CN117604167A - 感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒和三重鉴别试剂盒 - Google Patents
感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒和三重鉴别试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种感染性PRRSV的PMA‑qPCR通用检测试剂盒以及一种三重鉴别试剂盒。本发明使用PMA‑qPCR的通用检测试剂盒可以检测待检样品中所有类型PRRSV毒株的感染性病毒。本发明使用PMA‑qPCR的三重鉴别试剂盒可以同时鉴别待检样品中HP‑PRRSV2、NADC30‑like PRRSV2和NADC34‑like PRRSV2感染性病毒，能够快速、高效、准确的对我国猪群中不同感染性PRRSV流行株感染情况进行鉴别。本发明使用PMA‑qPCR的通用检测试剂盒以及三重鉴别试剂盒均能在保持强特异性的情况下，其敏感性比普通PCR方法还要高出10‑100倍。
Description
技术领域
本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒以及一种不同感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别试剂盒。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)给我国养猪业造成巨大经济损失。其病原体PRRS病毒(PRRSV)是一种单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)。PRRSV是一种快速变异的RNA病毒，可分为PRRSV1和PRRSV2两个种(Species)。我国猪群种广泛流行的是PRRSV2，其中以高致病性PRRSV2变异株(HP-PRRSV2)、NADC30-like PRRSV2和NADC34-like PRRSV2为主要流行毒株。
尽管目前已经建立了针对HP-PRRSV2、NADC30-like PRRSV2和NADC34-likePRRSV2的荧光定量PCR(qPCR)检测方法，但是缺乏同时鉴别检测这三种病毒的qPCR检测方法。更为重要的是，PCR技术是通过检测扩增病毒核酸信号来定量病原，无法判断样品中病毒核酸是否具有感染性。因此，现有PRRSV普通PCR和qPCR检测方法均无法区分样品中的PRRSV是否具有感染性，应用于临床样品中PRRSV感染情况检测分析时，容易误判样品中病毒的感染性，从而误诊动物感染情况。因此，急需研发能检测鉴别感染性PRRSV毒株的方法，为我国PRRS有效防控提供帮助与支持。
叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)是一种具有高亲和力的光敏核酸结合染料，不能通过活病毒包膜和衣壳，但可选择性穿过失活病毒包膜和衣壳，并在光作用下可产生氮烯类物质与DNA分子共价交联，从而抑制病毒核酸的PCR扩增。这一特性使得PMA可以与qPCR技术联合使用，达到检测并鉴别感染性活病毒的目的。
目前PMA-qPCR技术被广泛应用于不同种类活细菌检测。同时也有部分应用于感染性活病毒检测的报道。例如甲肝病毒、柯萨奇病毒等人源病毒以及猪流行性腹泻病毒和猪伪狂犬病毒等猪源病毒。但是由于PMA-qPCR检测病毒感染性受到活病毒预处理、病毒灭活方法，PMA用量、PMA孵育时间以及光照时间等多方面因素影响，目前尚未有采用PMA-qPCR技术检测并鉴别感染性PRRSV毒株的报道。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒以及一种不同感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别试剂盒，可以同时实现多种病毒的高效、高灵敏度和高特异性的通用检测与鉴别目的。
技术方案：本发明提供了一种感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒，所述试剂盒包括一对引物对和一条探针，所述一对引物对和一条探针序列如下：
其中，所述感染性PRRSV包括所有已知的PRRSV分离株。
其中，所述试剂盒还包括PMA，所述PMA浓度为1μM～5μM。
其中，所述感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒，其特征在于，所述PMA预处理感染性PRRSV的结合温度为37℃，PMA结合时间为10min，PMA最佳蓝光照射光解时间为20min～25min，病毒样品灭活最佳温度为72℃～80℃，最佳灭活时间为10min～20min。
其中，所述探针用任意一种荧光素标记，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5荧光素。
本发明还提供了一种不同感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别试剂盒，所述试剂盒包括三对引物对和三条探针，所述三对引物对和三条探针序列如下：
其中，所述不同感染性PRRSV包括HP-PRRSV2的XJ17-5株、NADC30-like PRRSV2的SD17-38株和NADC34-like PRRSV2的rBJ1805-2株。
其中，所述试剂盒还包括PMA，所述PAM浓度为5μM。
其中，PMA最佳结合温度为37℃，PMA结合时间为10min，PMA最佳蓝光照射光解时间为20min，病毒样品灭活最佳温度为72℃，最佳灭活时间为10min。
其中，所述三条探针用任意一种荧光素标记，且探针标记的必须是使用不同检测通道的荧光素，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5荧光素。
进一步的，本发明所述试剂盒还包括Premix Ex Taq和RNase Free H2O。
其中，所述试剂盒的扩增程序包括：
