chem.271，12294-12301；Kiesau et al.1997.J.Bacteriol.179，1475-1481；Sahl et al.1998.Annu.Rev.Microbiol.52：41-7)。这种复合物由lantibiotic转运蛋白(LanT)、脱水酶(LanB；也称作脱水酶)和环化酶(LanC)组成。在一些lantibiotics的情况中，一种双功能的酶(LanM)既进行脱水又进行环化步骤。核糖体合成的前原肽(prepropeptide)中N末端的lantibiotic前导肽是lantibiotic酶的识别信号，用脱水酶或既可进行脱水又可进行环形成的酶开始。据信前导肽与lantibiotic复合物结合，使得所述前原肽与lantibiotic酶非常接近。所述酶复合物提示所述脱水和环形成酶与转运蛋白的附着是必需的，因为否则lantibiotic前原肽会不经修饰而被输出，或者修饰的肽积聚在细胞中。

在大多数情况中，lantibiotic的转运完全依赖于lantibiotic转运蛋白。已经表明乳酸链球菌肽转运蛋白(NisT)的破坏导致完全修饰的前乳酸链球菌肽积聚在细胞内部(Qiao et al.1996.FEMS Microbiol.Lett.144，89-93)。Kuipers等先前揭示了lantibiotic转运蛋白NisT可以分泌未修饰的lantibiotics和所述前导肽与非lantibiotic肽的融合体，并且脱水酶和lantibiotic转运蛋白的组合在没有环化酶的情况中也起作用(Kuipers et al.2004.J.Biol.Chem.279，22176-22182)。

通常的理解是由lantibiotic酶复合物修饰的肽也是通过所述复合物中可利用的专门的转运蛋白来转运的。然而，仍需要加工含有羊毛硫氨酸桥的肽的形成和分泌而不需要完整的复合物的其他方式，特别是用于重组产生生物学活性肽。

本发明现在令人惊奇地显示出可以在宿主细胞中通过分离的lantibiotic脱水酶如LanB对感兴趣的肽进行脱水，所述的脱水酶因此不是常规lantibiotic酶复合物的一部分，并且这种修饰的肽可以由除了专门的lantibiotic转运蛋白之外的蛋白质输出系统分泌。另外，本发明显示出在不存在(被破坏的)LanT的情况中，LanBC也可以脱水和环化。这可以通过构建如下多肽而实现，所述多肽包含感兴趣的肽，在该感兴趣的肽前面的lantibiotic前导肽和非lantibiotic输出信号。

本发明提供了一种编码多肽的核酸构建体，所述多肽包含：1)由非lantibiotic输出系统识别的非lantibiotic输出信号；2)由lantibiotic脱水酶识别的lantibiotic前导肽，以及位于所述输出信号和所述前导肽的C末端的3)含有一或多个丝氨酸或苏氨酸残基的感兴趣的肽，其可以在翻译后由所述脱水酶脱水。

这种构建体在包含必需的脱水酶和非lantibiotic输出系统的宿主细胞中的表达可有利地用于具有新的生物学活性和/或改良的稳定性的经修饰的肽的重组产生。因此，与其中LanBCT复合物负责所述肽的修饰和输出的常规lantibiotics相反，本发明表明：a)LanB和LanBC独立于BTC复合物起作用，b)所述修饰的肽可以由非-lantibiotic输出系统输出。这种可供选择的输出系统不太可能与脱水酶和环形成酶(如果存在的话)一起形成复合物。因此令人惊奇的是由lantibiotic酶识别和修饰的多肽可以靶定于非lantibiotic输出系统。

由本发明的核酸编码的多肽包含lantibiotic前导肽，其使得所述肽可以由脱水酶并优选也由可形成羊毛硫氨酸-桥的环化酶识别。在一个实施方案中，本发明多肽中的前导肽具有可衍生自已知lantibiotic前导肽的氨基酸序列比对的lantibiotic前导共有基序。lantibiotic前导肽的氨基酸序列可得自公开的数据库。表1A和1B示出lantibiotic前导肽的示例性比对。技术人员例如使用公共或可商购的序列比对软件如AlignX of Vector NTI可以从比对的序列中衍生共有基序。AlignX使用ClustalW算法对蛋白质和核酸序列进行多重序列对比，其示出了同源性、序列复杂性、系统树和点阵同源性图。AlignX接受序列的标准的、特征富集型的文本文件，如GenBank、EMBL和GenPept文件。在一个实施方案中，使用ClustalW算法从表1所示序列中衍生所述共有基序。优选前导肽共有基序衍生自至少5个、优选至少10个、更优选至少15个已知前导肽序列的比对。随后使用本文揭示的方法核实由此获得的共有基序的前导肽活性，即由lantibiotic脱水酶的识别及丝氨酸或苏氨酸脱水。例如，可以使用下文实施例1的方法并加以下述的修改：将进行核实的前导肽序列克隆进pNG411TPPII中以置换乳酸链球菌肽前导序列。序列ITSISRASVA的脱水可以使用Maldi-TOF MS进行监测。

所述前导肽共有序列可包含共有基序X1-D/E-E-V/L-S/T-D/E-X2-E-L-D/E，其中X1是任何疏水性氨基酸，X2是任何氨基酸。例如其包含序列LEEVSEQELD。在另一个实施方案中，前导肽包含共有基序F-D/E/N-L-D-X3，其中X3是L、I或V。例如其包含序列LFDLDL或FNLDV。

另一方面，针对lantibiotics变异菌肽(Chen P et al.FEMSMicrobiol Lett.2001；195(2)：139)、Pep5(Neis S et al.FEMS MicrobiolLett.1997；149(2)：249)和乳酸链球菌肽(Van der Meer et al(1994)J.Biol.Chem.269，3555-3562)已经报道了一些保守的前导肽残基对于lantibiotic生物合成是必需的，而其它残基对于理想的生物合成速度是重要的。

在一个优选的实施方案中，本发明提供的多肽包含lantibiotic的前导肽，例如选自如下一组的lantibiotic的前导肽：乳酸链球菌肽A、乳酸链球菌肽Z、枯草菌素、槲皮素S、槲皮素A、链霉菌素、表皮素、val1-leu6-表皮素、gallidermin、变异菌肽(mutacin)1140、变异菌肽B-Ny266、变异菌肽III、变异菌肽I、pep5、epilancin K7、epicidin280、乳链球菌素481、variacin、变异菌肽II、链球菌素A-FF22、salivaricin A、lactocin S、cypemycin、植物乳杆菌菌素(plantaricin)C、actagardine、Ala(0)-actagardine、乳链球菌素3147A1、乳链球菌素3147A2、葡萄球菌素C55b、葡萄球菌素C55b、植物乳杆菌菌素Wa、植物乳杆菌菌素Wb、溶细胞素L1、溶细胞素Ls、ruminococcin A、carnocin UI49、macedocin、bovicin HJ50、nukacin ISK-I、sublancin 168、butyrivibriocin OR79A、肉桂霉素、耐久霉素、ancovenin、mersacidin、sapB(见表2)，或者可以通过合意的lantibiotic修饰酶对位于下游的感兴趣肽进行识别并修饰的任何这些前导肽的同系物。所述同系物示出与表1和2中示出的前导肽序列之一具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％，如92％、95％或者甚至98％的序列相同性。

例如，所述前导肽可以是截短的或突变的lantibiotic前导肽，其仍能诱导感兴趣的肽的翻译后修饰。所述前导肽不需要具有通过lantibiotic转运蛋白如LanT诱导转运的能力，因为这种功能是由本发明多肽中存在的非lantibiotic输出信号导致的。

在本发明一特殊方面，所述前导肽是乳酸链球菌肽前导肽或者其截短或突变形式，其中在N末端的至多4个氨基酸和/或在C末端的任何1至多5个氨基酸被突变。

根据本发明，位于被修饰的感兴趣蛋白质中的氨基酸残基上游的lantibiotic前导肽允许至少由lantibiotic脱水酶识别以及随后对所述残基的脱水。为了保证所述脱水酶确实可接近被修饰的残基，前导序列与被修饰的残基之间的距离应不太大。然而，前导肽与感兴趣肽之间的、几个(例如2-10个)氨基酸残基的片段可促进所述肽的输出。

本发明的多肽包含至少由脱水酶识别的lantibiotic前导肽，由此感兴趣的肽的至少一个丝氨酸或苏氨酸残基在包含所述脱水酶并表达所述多肽的宿主细胞中进行翻译后脱水。如下文示出，所述脱水的多肽可以通过非lantibiotic输出信号而被靶向宿主细胞的非lantibiotic输出系统。一些输出系统也是切除输出信号的信号肽酶。

在任何情况中，前导肽和输出信号(如果存在的话)可以在分泌后从修饰的肽中被除去。根据氨基酸序列，可以用蛋白酶处理肽以除去前导肽和/或非lantibiotic输出信号。例如，乳酸链球菌肽前导肽末端具有精氨酸残基，因此可以用胰蛋白酶除去。通过改造可以在所述前导肽的C末端加入特异性切割位点，而不干扰LanB或LanC功能。在这种情况中，特别有用的蛋白酶包括凝血酶和肠激酶。可以使用的其它蛋白酶是：lysC、Arg C、Asp N、Glu C和糜蛋白酶。也包括化学裂解，例如在甲硫氨酸残基之后使用CNBr-切割。当然，蛋白酶或化学试剂的切割位点可以使用例如定向诱变而在本发明多肽的任何希望的位点导入。

优选地，所述脱水酶是LanB或LanM，例如选自NisB、EpiB、SpaB或PepB的脱水酶。结果，感兴趣的肽中的至少一个丝氨酸或苏氨酸残基分别被转变为脱水丙氨酸或脱水丁酸甘油酯(dehydrobutyrine)。

在一个实施方案中，所述lantibiotic前导肽不仅由脱水酶识别，也由环化酶(LanC)识别，所述环化酶是催化脱水残基与半胱氨酸的环化或结合的lantibiotic合成酶。优选地，所述环化酶选自NisC、EpiC、SpaC或PepC。由于感兴趣的肽除了丝氨酸或苏氨酸残基之外还包含至少一个半胱氨酸残基，其可以与脱水的丝氨酸或苏氨酸残基结合，这样产生感兴趣的含有(甲基)羊毛硫氨酸的肽。所述半胱氨酸可位于相对于所述丝氨酸或苏氨酸残基而言的N或C末端。优选地，所述半胱氨酸与被修饰的丝氨酸或苏氨酸残基间隔至多20个氨基酸，优选至多10个、更优选至多5个氨基酸。这种硫醚桥可用于赋予肽增加的(生物)稳定性，并影响所述肽的生物学活性。