其中，所述引物对的浓度均为10μM，所述引物对用量均为0.2～0.3μL，所述探针的浓度均为10μM，所述探针用量为0.1～0.2μL。
进一步的，本发明上述的PMA-qPCR技术进行感染性PRRSV通用检测和鉴别试剂盒在应用时的步骤包括：①根据上述确定的条件使用PMA对病毒样品预处理，使得PMA与失活病毒RNA交联；②提取病毒RNA并将其反转录为cDNA；③使用上述引物探针组合、DNA聚合酶及其他PCR反应液混合分装后，分别加入待检样品的cDNA或者阴性对照、阳性对照cDNA，分别进行同等条件的qPCR扩增，使用real-time PCR仪器进行荧光检测；④采集荧光信号，判定结果。判定标准如下：在阴阳性对照样品检测结果成立的情况下，待检样品的Ct值《35判定为阳性。待检待检样品的Ct值>35同时《40时，判定为可疑。对可疑样品进行复检时，复检样品的Ct值《35判定为阳性，否则判定为阴性。待检样品的Ct值>40，判定为阴性。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
1、本发明使用PMA-qPCR技术建立可实现感染性PRRSV的通用检测和三重鉴别检测试剂盒可以排除由于普通PCR或者qPCR仍然可检测到失活PRRSV的RNA这一缺点所造成的对PRRSV感染情况的错误判断。
2、本发明使用PMA-qPCR技术建立了可实现我国感染性PRRSV流行毒株的三重鉴别检测及其试剂盒可以同时鉴别检测待检样品中HP-PRRSV2、NADC30-like PRRSV2和NADC34-like PRRSV2感染性病毒，能够快速、高效、准确的对我国猪群中不同感染性PRRSV流行株感染情况进行鉴别。
3、本发明使用PMA-qPCR技术建立的可实现感染性PRRSV通用检测与鉴别方法及其试剂盒在保持强特异性情况下，其敏感性比普通PCR方法还要高出10-100倍。
4、本发明使用PMA-qPCR技术建立的可实现感染性PRRSV通用检测与鉴别方法及其试剂盒不仅可以应用于临床样品中PRRSV感染情况的检测，还可应用于PRRSV疫苗等生物制品研发制备过程中的质量监测。
附图说明
图1是实施例1中感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测中引物探针最佳用量组合筛选结果图；
图2是实施例1中感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测中PRRSV灭活温度探索结果图；
图3是实施例1中感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测中PRRSV灭活时间探索结果图；
图4是实施例1中感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测中PMA终浓度筛选结果图；
图5是实施例1中感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测中PMA最佳结合时间摸索结果图；
图6是实施例1中感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测中PMA最佳结合温度测试结果图；
图7是实施例1中感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测中PMA最佳蓝光照射光解时间测试结果图；
图8是实施例1中感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测结果图；
图9是实施例1中感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测方法的特异性和敏感性评价结果图；
图10是实施例2中感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别检测中最佳引物探针用量筛选图；
图11是实施例2中感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别检测中最佳引物探针组合筛选图；
图12是实施例2中感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别结果图；
图13实施例2中感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别方法的特异性和敏感性评价结果图。
具体实施方式
下面将结合实例对本发明的实施方案进行详细描述。以下实例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不改变本发明实质或背离本发明精神的情况下，仅对本发明方法、步骤或条件做出修改或替换，仍属于本发明保护范围。
下列实例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。若无特别指明，本发明实例中所用实验材料、试剂、耗材等均可市售获得。本发明所用到的特定病原生物材料实际来源如下：HP-PRRSV2 XJ17-5株、NADC30-like PRRSV2 SD17-38株均为本实验室分离保存，且已经在前期研究中公开报道(Chen et al.,Viruses,2019,11(9):E875.DOI:10.3390/v11090875.Chen et al.,Transboundary and Emerging Diseases,2018,65:1775-1785.DOI:10.1111/tbed.12952.)。NADC34-like PRRSV2 rBJ1805-2株的保藏编号为CCTCCNO:V202250，该毒株来源于中国专利公开号为CN 115992100A的专利公开文件。
实施例1感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测方法的建立
1、PRRSV通用检测引物探针的设计与测试
根据GenBank数据库中200个代表性PRRSV毒株的全基因组序列，利用序列比对软件DNAMAN进行多重序列比对分析，基于所有PRRSV毒株中高度保守的ORF6基因保守区，设计PRRSV通用检测的引物与探针。具体引物探针序列见表1。以QIAGEN RNAeasy Mini Kit提取的PRRSV(XJ17-5株)RNA为模板，利用TaKaRa PrimeScript 1st Strand cDNA SynthesisKit制备病毒cDNA，然后通过表2所示反应体系和表3所示反应条件进行qPCR扩增和信号采集。并通过测试不同浓度的引物探针组合，筛选最佳引物和探针用量。结果显示引物在0.1～0.5μL(10μM)之间均有良好扩增效果(图1A)，探针在0.1～0.4μL(10μM)也有良好扩增效果(图1B)。但是在引物探针最佳组合测试中发现，当引物为0.3μL(10μM)，探针为0.2μL(10μM)时，尽管PRRSV活病毒经过PMA处理有良好扩增，但是PRRSV灭活病毒经过PMA处理后也仍出现低水平扩增。而当引物为0.2μL(10μM)，探针为0.1μL(10μM)时，PRRSV活病毒经过PMA处理仍有良好扩增，但PRRSV灭活病毒经过PMA处理后未出现特异性扩增曲线(图1C)。表明感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测方法中最佳的引物用量为0.2μL(10μM)，最佳探针用量为0.1μL(10μM)(图1)。
表1.PRRSV通用检测引物探针表
表2.PRRSV通用检测反应体系
表3.PRRSV通用检测扩增程序
2、感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测PMA预处理条件优化
为了建立感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测方法，我们探究了PMA预处理相关最优条件。
第一，我们探究了PRRSV最佳灭活温度。首先将1×104TCID50/mL的XJ17-5病毒液在56、64、72、80℃金属浴灭活20min后加入20％DMSO溶解的PMA，PMA终浓度为5μmol/L，定容至250μL，室温结合10min，蓝光仪照射20min。然后提RNA，反转录成cDNA，PAM-qPCR检测。结果如图2所示，56℃和64℃对于病毒灭活处理效果不太明显，但72℃和80℃灭活效果都比较理想。
第二，我们探究了PRRSV最佳灭活时间。首先将1×104TCID50/mL的XJ17-5病毒液在72℃金属浴灭活5，10，15，20min后加入20％DMSO溶解的PMA，PMA终浓度为5μmol/L，定容至250μL，室温结合10min，蓝光仪照射20min。然后提RNA，反转录成cDNA，PAM-qPCR检测。结果如图3所示，72℃灭活5min效果不明显，72℃灭活10min、15min和20min效果都比较好，但是灭活15min效果最好。
第三，我们探究了PMA的最佳终浓度。首先将1×104TCID50/mL的XJ17-5病毒液在72℃金属浴灭活15min后加入20％DMSO溶解的PMA，PMA终浓度为1、5、10、25、50μmol/L，定容至250μL，室温结合10min，蓝光仪照射20min。然后提RNA，反转录成cDNA，PAM-qPCR检测。结果如图4所示，1μmol/L和5μmol/L的PMA处理效果明显优于其他浓度的PMA处理效果。
第四，我们探究了PMA的最佳结合时间。首先将1×104TCID50/mL的XJ17-5病毒液在72℃金属浴灭活15min后加入20％DMSO溶解的PMA，PMA终浓度为5μmol/L，定容至250μL，室温结合5、10、15、20、25min，蓝光仪照射20min。然后提RNA，反转录成cDNA，PAM-qPCR检测。结果如图5所示，PMA的最佳结合时间为10min。
第五，我们探究了PMA的最佳结合温度。首先将1×104TCID50/mL的XJ17-5病毒液在72℃金属浴灭活15min后加入20％DMSO溶解的PMA，PMA终浓度为5μmol/L，定容至250μL，室温、冰上或者37℃结合10min，蓝光仪照射20min。然后提RNA，反转录成cDNA，PAM-qPCR检测。结果如图6所示，PMA的最佳结合温度为37℃。
第六、我们探究了PMA处理后最佳蓝光照射光解时间。首先将1×104TCID50/mL的XJ17-5病毒液在72℃金属浴灭活15min后加入20％DMSO溶解的PMA，PMA终浓度为5μmol/L，定容至250μL，室温结合10min，蓝光仪照射5、10、15、20、25min。然后提RNA，反转录成cDNA，PAM-qPCR检测。结果如图7所示，蓝光照射20min和25min效果最好。
经过上述PMA处理后建立的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测方法可以鉴别PRRSV活病毒和灭活病毒(图8A)。同时通过IFA鉴定，只有PRRSV活病毒和PRRSV活病毒+PMA处理样品可以感染猪肺泡巨噬细胞产生PRRSV-N蛋白特异性荧光信号，其他组样品不能感染猪肺泡巨噬细胞(图8B)。
建立的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测方法检测PEDV、TGEV、CSFV、PPV、PCV等病毒时不会出现非特异性扩增，表明其特异性良好(图9A)。同时，与前期已报道的普通PCR检测方法(Chen et al.,Transboundary and Emerging Diseases,2019,66:2271-2278.DOI:10.1111/tbed.13276.)相比，其敏感性高10倍(图9B)。
实施例2感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别方法的建立
1、感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别PMA预处理条件优化
为了建立感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别检测方法，我们采用实施例1的方法探究了PMA预处理相关最优条件。结果确定使用终浓度为5μM的PMA预处理病毒样品，PMA最佳结合温度为37℃，PMA结合时间为10min，PMA最佳蓝光照射光解时间为20min，病毒样品灭活最佳温度为72℃，最佳灭活时间为10min。