在一个实施方案中，所述脱水和环化步骤均在宿主细胞中进行。当然，表达多肽的宿主细胞还应含有一种环化酶，所述酶催化所述环化步骤。与脱水酶一样，宿主细胞可天然地含有一种内源环化酶，或者所述环化酶可以通过用编码(异源)环化酶的可表达的构建体转化宿主细胞而表达。然而，也可以首先分离由宿主细胞脱水的肽(或者部分环化的脱水的肽的混合物)，随后在体外诱导环形成。乳链球菌素M的体外环化酶活性已经由van der Donk研究小组所证实(Xie，L.，et al.(2004)Science 303，679-681；专利US2005/0164339 A1，van derDonk et al)。在一个实施方案中，将脱水的肽在体外用环化酶处理。为了使所述环化酶识别分泌的、脱水的肽，优选所述肽仍包含lantibiotic前导序列。因此，如果希望脱水的肽在体外环化，则所述肽应由也编码内部的而不是N末端前导肽序列的核酸编码。另外，在N末端前导肽的情况中，所述前导肽在所述肽转运后与内部输出信号一起通过前导肽酶被切除。在另一个实施方案中，脱水的肽的环化不是通过lantibiotic环化酶方式而是通过非酶方式优选在pH8.0保温1小时而在细胞外进行的(Okeley et al.2000 Org.Lett.2，3603-3606；Burrage et al.2000.Chein.Eur.J.6，1455-1466)。

根据本发明，本发明多肽中存在的非lantibiotic输出信号是将肽转运穿过宿主细胞脂质双层的输出系统信号。优选地，所述非lantibiotic输出系统具有广泛的底物特异性。由此允许输出众多不同的肽，包括具有(局部)限制结构如含有一或多个硫醚环的肽。

在一个实施方案中，所述非lantibiotic输出信号是Sec-依赖性分泌系统的信号。Sec(代表分泌)系统被认为是最重要的蛋白质输出途径，因为大多数蛋白质均使用这个系统并且其存在于迄今为止研究的所有生物体中。所述系统由一些成分组成，所述成分在大肠杆菌中已经广泛鉴定。大肠杆菌中的Sec-系统由蛋白质SecA、SecB、SecD、SecE、SecF、SecG、SecY、YajC和YidC组成。SecA识别一个特异性N末端信号序列并将前体靶向SecYEG转运蛋白以进行转运。SecB是一种胞质伴侣蛋白，保持前体处于可转运构象并与SecA的C末端相互作用。在导向和转运步骤已经发生后，分泌的前蛋白从SecYEG孔中释放，并通过其信号肽与细胞膜结合。I型信号肽酶(SPase)是一种基本的膜结合的内肽酶，可以切除信号肽，使其释放分泌蛋白质至其最终目的地。在本发明的一个实施方案中，一种多肽包含由Sec-系统的SecA蛋白识别的N末端信号序列，允许修饰的肽由Sec-依赖性系统输出。本领域已知Sec-信号序列，见例如Tjalsma et al.2000Molecular and Molecular Biology Reviews 64，515-547所述。特别感兴趣的是较大的、由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌的蛋白质Usp45的信号肽序列SP_Usp。这个信号肽包含27个残基，通常是革兰氏阳性菌信号肽。Usp45的N末端区域(包括SP_Usp，在一些情况中包括成熟蛋白质的一些氨基酸)已经用于驱动异源蛋白质在乳酸乳球菌中的分泌，这些异源蛋白质例如α-淀粉酶、牛纤溶酶、IL-2和IL-6、Nuc、BLG、NSP4和脂肪酶(见Le Loir Y，et al.Appl Environ Microbiol.2001；67(9)：4119-27及其中引用的参考文献)。如以下实施例所示，在包含Sec-输出系统及脱水酶NisB的细菌宿主细胞中，编码本发明多肽的核酸构建体的表达导致感兴趣的脱水的肽的产生和分泌，其中本发明多肽包含Sec-输出信号、乳酸链球菌肽前导肽和该感兴趣的肽。这些数据表明通常存在于N末端的lantibiotic前导肽当并非位于N末端时也发挥作用。先前已经示出lantibiotic前导肽的较短N末端延伸不干扰lantibiotic前导肽对lantibiotic酶介导的修饰的诱导。具有枯草菌素前导肽的几个氨基酸MDTYRYI的较短N末端延伸不干扰该前导肽诱导SpaB-介导的脱水的能力(Stein，T.& Entian，K.-D.2002.Rapidcommunications in mass spectrometry.16，103-110)。另一出版物公开了6个组氨酸的N末端延伸(Xie，L.et al.2004.Science 303，679-681)仍允许乳链球菌素M驱动的脱水和环化。然而，没有预料到lantibiotic前导肽仍发挥lantibiotic酶信号功能，即作为脱水酶和环化酶及双功能LanM酶中每一种的信号，尽管事实是其与肽的N末端由一长得多N末端序列分隔开，所述N末端序列代表允许把向非lantibiotic输出系统的不相关输出信号。简而言之，令人惊奇的是当lantibiotic前导肽存在于所述肽内部时可以发挥作用。

将两个不同的Sec-输出信号序列置于彼此之后(Chen，H.et al.1996.J.Bacteriol.178，6658-6664)，以研究这两个序列的偏好。随后具有不同输出信号序列的两种蛋白质也已经融合在彼此之后，在这种情况中内部信号序列是有功能的(Coleman，J.et al.1985.Cell 43，351-360)。已经产生了信号序列的嵌合体，所述信号序列靶向不同的转运系统(Henry，H.et al.1997.J.Cell Biol.136，823-832)。某些天然存在的蛋白质含有一个以上的信号序列，例如N和C末端信号序列(Gerber，L.et al.1992.J.Biol.Chem.267，12168-12173)。然而，尚未描述lantibiotic前导肽与非lantibiotic输出信号序列的组合。

在本发明另一个实施方案中，双精氨酸转运(TAT)系统用于输出由lantibiotic合成酶修饰的肽。TAT系统是一种细菌蛋白质输出途径，具有显著的分泌完全折叠的蛋白质的能力，辅因子的结合不抑制转运(Halbig et al.，1999；Santini et al.，1998)。因此，TAT输出系统可有利地用于本发明含有硫醚环的肽的输出。TAT系统可内源地存在于宿主细胞(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))中，或者其可以在通常不含有TAT系统的宿主细胞例如乳酸乳球菌宿主细胞中异源表达。将蛋白质靶定于TAT装置所需要的输出信号序列(也称作TAT前导肽)较长，而且疏水性低于Sec特异性输出信号(Cristobal et al.1999)。TAT特异性输出信号中疏水性区域由于较多的甘氨酸和苏氨酸残基的存在而明显较短。植物和原核生物TAT特异性输出信号的特点是均存在共有基序(S/T-R-R-X-F-L-K)(US2003/0219870和Berks et al.MoIMicrobiol.2000；35(2)：260)。这个序列基序位于已知和可疑TAT底物的输出信号中的氨基末端区域/疏水性核心边界。一或两个精氨酸残基的突变显著降低蛋白质转运的效力。在本发明的一个实施方案中，非lantibiotic输出信号具有TAT输出系统的特征性序列基序，其包括连续的精氨酸残基。优选地，所述输出信号含有上述共有序列。然而，也可以使用这个共有序列的变体，已经有报道这些变体是TAT途径的底物(Faury et al.Biochim Biophys Acta.2004 Jun 1；1699(1-2)：155-62)。可用的输出信号例如是与YwbN输出相关的TAT前导肽。其它实例是与PhoD输出相关的Tat前导肽(Jongbloed et al.(2004)Molecular Microbiology 54，1319-1325)及来自选自如下蛋白质的编码基因的TAT前导肽：大肠杆菌TorA、Sufi、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、Yael、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AiC、YcdB、YedY、FhuD或Yael。所述输出信号也可以衍生自编码这些序列的任何同源物的基因。在一个实施方案中，本发明的多肽不仅包含TAT输出信号，还包含已知是TAT途径底物的蛋白质(或其片段)。如果所述TAT底物存在于感兴趣的肽的上游，则其可通过沿TAT输出系统“牵引(pull it along)”而增强感兴趣的(修饰的)肽的输出。优选地，所述TAT信号序列及TAT底物衍生自相同的蛋白质。例如，多肽包含YwbN信号序列和其自身YwbN蛋白，随后是前导序列和感兴趣的肽。

在本发明的另一方面，可以使用非lantibiotic ABC(ATP结合盒)型输出系统。例如，可以使用杀菌素输出系统如leucocin A和lactococcinA输出系统。这些系统的输出信号在Van Belkum et al.1997.MoI.Mic.23，1293-1301中描述。

因此，可以使用多种非lantibiotic输出信号将本发明多肽导向非lantibiotic输出系统。所述非lantibitiotic输出信号可位于多肽的N或C末端。然而，优选输出信号位于lantibiotic前导序列的上游，以避免不希望的输出信号的脱水或者干扰感兴趣的肽的脱水。输出信号的修饰可干扰经修饰的肽的输出。因此，优选所述多肽从N末端至C末端包含：1)非lantibiotic输出信号，2)lantibiotic前导肽，及3)感兴趣的肽。令人惊奇地，本发明揭示了当lantibiotic前导序列前方有非lantibiotic输出信号时仍起作用。然而，本发明也涵盖了其中输出信号位于lantibiotic前导肽下游的多肽。例如，本发明提供了一种多肽，其包含乳酸链球菌肽前导序列，随后是Sec信号序列及感兴趣的肽。

在一个实施方案中，非lantibiotic输出信号随后直接是lantibiotic前导肽(或者如果前导肽位于输出信号上游也如此)。可以设想如果N末端输出信号与lantibiotic前导肽由间隔序列分隔，这样将增加所述多肽被修饰的机会。在这种情况中，前导序列可更易由脱水酶识别，即使所述多肽已经经过所述输出系统也如此。因此，在另一个实施方案中，输出信号与前导肽由一个间隔序列分隔，例如由长度为2-250个氨基酸残基如2-50个或2-10个氨基酸的间隔序列分隔。所述间隔序列也可以更大，如200-220个氨基酸。

间隔序列可包含任何氨基酸序列，例如通常在信号序列之后的一部分前原肽序列。在一个实施方案中，使用间隔序列提供具有有用的肽序列的多肽。有用的序列可编码肽标记，其有助于多肽由宿主细胞产生和分泌后的检测、分离或固定。这种标记为本领域所已知。熟知的例如是His-标记和Myc-标记。在一具体实施方案中，输出信号与前导肽由编码细胞锚(anchor)的序列分隔，所述细胞锚允许经修饰的肽在宿主细胞表面上展示。编码细胞锚的序列为本领域所已知。例如WO 02/101026揭示了AcmA型蛋白质锚序列，其使得融合蛋白可以与微生物细胞壁物质结合。细胞锚的其它实例是枯草芽孢杆菌的水解酶(Ghuysen et al.1994.FEBS Lett 342，23-28；Margot et al.1996.Microbiology 142，3427-3444)或者葡糖胺酶(Rashid et al.1995.Microbiology 141，2391-2404)的重复序列。也可以使用可以与细胞壁共价结合的LPxTG标记(Tjalsma et al.2000 Microbiology andMolecular Biology Reviews 64，515-547)。一或多个有用的间隔序列可交替位于感兴趣的肽的下游。

应明了所述感兴趣的肽可以是由脱水和环形成lantibiotic酶修饰的任何肽。通常，感兴趣的肽被设计为这样，其中在一或多个丝氨酸或苏氨酸残基翻译后脱水之后，脱水的残基可以与半胱氨酸结合(通过宿主细胞或者在体外)，由此形成硫醚环结构。因此，可以在所述肽中任何希望的位置导入稳定环结构。特别感兴趣的是具有生物学活性的肽，例如意图用于治疗的肽，因为导入一或多个硫醚环通常增加所述肽的生物稳定性。另外，环结构可用于改变肽的生物学活性，例如受体结合亲和性或酶特异性。感兴趣的肽例如是激素、酶抑制剂、酶激活物、受体配体、抑制肽、lantibiotic蛋白、病毒蛋白、真核细胞(eukcaryotic)蛋白、其突变体(例如特别设计成允许在特定位置进行修饰)、模拟物、相似物或功能等同的片段。

这种肽例如是抗利尿素、特利加压素(terlipressin)、cispressin、昆虫神经肽(allatostatin)I、血管紧张素I、anthopleurin-A、抗炎肽I、dermaseptin、bombin-样肽、histatin-5、indolicidin、magainin I、心房钠尿因子、缓激肽、脑钠尿肽、C-型钠尿肽、血管钠尿肽(vasonatrin)、δ睡眠诱导肽、α-树突毒素(dendrotoxin)、章鱼唾腺精(eledoisin)、echistatin、α-内啡肽、β-内啡肽、抵御素(defensin)I、分泌素、urocortin、urocortin II、小的作用于心脏的肽A和B、ceratotoxin A、cerebellin、charybdotoxin、胆囊收缩素、conopressin G、α-conotoxin E1、corazonin、leu-脑啡肽、蛋内啡肽、催产素、exendin-3、致实验性变应性致脑炎肽(experimental allergic encephalitogenic peptide)、实验性自身免疫性脑脊髓炎互补肽、促性腺激素释放素II、tocinoic acid、亮丙瑞林(leuprolide)、降钙素、ACTH、促肾上腺皮质激素抑制肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促生长素抑制素、人胰腺多肽、肽XY、胰高血糖素、α-神经激肽、LHRH1和2、脑源性酸性成纤维细胞生长因子、脑源性碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、甲状旁腺素、纤维蛋白原结合抑制肽、成纤维细胞生长因子抑制肽、甘丙肽(galanin)、胃抑制性多肽、大胃泌素I、五肽胃泌素、转化生长因子α、人生长激素、生长激素释放因子、鸟苷素(guanylin)、helospectin I、细胞间粘附分子、tachyplesin I、HIV抗原性肽gp120、HIV抗原性肽I片段(gp 41)、HIV抗原性肽5、HIV蛋白酶抑制剂、胰岛素样生长因子-I、IGF II69-84、白细胞介素片段、白细胞介素II片段、leukokinin I、leukopyrokinin、mastoparan、黑色素浓缩激素、蜂毒肽(melittin)、促胃动素(motilin)、神经肽Y、osteocalcin、(N-乙酰-)β内啡肽、ras原癌基因相关肽、白蛋白、红细胞生成素及片段、阿糖苷酶、短杆菌肽A、B、C和S、α-半乳糖苷酶、alteplase、抗凝血酶III、抑肽酶、天冬酰胺酶、becaplermin、骨形态发生蛋白7、过氧化氢酶、cecropin B、纤维素酶、绒毛膜促性腺激素β、绒毛膜促性腺激素α、木瓜糜蛋白酶、糜蛋白酶、大内皮素、肉毒梭菌毒素A和B型、胶原、胶原酶、链球菌DNA酶(dornase)α、eptacogα、etanercept、exendin-4、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、纤连蛋白、纤维蛋白原、filgrastim、促滤泡素(follitropin)α、促滤泡素β、生长激素释放激素、垂体腺苷酸环化酶活化多肽、透明质酸酶、水蛭素II、伊米苷酶(imiglucerase)、白细胞介素2、干扰素α-4、干扰素-β、内源因素、转化酶、lepirudin、重组人类黄体刺激激素(lutropin)β、溶菌酶、金属蛋白酶抑制剂、神经垂体素运载蛋白(neurophysin)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、血纤维蛋白溶酶原、鱼精蛋白、凝血酶原、protirelin、SC3、sermorelin、链球菌DNA酶、链激酶、甲状腺球蛋白、尿激酶、表皮生长因子、转化生长因子、白灰制菌素(leucinostatins)、神经生长因子、glutenexorphins、pardaxin、短杆菌酪肽(tyrocidin)、肥大细胞脱粒肽、肿瘤坏死因子、RGD肽、蛙皮素(bombesin)、胸腺素、红细胞生成素(EPO)、胸腺生成素、caerulein、dermorphin、tachikinin、cecropin、生长抑制因子、血管活性肠辅因子、urotensin I和II、使用其中存在丝氨酸/苏氨酸及如果希望的话半胱氨酸残基的半随机化引物获得的任何病毒多肽或肽。

所述肽也可以是lantibiotic杀菌素(的上述突变体)、非-lantibiotic杀菌素(突变体)，例如bavaricin MN、肠球菌素(enterocin)P、mesentericin Y105、pediocin PA-I、lactacin F、lactococcin G、植物乳杆菌菌素EF、植物乳杆菌菌素JK、lactococcin A、lactococcin 972、植物乳杆菌菌素A、curvacin A、divercin V41、肠球菌素A、muntcidin、sakacin P、leukocin A、carnobacteriocin B2、closticin 574、circularin A、microcin J25、gassericin A或AS48。lantibiotic或杀菌素可包含或不包含其自身前导肽。当然，如果其除了上述lantibiotic前导肽之外还包含其自身前导肽，则由脱水酶识别的前导肽与被修饰的残基之间的距离变得相对较大。为此，优选除去其自身前导肽，由此在整个多肽构建体中仅存在一个lantibiotic前导肽。在某些情况中，例如在自身前导肽较小的情况中，例如在circularin A、microcin J25、gassericin A和AS48的情况中，存在另外的前导序列也许对感兴趣的肽的修饰无负面影响。甚至可以认为存在不同的前导肽(例如lantibiotic前导肽以及杀菌素前导肽)是有利的，因为这样可以进行不同的修饰酶的识别和修饰。

从上文描述及下文实施例可以明了，本发明还提供了一种在宿主细胞中生产多肽的方法，所述方法包括将编码本发明多肽的重组核酸提供给宿主细胞，使得所述宿主细胞表达和分泌编码的多肽。为了使得感兴趣的编码的肽进行希望的脱水，所述宿主细胞应至少包含能识别编码的前导肽并使得所述编码的多肽脱水的脱水酶，并包含能分泌所述脱水的多肽的非lantibiotic输出系统。所述宿主细胞可进一步包含一种环化酶，以允许在细胞内形成硫醚环。所述宿主细胞可天然地含有修饰酶(即脱水酶和/或环化酶)，或者所述宿主细胞可以具有编码所述酶的核酸。将重组核酸提供给宿主细胞的方法为本领域所已知。见例如Sambrook，Fritsch & Maniatis(1989)Molecular Cloning，Alaboratory Manual；2nd Edition.，CSHL Press所述。编码修饰酶的基因如NisB基因，可以与编码本发明多肽的核酸构建体一起置于单个表达质粒上。它们也可以置于两个不同质粒上，例如置于具有不同的复制机制的质粒上。或者，将编码修饰酶或多肽的一或两个重组核酸导入宿主细胞的染色体中。

同样，非-lantibiotic输出系统可内源地存在于宿主细胞中或者使用重组DNA技术提供给宿主细胞。更特别地，所述非-lantibiotic输出系统内源地存在于宿主细胞中。

根据本发明，宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，如酵母。在一个实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性原核细胞，如乳球菌(Lactococcus spp)。乳球菌是革兰氏阳性的兼性厌氧微生物。它们也被分类为乳酸菌(LAB)。在一具体方面，宿主细胞是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，先前称作乳酸链球菌(Streptococcus lactis)。例如可以使用乳酸乳球菌菌株NZ9000。在另一个实施方案中，用芽孢杆菌作为宿主细胞。例如，使用内源性含有Tat输出系统的的枯草芽孢杆菌宿主细胞。

附图简述

图1：NisB脱水的肽经sec系统的输出。

使pNG4HTPPII的乳酸乳球菌NZ9000生长、对其进行诱导并进一步培养过夜，所述乳酸乳球菌含有pNGnisB和含有编码USP信号序列后接乳酸链球菌肽前导序列后接编码ITSISRASVA的序列。将培养基样品通过Maldi TOF MS分析，示出由乳酸链球菌肽前导序列后接ITSISRASVA组成的未修饰的肽以及具有1、2、3和4处脱水的变体(图1A)。为了证实1个苏氨酸和3个丝氨酸的脱水，对肽样品先用乙硫醇进行处理之后进行质谱分析(Maldi-TOF MS)。乙硫醇处理使得质量增加63 Da(图1B)。含有pILnisB和pNG411TPPII的乳酸乳球菌NZ9000导致脱水水平显著增加(图1C)。

图2：NisB脱水的LHRH变体经Sec系统的输出。

将黄体生成素释放激素肽(LHRH)的两种变体LHRH1，QHWSYGCRPG和LHRH2，QHWSYSLRCG克隆在乳酸链球菌肽前导序列的后面，所述前导序列位于USP信号序列的C末端。使含有pILnisB和pLP-LHRH1或pLP-LHRH2的乳酸乳球菌NZ9000在基本培养基中生长至OD0.4，诱导，培养过夜，上清通过质谱分析法进行分析。对于LHRH1，观察到相应于附着于一次脱水的(one timedehydrated)LHRH1的前导肽的大峰(3507 Da)，及相应于未修饰的LHRH1的小峰(3528 Da)(图2A)。对于LHRH2，最显著的峰是没有添加半胱氨酸的未修饰的LHRH2(3572 Da)或添加半胱氨酸的未修饰的LHRH2(3691 Da)及一次脱水的LHRH2(3554 Da)的峰。另外，观察到两次脱水的LHRH2(3535 Da)的小峰(图2B)。

图3：NisB脱水的红细胞生成素变体经Sec输出系统的输出

使含有质粒pILnisB及含有质粒pLPepo(编码Sec信号序列后接乳酸链球菌肽前导序列后接epo片段YASHFGPLGWVCK)的乳酸乳球菌NZ9000在基本培养基中生长至OD0.4，诱导并进一步培养过夜。对所述宿主细胞培养上清进行ZipTip(C 18 ZipTip，Millipore)方法(procedure)制备样品，之后进行Maldi TOF分析。观察到未修饰的肽(3799 Da)和一次脱水的肽(3781 Da)。

图4：使用内部Sec输出信号序列经Sec输出系统输出多肽

建立含有pILnisB及另一个质粒的乳酸乳球菌NZ9000，其中所述质粒编码乳酸链球菌肽前导肽后接sec信号序列后接ITSISRASVA，在GM17培养基中生长至OD0.4，离心沉淀并再悬浮于基本培养基中，诱导并进一步培养过夜。对宿主细胞培养上清进行ZipTip(C18 ZipTip，Millipore)方法制备样品，之后进行Maldi TOF分析。

图5：乳酸链球菌肽前导肽在YwbN的TAT输出信号序列之后内部发挥作用

将乳酸乳球菌培养物在GM17上生长，在OD600等于0.4时诱导并进一步生长过夜。将经溶菌酶处理的细胞煮沸并进行凝胶电泳。

A组：用含有指示菌株LL108及胰蛋白酶的上层琼脂对凝胶的过夜覆盖。NZ9000 pIL5BC(1)；NZ9000 pIL5BC pNGssPhoDnisA(2)；NZ9000 pIL 5BC pNGssYwbNnisA(3)；商业的乳酸链球菌肽(0.5μg)(4)；前乳酸链球菌肽(prenisin)(5)。

B组：用含有LL108而无胰蛋白酶的上层琼脂覆盖。标记(6)；NZ9000 pIL5BC pNGssYwbNnisA(7)；乳酸链球菌肽(8)；前乳酸链球菌肽(9)。

图6：使用在前乳酸链球菌肽的N末端TAT输出系统分泌信号YwbN从枯草芽孢杆菌输出前乳酸链球菌肽

对细胞进行诱导，使培养物生长至静止期/静止期晚期。多肽分泌程度使用抗乳酸链球菌肽前导肽抗体通过Western印迹分析。泳道1：在染色体上含有nisRK的枯草芽孢杆菌；泳道2、5：含有pNGssYwbNisA的枯草芽孢杆菌；泳道3、4：含有pNGssYwbNnisA和pIL5BC的枯草芽孢杆菌。

本发明通过如下实施例举例说明。

实施例1A：三肽基肽酶II的含有脱水丙氨酸的抑制性肽的产生和经Sec输出系统的分泌

这个实施例公开了感兴趣的肽的NisB介导的脱水及分泌，所述感兴趣的肽的N末端之前为乳酸链球菌肽lantibitiotic前导肽，所述前导肽的N末端与Sec输出信号序列USP的C末端融合。未描述抑制性五肽的释放。感兴趣的肽的脱水通过对分泌的蛋白质进行质谱分析测定，因为每次脱水均导致分子量降低18 Da。已知五肽RADhaVA(Dha是指脱水丙氨酸，即脱水的丝氨酸)抑制三肽基肽酶II(TPPII)。

材料：质粒pNGnisB，衍生自pNZ8048，其中在nis启动子之后直接是nisB且无反向重复，所述质粒编码lantibiotic乳酸链球菌肽的脱水酶NisB。在pNGnisB中，nisB基因前面没有反向重复，这与在产生乳酸链球菌肽的NZ9700菌株的染色体上的情况不同。nisB基因直接在乳酸链球菌肽启动子的控制下。NisB可以使与乳酸链球菌肽前导肽的C末端融合的肽中存在的丝氨酸和苏氨酸脱水。质粒pNG411TPPII编码USP信号序列(Van Asseldonket al.1990 Gene 95，155-160；Van Asseldonk et al.1993 MoI.Gen Genet.240，428-434)在C末端后接乳酸链球菌肽前导序列后接序列ITSISRASVA。其在乳酸链球菌肽启动子控制下，具有四种脱水可能性(以黑体字标示)：Sec输出信号序列-乳酸链球菌肽前导肽-ITSISRASVA。ITSIS是前乳酸链球菌肽的头五个残基。它们在RASVA之前以增强输出。所述多肽的全部序列是：

MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYAMSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISRASVA。注意，为了释放RADhaVA五肽，优选的是在RASVA之前含有切割位点(例如甲硫氨酸残基)的不同构建体。

乳酸乳球菌NZ9000宿主细胞含有编码NisRK的基因，其参与乳酸链球菌肽介导的乳酸链球菌肽启动子的活性的诱导。

实验

含有pNGnisB并含有pNG411TPPII的乳酸乳球菌NZ9000在基本培养基上生长至OD 0.4(Rink et al，2005)，诱导并进一步培养过夜。对宿主细胞培养上清进行ZipTip(C 18 ZipTip，Milhpore)方法制备样品。为了证实脱水，在用乙硫醇处理之后对肽样品进行质谱分析(Maldi-TOF MS)。乙硫醇处理导致分子量增加62 Da。

结果

对上清的分析结果示出未修饰的肽由与ITSISRASVA融合的乳酸链球菌肽前导肽组成，峰相应于经历四次脱水步骤的这种肽(每次减少18 Da，因为H₂O消失)，通过出现四个质谱分析峰而得到证实(图1A，表3)。对脱水的肽进行乙硫醇修饰证实三次脱水，通过出现每次脱水增加45 Da(-18 Da H₂O+63 Da乙硫醇)的峰而得到证实(图1B，表3)。

表3：通过NisB的脱水及通过sec系统的输出

	无乙硫醇平均分子量(M+H+)(Da)		乙硫醇平均分子量(M+H+)(Da)
					观察值	理论值	观察值	理论值

未修饰的	3339	3339	3335	3339
					1脱水	3321	3321	3379	3384
2脱水	3303	3303	3423	3429
					3脱水	3286	3285	3467	3474
4脱水	3267	3267	-	3519

结论

在没有所有其它lantibiotic酶的情况中，当ITSISRASVA与乳酸链球菌肽前导序列的C末端融合时，胞内NisB使得这种肽中的丝氨酸和苏氨酸脱水，其中所述前导序列与USP信号序列的C末端融合。另外，这种脱水的肽被输出，之后USP信号序列被切除。USP信号序列与细胞膜保持结合。因此，lantibiotic酶修饰的肽可以通过非lantibiotic输出系统(在本例中为sec系统)输出。

实施例1B：三肽基肽酶II的含有脱水丙氨酸的抑制性肽改进的脱水、产生和经Sec输出系统的分泌

这个实施例与实施例1A几乎相同，但是使用与质粒pNGnisB不同的质粒pILnisB。pILnisB衍生自载体pIL253(Simon，D.，and Chopin，A.(1988)Biochhnie 70，559-566)。在pILnisB中，在nis启动子与nisB之间不存在反向重复。含有pILnisB和含有pNG411TPPII的乳酸乳球菌NZ9000在基本培养基中生长至OD 0.4，诱导并进一步培养过夜。对宿主细胞培养上清进行ZipTip(C18 ZipTip，MUlipore)方法制备样品。

结果

观察到峰(乳酸链球菌肽前导肽的峰，所述序列C末端为ITSISRASVA序列)，其分别相应于未修饰的肽(3338 Da)、一次脱水的肽(3320 Da)、两次脱水的肽(3302 Da)、三次脱水的肽(3284 Da)，并观察到相应于四次脱水的肽的主峰(3266 Da)(图1C)。

结论

这个实施例证实NisB-脱水的肽经USP信号序列(被切除)指导的sec系统的输出，所述肽由在其C末端为ITSISEASVA肽的乳酸链球菌肽前导肽组成。通过双向机制复制的pILnisB质粒与通过滚环机制复制的衍生自pNZ8048的前导构建体质粒的组合导致较高程度的NisB-介导的脱水。

实施例2：前乳酸链球菌肽经Sec输出系统的输出

这个实施例表明与Sec输出信号序列的C末端结合的前乳酸链球菌肽的胞内NisB介导的脱水，随后脱水的融合肽由Sec介导的分泌及Sec信号序列的裂解，使得脱水的前乳酸链球菌肽释放到细胞外。

实验：构建质粒(pNG411，衍生自pNZ8048)，其编码与前乳酸链球菌肽融合的USP信号序列。将含有pNGnisB和pNG411的乳酸乳球菌NZ9000诱导过夜，将细胞离心沉淀并对20ml上清进行TCA沉淀。将沉淀以小体积再悬浮，进行ZipTip方法和Maldi TOF MS。观察到相应于未修饰的前乳酸链球菌肽的质量峰。另外，观察到相应于完全脱水的前乳酸链球菌肽的质量峰。对样品进行乙硫醇修饰导致相应于完全脱水的前乳酸链球菌肽的质量峰完全消失。这表明前乳酸链球菌肽在没有NisT和NisC的情况中可以在细胞内由NisB修饰，随后由于N末端USP信号序列而被输出。USP信号序列在细胞外被切除。

实施例3：NisB脱水的LHRH变体经sec系统的输出

在这个实施例中，证实了脱水的黄体生成素释放激素(LHRH)变体通过sec系统从乳酸乳球菌中输出。LHRH是具有序列pGluHWSYGLRPG-NH2的十肽。将两种变体LHRH1，QHWSYGCRPG和LHRH2，QHWSYSLRCG克隆在乳酸链球菌肽前导序列之后，所述前导序列位于USP信号序列的C末端。在除去前导肽之后，即当谷氨酰胺是最N末端残基时，谷氨酰胺可以自发地转变为LHRH中存在的pGlu。LHRH变体1和2均可以被酰胺化。

实验

含有pILnisB及pLP-LHRH1或pLP-LHRH2的乳酸乳球菌NZ9000在基本培养基中生长至OD0.4，诱导并进一步培养过夜。对宿主细胞培养上清进行ZipTip(C 18 Zip Tip，Millipore)方法制备样品，之后进行Maldi TOF分析。

结果

在培养基中检测到仍附着有乳酸链球菌肽前导肽的LHRH变体。对于LHRH1(乳酸链球菌肽前导肽仍与其附着)，观察到相应于一次脱水的LHRH1(3507 Da)的大峰，并测得相应于未修饰的LHRH1(3528Da)的小峰(图2A)。对于LHRH2(乳酸链球菌肽前导肽仍与其附着)，最显著的是未修饰的无半胱氨酸添加(3572 Da)和有半胱氨酸添加(3691 Da)及一次脱水(3554 Da)的峰。另外，观察到两次脱水的LHRH2(3535 Da)的小峰(图2B)。

结论

LHRH1和LHRH2可以通过NisB脱水，随后通过sec系统从乳酸乳球菌中输出。

实施例4：NisB脱水的红细胞生成素变体的脱水和经sec系统的输出

红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白激素，是骨髓中红细胞前体的生长因子。其增加血液中的红细胞数。合成的红细胞生成素可作为通过重组DNA技术生产的昂贵的可注射治疗剂而获得。

已知EPO的小模拟肽(参见Johnson DL，Jolliffe LK；Nephrol DialTransplant.2000Sep；15(9)：1274-7所述)。许多这些模拟肽含有保持肽的受体相互作用所需的构象有关的二硫键。在这个实施例中，形成二硫键的一个半胱氨酸由丝氨酸置换，因此目的在于脱水并通过脱水的丝氨酸与剩余的半胱氨酸的结合而引起硫醚键形成。在由pNG8048衍生的称作pLPepo的质粒上建立含有USP信号序列后接乳酸链球菌肽前导肽后接EPO片段(下划线处)的构建体。完整的序列是：

MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYAMSTKDFNLDLVSVSKKSGASPRYASHFGPLGWVCK

实验

将含有pILnisB及含有pLPepo的乳酸乳球菌NZ9000在基本培养基中生长至OD0.4，诱导并进一步培养过夜。将宿主细胞培养上清进行ZipTip(C 18 ZipTip，Millipore)方法制备样品，之后进行MaldiTOF分析。

结果

Maldi TOF分析揭示了相应于无半胱氨酸添加-epo(3799 Da)和有半胱氨酸添加的未修饰的前导肽-epo(3918 Da)的峰，及相应于一次脱水的前导肽-epo(3781 Da)的峰(图3)。

结论

在不存在所有其它lantibiotic酶的情况中，当YASHFGPLGWVCK这种肽与乳酸链球菌肽前导肽的C末端融合(所述前导肽与USP信号序列的C末端融合)时，细胞内的NisB使得这种肽中的丝氨酸脱水。另外，这种脱水的肽被输出，之后USP信号序列被切除。USP信号序列保持与细胞膜结合。因此，在sec系统的情况中，lantibiotic酶修饰的肽可以通过非lantibiotic输出系统输出。

实施例5：脱水的肽经Sec系统的输出

在这个实施例中证实了当Sec信号序列存在于内部而非在N末端时，脱水的肽可以通过Sec系统从乳酸乳球菌中输出。

实验

建立含有pILnisB和另一种质粒的乳酸乳球菌NZ9000，所述另一种质粒编码乳酸链球菌肽前导肽后接sec信号序列后接ITSISRASVA，在GM17培养基中生长至OD0.4，离心并重悬于基本培养基中，诱导并进一步培养过夜。对宿主细胞培养上清进行ZipTip(C18 ZipTip，Millipore)方法制备样品，之后进行Maldi TOF分析。全长肽具有如下序列：

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRMKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYAITSISRASVA

结果

测定了如下质量峰(表4和图4)。

表4

肽ITSISRASVA，前接C末端sec信号片段，长度为以下个数的氨基酸	观察的分子量(Da)	理论分子量(Da)	-H2O	存在sec信号片段中的Ser/Thr
					15	2418	2419	0	3
15	2400	2401	1	3
					15	2381	2383	2	3
15	2363	2365	3	3
					11	1995	1993	0	2
11	1973	1975	1	2
					11	1956	1957	2	2
11	1937	1939	3	2
					9	1834	1835	0	1
9	1816	1817	1	1
					9	1797	1799	2	1
6	1595	1595	0	1
					6	1582	1577	1	1
6	1559	1559	2	1
					6	1540	1541	3	1

结论

脱水的肽可以通过Sec系统输出。显然，乳酸链球菌肽前导肽在细胞内存在于N末端及sec信号序列不在N末端的事实不消除sec信号序列的功能性。对于由乳酸链球菌肽前导序列-sec信号序列-ITSISRASVA组成的肽，来自Sec信号序列的C末端片段并后接ITSISRASVA的部分脱水的肽被输出。由6个C末端Sec信号氨基酸后接ITSISRASVA组成的、经2和3次脱水的肽证实ITSISRASVA部分的至少两个残基是被脱水的，因为sec信号片段仅有一个可脱水的残基。

实施例6：当乳酸链球菌肽前导肽存在于TAT转运系统的YwbN的N末端信号序列后面而在多肽内部中时，其用作经NisB和NisC修饰的信号

在这个实施例中，我们证实了当前乳酸链球菌肽存在于TAT信号序列后面时，乳酸链球菌肽前导肽引发乳酸链球菌肽的修饰。我们使用不具有TAT输出系统的细菌宿主细胞乳酸乳球菌。对含有修饰酶NisBC及由TAT信号序列后接前乳酸链球菌肽组成的多肽的乳酸乳球菌进行诱导、破坏，在凝胶上分析匀浆物。在凝胶上分离之后，将乳酸链球菌肽敏感的乳酸乳球菌108涂层进行及不进行胰蛋白酶处理。胰蛋白酶使得前导肽被切除，释放活性乳酸链球菌肽。活性乳酸链球菌肽通过晕圈变为可观察的，所述晕圈反映阻止覆盖的乳酸乳球菌108生长的乳酸链球菌肽的存在。凝胶上晕圈的最高位置反映完整多肽的大小，证明在胰蛋白酶处理之前TAT信号序列仍附着于完全修饰的前乳酸链球菌肽。

克隆

将PhoD和YwbN的信号序列通过扩增克隆在nisA的前面，使用枯草芽孢杆菌的染色体DNA作为引物的模板：

ssPhoD.fw

5′TCGGTCTCTCATGGCATACGACAGTCGTTTTG Tm＝63℃

Bsaii

ssPhoDrev

5′AAAGTACTAGCATTTACTTCAAAGGCCCCAACC Tm＝66℃

scai

ssYwbN.fw

5′GCGAAGACGCCATGAGCGATGAACAGAAAAAGCC Tm＝63℃

Bpii

ssYwbN.rev

5′AAAGTACTACGCAGTCTGAACAAGCGG Tm＝63℃

获得期望的168bp(ssPhoD)和132bp(ssYwbN)片段。随后，将ssPhoD用BsaII消化，将ssYwbN用BpI消化。将获得的片段克隆入先用NcoI和EcoRV消化的pNG8048E中。将nisA基因用如下引物扩增：

前导肽引物.fw1

5′TTAGTACTAAAGATTTTAACTTGGATTTGGTATCTG Tm＝60℃

引物99

5′GCAATATCAGTAATTGCTTTATCAACTGC        Tm＝63℃

将获得的135bp的片段用ScaI和aflIII消化，克隆进用ScaI和XbaI消化的pNGssPhoD和pNGssYwbN中。将获得的质粒称作pNGssPhoDnisA和pNGssYwbNnisA。

实验

乳酸乳球菌培养物在具有5.0μg/ml红霉素(pILBC的选择标记)和5.0μg/ml氯霉素(pNGssPhoDnisA或pNGssYwbNnisA的选择标记)的GM17上生长。在OD600＝0.4时，将培养物用乳酸链球菌肽(乳酸乳球菌菌株NZ9700上清的1/1000)诱导并进一步生长。收获静止期晚期的细胞。将1ml细胞离心，溶解于含有溶菌酶的50μl的50mM TrispH6.8中，在55℃保温20分钟。加入50μl的2×SB，将样品在100℃煮沸5分钟。取20μl样品置于tricine凝胶上。在电泳后，将该凝胶用水彻底洗涤以除去SDS。将该凝胶分为两部分。一部分用含有指示菌株L1108(乳酸乳球菌pORI280，红霉素和氯霉素敏感的)(Methods in Cell Science 20，35-50)及0.01mg/ml胰蛋白酶(图5A)的上层琼脂覆盖。另一部分用上层琼脂和L1108但无胰蛋白酶覆盖(图5B)。将平板保温过夜。

结论

显然，当NisBC存在于YwbN信号序列的后面时能修饰前乳酸链球菌肽。胰蛋白酶切除乳酸链球菌肽前导肽，同时切除与乳酸链球菌肽前导肽附着的YwbN信号序列。最高晕圈的位置表明在NisBC修饰期间，YwbN信号序列附着于前乳酸链球菌肽(图5A)。将前乳酸链球菌肽和乳酸链球菌肽本身在凝胶上电泳，在较低位置产生晕圈。阴性对照组不产生晕圈，因此无其它蛋白质或肽导致晕圈形成。具有PhoD信号序列的全长肽产生较淡的晕圈(图5A)。除了具有乳酸链球菌肽本身的泳道之外，在没有胰蛋白酶的情况下未观察到晕圈(图5B)。

实施例7A：YwbN的TAT信号序列在从枯草芽孢杆菌中输出乳酸链球菌肽中的应用

在这个实施例中，将YwbN的TAT信号序列克隆在前乳酸链球菌肽的N末端。将编码所述多肽的序列在作为宿主细胞的枯草芽孢杆菌中表达，测定从枯草芽孢杆菌中的输出。芽孢杆菌含有内源的TAT输出系统。

克隆及方法

首先，将nisRK插入枯草芽孢杆菌168菌株(AEM 70，5704-7)中。整合载体pTPnisRK通过用DNA Phusion聚合酶扩增染色体上的nisRK而构建，使用如下引物：

AAAGAATTCCCTGTTACTGGAGATGGAGAAG P-NisR.fw1Tm＝61℃

EcoRI

AAACCCGGGCAATTTTCAGAATCTATTCAGAAAC NisKrevlTm＝56℃

XmaI

将用XmaI消化的扩增片段克隆进用SnabI和XmaI消化的pBM1中。这样产生质粒pTPnisKK，其在芽孢杆菌中不复制。在芽孢杆菌的AmyE基因座中进行整合。芽孢杆菌转化体对红霉素有抗性，当其在X-gal上生长时是蓝色的。通过将培养物在无红霉素的条件下生长48小时进行切除。含有lacZ的质粒序列被切除且在AmyE基因座仍存在NisRK的那些细胞当在LacZ、Em敏感型且淀粉酶阴性的条件下生长时是白色的。随后，建立具有染色体上的nisRKoxi、含有pNGssYwbNisA的枯草芽孢杆菌BsnisRK和含有pNGssYwbNnisA和pIL5BC的BsnisKK。pNGssYwbNnisA编码YwbN的信号序列后接前乳酸链球菌肽。pIL5BC编码NisBC。

实验

使用抗乳酸链球菌肽前导肽抗体(J.Biol.Chem.279，22176-22182)通过Western印迹分析分泌情况。将培养物持续生长直至静止期/静止期晚期，将6-8ml培养物进行离心。收集上清，加入TCA至终浓度为10％TCA。将样品在冰上沉淀2小时，或在4℃o/n。将沉淀溶解于100μl MQ中。从这个溶液中取15μl，加入15μl 2×SB。将20μl置于tricine凝胶上。

结果和结论

对于含有pNGssYwbNisA的BsnisRK(图6的泳道2、5)及含有pNGssYwbNnisA和pIL5BC的BsnisRK(图6的泳道3、4)，预期大小的胞外肽可以通过Western印迹证实，其在无质粒的BsnisRK的上清中不存在。这个结果证实YwbN的非-lantibiotic TAT信号序列指导前乳酸链球菌肽在不存在或存在硫醚环形成酶NisBC的条件下从枯草芽孢杆菌中的输出。

实施例7B：修饰的肽经TAT输出系统从枯草芽孢杆菌中输出

这个实施例描述了前乳酸链球菌肽在枯草芽孢杆菌中的修饰和输出。为了进一步提高修饰的多肽通过TAT系统的分泌效率，将额外的序列导入实施例7A描述的多肽中。在YwbN信号序列与乳酸链球菌肽前导肽序列之间，插入编码YwbN蛋白质自身的序列。确信YwbN信号序列与YwbN“辅助序列”的组合存在可促进位于其C末端的肽的输出。

在枯草芽孢杆菌染色体中插入nisRK和nisBC。用称作pNGYwbN-nis的质粒转化这个菌株，该质粒编码包含(从N末端至C末端)YwbN信号序列(非-lantibiotic输出信号)、YwbN(辅助序列)、乳酸链球菌肽-前导肽(lantibiotic前导肽)和乳酸链球菌肽(感兴趣的肽)的多肽。将含有nisRKBC和pNGYwbN-nis的建立的枯草芽孢杆菌宿主细胞在平板上生长过夜。用含有pNGnisP的诱导的乳酸乳球菌(乳酸乳球菌NZ9700上清的1/1000)覆盖该细胞。在随后保温过夜后，形成晕圈，反映输出的乳酸链球菌肽的释放，其是通过NisP从YwbN和乳酸链球菌肽前导肽中切下的。通过将含有nisRKBC和pNGYwbN-nis的枯草芽孢杆菌生长过夜、用含有pNGnisP的乳酸乳球菌处理培养基而获得进一步的证据。通过质谱分析法分析该培养基，以鉴别相应于完全修饰的乳酸链球菌肽的峰。

表1

表1A

表1B

表1A和1B：lantibiotic前导肽的比对。也显示出来自所述比对的可能的共有序列。

表2

Snp-B                                    MNLFDLQSMETPKEEAMGDVE

Epicidin-280                             MENKKDLFDLEIKKDNMENNNELEAQ

Pep-5                                    MKNNKNLFDLEIKKETSQNTDELEPQ

Epilancin-K7                             MNNSLFDLNLNKGVETQKSDLSPQ

Nisin-A/Z                                MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPR

Nisin Q                                  MSTKDFNLDLVSVSKTDSGASTR

Subtilin/Ericin S/-A                     MSKFDDFDLDVVKVSKQDSKTTPQ

Epidermin/[Val1-Leu6]-epidermin          MEAVKEKNDLFNLDVKVNAKESNDSGAEPR

Gallidermin                              MEAVKEKNELFDLDVKVNAKESNDSGAEPR

Mutacin-1140/III/I                       MSNTQLLEVLGTETFDVQEDLFAFDTTDTTTVASNDDPDTR

Lacticin-481                             MKEQNSFNLLQEVTESELDLILGA

Truncated Lacticin-481                   LQEVTFSELDLILGA

Variacin                                 MTNAFQALDEEVTDAELDAILGG

Mutacin-II                               MNKLNSNAVVSLNKVSDSKLDTILGG

Streptococcin-A-FF22                     MEKNNEVINSIQEVSLEELDQIIGA

Salivaricin-A                            MNAMKNSKDILNNAIEEVSEKELNEVAGG

Sublancin                                MEKLFKEVKLEELENQKGS

Lactocin-S                               MKTEKKVLDELSLHASAKMGARDVESSMNAD

Ruminococcin A                           MRNDVLTLTNPMEEKELEQILGG

Butyrivibriocin OR79A                    MNKELNALTNPIDEKELEQILGG

Streptococcin A-M49                      MTKEHEIINSIQEVSLEELDQIIGA

Bacteriocin J46                          MKEQNSFNLLQEVTESELDLILGA

Salivaricin A1                           MKNSKDILTNATEEVSEKELMEVAGG

Streptin                                 MNNTIKDFDLDLKTNKKDTATPY

Boyicin HJ50                             MMNATENQIFVETVSDQELENLIGG

Plantaricin-Wα                          MKISKIEAQARKDFFKIDTNSNLLNVNGA

Lacticin-3147A1                          MNKNEIETQPVTWLEEVSDQNFDEDVFGA

Staphylococcin-C55□                     MKSSFLEKDIEEQVTWFEEVSEQEFDDDIFGA

Plantaricin-WB                           MTKTSRRKNAIANYLEPVDEKSINESFGAGDPEAR

Lacticin-3147A2                          MKEKNMKKNDTIELQLGKYLEDDMIELAKGDESHGG

Staphylococcin-C55□                     MKNELGKFLEENELELGKFSESDMLEITDDEVYAA

Cytolysin-LL                             MENLSVVPSFEELSVEEMEAIQGSGDVQAE

Cytolysin-LS                             MLNKENQENYYSNKLELVGPSFEELSLEEMEAIQGSGDVQAE

Cinnamycin                               MTASILQQSVVDADFRAALLENPAAFGASAAALPTPVEAQDQASLDF

                                         WTKDLAATEAFA

Mereacidin                               MSQEAIIRSWKDPFSRENSTQNPAGNPFSELKEAQMDKLVGAGDNEA

序列表

<110>应用超微系统股份有限公司(Appl ied NanoSystems B.V.)

<120>产生和分泌修饰的肽的方法

<130>P71077CN00

<150>EP 04078318.5

<151>2004-12-07

<150>PCT/NL2005/000842

<151>2005-12-07

<160>64

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>PRT

<213>Streptomyces coelicolor strains

<400>1

Met Asn Leu Phe Asp Leu Gln Ser Met Glu Thr Pro Lys Glu Glu Ala

1               5                   10                  15

Met Gly Asp Val Glu

            20

<210>2

<211>26

<212>PRT

<213>Staphylococcus epidermidis BN280

<400>2

Met Glu Asn Lys Lys Asp Leu Phe Asp Leu Glu Ile Lys Lys Asp Asn

1               5                   10                  15

Met Glu Asn Asn Asn Glu Leu Glu Ala Gln

            20                  25

<210>3

<211>26

<212>PRT

<213>Staphylococcus epidermidis strain 5

<400>3

Met Lys Asn Asn Lys Asn Leu Phe Asp Leu Glu Ile Lys Lys Glu Thr

1               5                   10                  15

Ser Gln Asn Thr Asp Glu Leu Glu Pro Gln

            20                  25

<210>4

<211>24

<212>PRT

<213>Staphylococcus epidermidis K7

<400>4

Met Asn Asn Ser Leu Phe Asp Leu Asn Leu Asn Lys Gly Val Glu Thr

1               5                   10                  15

Gln Lys Ser Asp Leu Ser Pro Gln

            20

<210>5

<211>23

<212>PRT

<213>Lactococcus lactis strains

<400>5

Met Ser Thr Lys Asp Phe Asn Leu Asp Leu Val Ser Val Ser Lys Lys

1               5                   10                  15

Asp Ser Gly Ala Ser Pro Arg

            20

<210>6

<211>23

<212>PRT

<213>Lactococcus lactis 61-14

<400>6

Met Ser Thr Lys Asp Phe Asn Leu Asp Leu Val Ser Val Ser Lys Thr

1               5                   10                  15

Asp Ser Gly Ala Ser Thr Arg

            20

<210>7

<211>24

<212>PRT

<213>Bacillus subtilis strains

<400>7

Met Ser Lys Phe Asp Asp Phe Asp Leu Asp Val Val Lys Val Ser Lys

1               5                   10                  15

Gln Asp Ser Lys Ile Thr Pro Gln

            20

<210>8

<211>24

<212>PRT

<213>Bacillus subtilis A1/3

<400>8

Met Ser Lys Phe Asp Asp Phe Asp Leu Asp Val Val Lys Val Ser Lys

1               5                   10                  15

Gln Asp Ser Lys Ile Thr Pro Gln

            20

<210>9

<211>30

<212>PRT

<213>Staphylococcus epidermidis

<400>9

Met Glu Ala Val Lys Glu Lys Asn Asp Leu Phe Asn Leu Asp Val Lys

1               5                   10                  15

Val Asn Ala Lys Glu Ser Asn Asp Ser Gly Ala Glu Pro Arg

            20                  25                  30

<210>10

<211>30

<212>PRT

<213>Staphylococcus epidermidis strains BN-V1 and BN-V301

<400>10

Met Glu Ala Val Lys Glu Lys Asn Asp Leu Phe Asn Leu Asp Val Lys

1               5                   10                  15

Val Asn Ala Lys Glu Ser Asn Asp Ser Gly Ala Glu Pro Arg

            20                  25                  30

<210>11

<211>30

<212>PRT

<213>Staphylococcus gallinarum strains

<400>11

Met Glu Ala Val Lys Glu Lys Asn Glu Leu Phe Asp Leu Asp Val Lys

1               5                   10                  15

Val Asn Ala Lys Glu Ser Asn Asp Ser Gly Ala Glu Pro Arg

            20                  25                  30

<210>12

<211>41

<212>PRT

<213>Streptococcus mutans strains

<400>12

Met Ser Asn Thr Gln Leu Leu Glu Val Leu Gly Thr Glu Thr Phe Asp

1               5                   10                  15

Val Gln Glu Asp Leu Phe Ala Phe Asp Thr Thr Asp Thr Thr Ile Val

            20                  25                  30

Ala Ser Asn Asp Asp Pro Asp Thr Arg

          35                  40

<210>13

<211>24

<212>PRT

<213>Lactococcus lactis strains

<400>13

Met Lys Glu Gln Asn Ser Phe Asn Leu Leu Gln Glu Val Thr Glu Ser

1               5                   10                  15

Glu Leu Asp Leu Ile Leu Gly Ala

            20

<210>14

<211>15

<212>PRT

<213>Lactococcus lactis strains

<400>14

Leu Gln Glu Val Thr Glu Ser Glu Leu Asp Leu Ile Leu Gly Ala

1               5                   10                  15

<210>15

<211>22

<212>PRT

<213>Kocuria varians strains

<400>15

Met Thr Asn Ala Phe Gln Ala Leu Asp Glu Val Thr Asp Ala Glu Leu

1               5                   10                  15

Asp Ala Ile Leu Gly Gly

            20

<210>16

<211>26

<212>PRT

<213>Streptococcus mutans T8

<400>16

Met Asn Lys Leu Asn Ser Asn Ala Val Val Ser Leu Asn Glu Val Ser

1               5                   10                  15

Asp Ser Glu Leu Asp Thr Ile Leu Gly Gly

            20                  25

<210>17

<211>25

<212>PRT

<213>Streptococcus pyogenes strains

<400>17

Met Glu Lys Asn Asn Glu Val Ile Asn Ser Ile Gln Glu Val Ser Leu

1               5                   10                  15

Glu Glu Leu Asp Gln Ile Ile Gly Ala

            20                  25

<210>18

<211>29

<212>PRT

<213>Streptococcus salivarius 20P3

<400>18

Met Asn Ala Met Lys Asn Ser Lys Asp Ile Leu Asn Asn Ala Ile Glu

1               5                   10                  15

Glu Val Ser Glu Lys Glu Leu Met Glu Val Ala Gly Gly

            20                  25

<210>19

<211>19

<212>PRT

<213>Bacillus subtilis 168

<400>19

Met Glu Lys Leu Phe Lys Glu Val Lys Leu Glu Glu Leu Glu Asn Gln

1               5                   10                  15

Lys Gly Ser

<210>20

<211>31

<212>PRT

<213>Lactobacillus sake L45

<400>20

Met Lys Thr Glu Lys Lys Val Leu Asp Glu Leu Ser Leu His Ala Ser

1               5                   10                  15

Ala Lys Met Gly Ala Arg Asp Val Glu Ser Ser Met Asn Ala Asp

            20                  25                  30

<210>21

<211>23

<212>PRT

<213>Ruminococcus gnavus strains

<400>21

Met Arg Asn Asp Val Leu Thr Leu Thr Asn Pro Met Glu Glu Lys Glu

1               5                   10                  15

Leu Glu Gln Ile Leu Gly Gly

            20

<210>22

<211>23

<212>PRT

<213>Butyrivibrio fibrisolvens AR10

<400>22

Met Asn Lys Glu Leu Asn Ala Leu Thr Asn Pro Ile Asp Glu Lys Glu

1               5                   10                  15

Leu Glu Gln Ile Leu Gly Gly

            20

<210>23

<211>25

<212>PRT

<213>Streptococcus pyogenes M type 49

<400>23

Met Thr Lys Glu His Glu Ile Ile Asn Ser Ile Gln Glu Val Ser Leu

1               5                   10                  15

Glu Glu Leu Asp Gln Ile Ile Gly Ala

            20                  25

<210>24

<211>24

<212>PRT

<213>Lactococcus lactis subsp.cremoris J46

<400>24

Met Lys Glu Gln Asn Ser Phe Asn Leu Leu Gln Glu ValThr Glu Ser

1               5                   10                 15

Glu Leu Asp Leu Ile Leu Gly Ala

            20

<210>25

<211>26

<212>PRT

<213>Streptococcus pyogenes T11(M type 4)

<400>25

Met Lys Asn Ser Lys Asp Ile Leu Thr Asn Ala Thr Glu Glu Val Ser

1               5                   10                  15

Glu Lys Glu Leu Met Glu Val Ala Gly Gly

            20                  25

<210>26

<211>23

<212>PRT

<213>Streptococcus pyogenes strains

<400>26

Met Asn Asn Thr Ile Lys Asp Phe Asp Leu Asp Leu Lys Thr Asn Lys

1               5                   10                  15

Lys Asp Thr Ala Thr Pro Tyr

            20

<210>27

<211>25

<212>PRT

<213>Streptococcus bovis HJ50

<400>27

Met Met Asn Ala Thr Glu Asn Gln Ile Phe Val Glu Thr Val Ser Asp

1               5                   10                  15

Gln Glu Leu Glu Met Leu Ile Gly Gly

            20                  25

<210>28

<211>30

<212>PRT

<213>Lactobacillus plantarum strains

<400>28

Met Lys Ile Ser Lys Ile Glu Ala Gln Ala Arg Lys Asp Phe Phe Lys

1               5                   10                  15

Lys Ile Asp Thr Asn Ser Asn Leu Leu Asn Val Asn Gly Ala

            20                  25                  30

<210>29

<211>29

<212>PRT

<213>Lactococcus lactis IFPL3593

<400>29

Met Asn Lys Asn Glu Ile Glu Thr Gln Pro Val Thr Trp Leu Glu Glu

1               5                   10                  15

Val Ser Asp Gln Asn Phe Asp Glu Asp Val Phe Gly Ala

            20                  25

<210>30

<211>32

<212>PRT

<213>Staphylococcus aureus C55

<400>30

Met Lys Ser Ser Phe Leu Glu Lys Asp Ile Glu Glu Gln Val Thr Trp

1               5                   10                  15

Phe Glu Glu Val Ser Glu Gln Glu Phe Asp Asp Asp Ile Phe Gly Ala

            20                  25                  30

<210>31

<211>35

<212>PRT

<213>Lactobacillus plantarum strains

<400>31

Met Thr Lys Thr Ser Arg Arg Lys Asn Ala Ile Ala Asn Tyr Leu Glu

1               5                   10                  15

Pro Val Asp Glu Lys Ser Ile Asn Glu Ser Phe Gly Ala Gly Asp Pro

            20                  25                  30

Glu Ala Arg

        35

<210>32

<211>36

<212>PRT

<213>Lactococcus lactis IFPL3593

<400>32

Met Lys Glu Lys Asn Met Lys Lys Asn Asp Thr Ile Glu Leu Gln Leu

1               5                   10                  15

Gly Lys Tyr Leu Glu Asp Asp Met Ile Glu Leu Ala Glu Gly Asp Glu

            20                  25                  30

Ser His Gly Gly

        35

<210>33

<211>35

<212>PRT

<213>Staphylococcus aureus C55

<400>33

Met Lys Asn Glu Leu Gly Lys Phe Leu Glu Glu Asn Glu Leu Glu Leu

1               5                   10                  15

Gly Lys Phe Ser Glu Ser Asp Met Leu Glu Ile Thr Asp Asp Glu Val

            20                  25                  30

Tyr Ala Ala

        35

<210>34

<211>30

<212>PRT

<213>Enterococcus faecalis strains

<400>34

Met Glu Asn Leu Ser Val Val Pro Ser Phe Glu Glu Leu Ser Val Glu

1               5                   10                  15

Glu Met Glu Ala Ile Gln Gly Ser Gly Asp Val Gln Ala Glu

            20                  25                  30

<210>35

<211>42

<212>PRT

<213>Enterococcus faecalis strains

<400>35

Met Leu Asn Lys Glu Asn Gln Glu Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Leu Glu

1               5                   10                  15

Leu Val Gly Pro Ser Phe Glu Glu Leu Ser Leu Glu Glu Met Glu Ala

            20                  25                  30

Ile Gln Gly Ser Gly Asp Val Gln Ala Glu

        35                  40

<210>36

<211>59

<212>PRT

<213>Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005

<400>36

Met Thr Ala Ser Ile Leu Gln Gln Ser Val Val Asp Ala Asp Phe Arg

1               5                   10                  15

Ala Ala Leu Leu Glu Asn Pro Ala Ala Phe Gly Ala Ser Ala Ala Ala

            20                  25                  30

Leu Pro Thr Pro Val Glu Ala Gln Asp Gln Ala Ser Leu Asp Phe Trp

        35                  40                  45

Thr Lys Asp Ile Ala Ala Thr Glu Ala Phe Ala

    50                  55

<210>37

<211>48

<212>PRT

<213>Bacillus sp.strain HIL Y-85，54728

<400>37

Met Ser Gln Glu Ala Ile Ile Arg Ser Trp Lys Asp Pro Phe Ser Arg

1               5                   10                  15

Glu Asn Ser Thr Gln Asn Pro Ala Gly Asn Pro Phe Ser Glu Leu Lys

            20                  25                  30

Glu Ala Gln Met Asp Lys Leu Val Gly Ala Gly Asp Asn Glu Ala Ala

        35                  40                  45

<210>38

<211>10

<212>PRT

<213>Artificial

<400>38

Leu Glu Glu Val Ser Glu Gln Glu Leu Asp

1               5                   10

<210>39

<211>6

<212>PRT

<213>Artificial

<400>39

Leu Phe Asp Leu Asp Leu

1               5

<210>40

<211>5

<212>PRT

<213>Artificial

<400>40

Phe Asn Leu Asp Val

1               5

<210>41

<211>5

<212>PRT

<213>Artificial

<400>41

Arg Ala Ser Val Ala

1               5

<210>42

<211>5

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>Dehydroalanine(dehydrated Serine)

<400>42

Arg Ala Xaa Val Ala

1               5

<210>43

<211>10

<212>PRT

<213>Artificial

<400>43

Ile Thr Ser Ile Ser Arg Ala Ser Val Ala

1               5                   10

<210>44

<211>60

<212>PRT

<213>Artificial

<400>44

Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu

1               5                   10                  15

Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Met Ser Thr Lys Asp

            20                  25                  30

Phe Asn Leu Asp Leu ValSer Val Ser Lys Lys Asp Ser Gly Ala Ser

        35                 40                  45

Pro Arg Ile Thr Ser Ile Ser Arg Ala Ser Val Ala

    50                  55                  60

<210>45

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial

<400>45

Met Asp Thr Tyr Arg Tyr Ile

1               5

<210>46

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Ser or Thr

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>Any amino acid

<400>46

Xaa Arg Arg Xaa Phe Leu Lys

1                5

<210>47

<211>10

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>PYRROLIDONE CARBOXYLIC ACID

<220>

<221>MOD_RES

<222>(10)..(10)

<223>AMIDATION

<400>47

Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly

1               5                   10

<210>48

<211>10

<212>PRT

<213>Artificial

<400>48

Gln His Trp Ser Tyr Gly Cys Arg Pro Gly

1               5                   10

<210>49

<211>10

<212>PRT

<213>Artificial

<400>49

Gln His Trp Ser Tyr Ser Leu Arg Cys Gly

1               5                   10

<210>50

<211>13

<212>PRT

<213>Artificial

<400>50

Tyr Ala Ser His Phe Gly Pro Leu Gly Trp Val Cys Lys

1               5                   10

<210>51

<211>63

<212>PRT

<213>Artificial

<400>51

Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu

1               5                   10                  15

Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Met Ser Thr Lys Asp

            20                  25                  30

Phe Asn Leu Asp Leu Val Ser Val Ser Lys Lys Asp Ser Gly Ala Ser

        35                  40                  45

Pro Arg Tyr Ala Ser His Phe Gly Pro Leu Gly Trp Val Cys Lys

    50                  55                  60

<210>52

<211>60

<212>PRT

<213>Artificial

<400>52

Met Ser Thr Lys Asp Phe Asn Leu Asp Leu Val Ser Val Ser Lys Lys

1               5                   10                  15

Asp Ser Gly Ala Ser Pro Arg Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile

            20                  25                  30

Leu Met Ser Thr Val Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val

        35                  40                  45

Tyr Ala Ile Thr Ser Ile Ser Arg Ala Ser Val Ala

    50                  55                  60

<210>53

<211>10

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Any hydrophobic amino acid

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Asp or Glu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4). .(4)

<223>Val or Leu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>Ser or Thr

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>Asp or Glu

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Any amino acid

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>Asp or Glu

<400>53

Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Leu Xaa

1               5                   10

<210>54

<211>5

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Asp or Glu or Asn

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>Leu or Ile or Val

<400>54

Phe Xaa Leu Asp Xaa

1               5

<210>55

<211>19

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Any amino acid

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>Any amino acid

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(15)..(15)

<223>Any amino acid

<400>55

Leu Xaa Asn Ser Leu Glu Glu Val Ser Glu Xaa Glu Leu Asp Xaa Ile

1               5                   10                  15

Leu Gly Gly

<210>56

<211>19

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(18)

<223>Any aminoacid sequence

<400>56

Leu Phe Asp Leu Asp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1               5                   10                  15

Xaa Xaa Glu

<210>57

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial

<400>57

tcggtctctc atggcatacg acagtcgttt tg                                   32

<210>58

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial

<400>58

aaagtactag catttacttc aaaggcccca acc                                  33

<210>59

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial

<400>59

gcgaagacgc catgagcgat gaacagaaaa agcc                                 34

<210>60

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial

<400>60

aaagtactac gcagtctgaa caagcgg                                         27

<210>61

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial

<400>61

ttagtactaa agattttaac ttggatttgg tatctg                               36

<210>62

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<400>62

gcaatatcag taattgcttt atcaactgc                                       29

<210>63

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<400>63

aaagaattcc ctgttactgg agatggagaa g                                    31

<210>64

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial

<400>64

aaacccgggc aattttcaga atctattcag aaac                                 34

Claims (18)

1.一种编码多肽的核酸构建体，所述多肽包含：1)非lantibiotic输出信号，其由非lantibiotic输出系统识别；2)lantibiotic前导肽，其由至少一种lantibiotic脱水酶识别，以及位于所述输出信号和所述前导肽的C末端的3)感兴趣的肽，其含有一或多个丝氨酸或苏氨酸残基的，可以由所述脱水酶进行翻译后脱水。

2.权利要求1的核酸，其中所述lantibiotic前导肽使得由LanB或LanM脱水酶识别成为可能。

3.权利要求1或2的核酸，其中所述感兴趣的蛋白质进一步包含至少一个半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基可以与脱水的丝氨酸或苏氨酸残基以酶促或化学的方式结合。

4.权利要求3的核酸，其中所述lantibiotic前导肽进一步使得由lantibiotic环化酶、优选由LanC或LanM识别成为可能。

5.权利要求3或4的核酸，其中所述至少一个半胱氨酸残基与所述丝氨酸或苏氨酸残基通过至少0-30个氨基酸残基，优选0-20个残基，更优选2-6个残基分隔。

6.权利要求5的核酸，其包含共有基序序列X1-D/E-E-V/L-S/T-D/E-X2-E-L-D/E，其中X1是任何疏水性氨基酸，X2是任何氨基酸；或者其包含共有基序序列F-D/E/N-L-D-X3，其中X3是L、I或V。

7.权利要求1-6任一项的核酸，其中所述lantibiotic前导肽包含可衍生自表1所示序列比对的共有基序。

8.权利要求1-7任一项的核酸，其中所述lantibiotic前导肽是选自如下lantibiotic的前导肽：乳酸链球菌肽A、乳酸链球菌肽Z、枯草菌素、槲皮素S、槲皮素A、链霉菌素、表皮素、val1-leu6-表皮素、gallidermin、变异菌肽l 140、变异菌肽B-Ny 266、变异菌肽III、变异菌肽l、pep5、epilancin K7、epicidin 280、乳链球菌素481、variacin、变异菌肽II、链球菌素A-FP22、salivaricin A、lactocin S、cypemycin、植物乳杆菌菌素C、actagardine、Ala(0)-actagardine、乳链球菌素3147A1、乳链球菌素3147A2、葡萄球菌素C55α、葡萄球菌素C55b、植物乳杆菌菌素Wa、植物乳杆菌菌素Wb、溶细胞素L1、溶细胞素Ls、ruminococcin A、camocin UI49、macedocin、bovicinHJ50、nukacin ISK-I、sublancin 168、butyrivibriocin OR79A、肉桂霉素、耐久霉素、ancovenin、mersacidin、sapB(见表2)，或者至少由lantibiotic脱水酶识别的上述物质的功能性衍生物。

9.权利要求1-8任一项的核酸，其中所述非lantibiotic输出信号是具有广泛底物特异性的蛋白质转运系统的信号。

10.权利要求1-9任一项的核酸，其中所述非lantibiotic输出信号是选自如下一组的转运系统的信号：Sec-依赖性分泌系统，双-精氨酸转运(TAT)系统和非-lantibiotic ABC转运系统。

11.权利要求1-10任一项的核酸，其中所述非-lantibiotic输出信号位于lantibiotic前导肽的N或C末端。

12.权利要求1-11任一项的核酸，其中所述非-lantibiotic输出信号和所述lantibiotic前导肽由间隔序列分隔，优选编码长度为2-250个氨基酸的间隔序列。

13.权利要求12的核酸，其中所述间隔序列允许所述多肽的分离、固定或纯化。

14.权利要求1-13任一项的核酸，其中所述感兴趣的肽选自如下一组：生物活性肽，激素，酶，抑制蛋白质，治疗蛋白质，lantibiotic蛋白质，病毒蛋白质，或这些蛋白质的突变体或功能相等物。

15.宿主细胞，其具有权利要求1-14任一项的核酸。

16.权利要求15的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞，优选是革兰氏阳性原核细胞，更优选是乳球菌(Lactococcusspp.)或芽孢杆菌(Bacillus spp.)。

17.一种在宿主细胞中生产多肽的方法，包括提供权利要求15或16的宿主细胞，允许所述宿主细胞表达和分泌编码的多肽，其中所述宿主细胞至少包含能修饰所编码多肽的lantibiotic脱水酶和能分泌所述经修饰的多肽的非-lantibiotic输出系统。

18.权利要求17的方法，其中所述宿主细胞进一步包含lantibiotic环化酶，其允许在所述宿主细胞中产生包含硫醚环的感兴趣的肽。

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