引物探针组合的摸索优化，本发明第一发明人陈南华2006年至今一直开展PRRSV鉴别诊断方法研究，已经发表多篇PRRSV检测相关SCI论文(Chen et al.,2009.Rapiddifferential detection of classical and highly pathogenic North AmericanPorcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in China by a duplexreal-time RT-PCR.Journal of Virological Methods,161(2),192-198.DOI:10.1016/j.jviromet.2009.06.007.Chen et al.,2019.Development of universal andquadruplex real-time RT-PCR assays for simultaneously detection anddifferentiation of porcine reproductive and respiratory syndromeviruses.Transboundary and Emerging Diseases,66(6):2271-2278.DOI:10.1111/tbed.13276.)，并申请获得多项PRRSV荧光定量PCR鉴别检测相关发明专利(PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法，ZL200910077704.8；猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒，ZL201110073381.2)。尽管本发明已经根据我们十多年引物探针设计经验，规避了绝大多数可能干扰多重鉴别检测引物探针组合的潜在影响因素，例如引物探针序列之间二聚体的形成、不同靶标的引物探针组合之间的相互干扰、退火温度差异等等，但是本发明最初优选的针对HP-PRRSV2、NADC30-likePRRSV2和NADC34-like PRRSV2的三组特异性引物探针组合仍出现了相互干扰情况，导致三重鉴别方法中NADC30-like PRRSV2无法有效扩增(图11)。因此，本发明弃用了NADC30-likePRRSV2最初的引物探针设计(表4编号4-6)，重新筛选获得了NADC30-like PRRSV2新的引物探针设计(表4编号7-9)。通过表5所示反应体系和表6所示反应条件进行三重鉴别qPCR扩增和信号采集。
表4.PRRSV三重鉴别检测引物探针表
表5.PRRSV三重鉴别检测反应体系
表6.PRRSV三重鉴别检测扩增程序
2、PRRSV三重鉴别方法的引物探针设计与测试
根据GenBank数据库中100个代表性HP-PRRSV2毒株、所有71个NADC30-likePRRSV2毒株、所有26个NADC34-like PRRSV2毒株的全基因组序列，利用序列比对软件DNAMAN进行多重序列比对分析，基于不同PRRSV毒株亚群的高度保守且特异性区域，设计PRRSV三重鉴别检测的引物与探针。具体引物探针序列见表4。以QIAGEN RNAeasy Mini Kit提取的不同PRRSV(HP-PRRSV2的XJ17-5株、NADC30-like PRRSV2的SD17-38株、NADC34-like PRRSV2的rBJ1805-2株)RNA为模板，利用TaKaRa PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit制备三种不同病毒的cDNA，然后通过表5所示反应体系和表6所示反应条件进行三重鉴别qPCR扩增和信号采集，筛选最佳引物和探针组合用量。
结果显示三重鉴别检测方法中NADC34-like PRRSV2的最佳引物用量为0.3μL(10μM)，最佳探针用量为0.2μL(10μM)(图10A)；NADC30-like PRRSV2的最佳引物用量为0.3μL(10μM)，最佳探针用量为0.2μL(10μM)(图10B)；HP-PRRSV2的最佳引物用量为0.3μL(10μM)，最佳探针用量为0.2μL(10μM)(图10C)。其中，NADC30-like PRRSV2的引物探针设计选择的是表4编号7-9。
经过前面得到的最佳条件的PMA处理后建立采用步骤1中的最佳扩增体系和扩增条件的感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别方法可以鉴别我国不同PRRSV流行毒株的活病毒和灭活病毒(图12A)。同时IFA鉴定结果也与感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别结果一致。只有不同PRRSV活病毒+PMA处理样品可感染猪肺泡巨噬细胞产生PRRSV-N蛋白特异性荧光信号，其他组样品不能感染猪肺泡巨噬细胞(图12B)。
采用步骤1的最佳扩增体系和扩增条件建立的感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别方法检测PEDV、TGEV、CSFV、PPV、PCV等病毒时不会出现非特异性扩增，表明其特异性良好(图13A)。同时，与表4中NADC34-like PRRSV引物做相同体系和扩增条件的普通PCR检测方法为例相比，其敏感性高100倍(图13B)。
Claims (10)
1.一种感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一对引物对和一条探针，所述一对引物对和一条探针序列如下：
2.一种感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括三对引物对和三条探针，所述三对引物对和三条探针序列如下：
3.根据权利要求1所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PMA，所述PMA浓度为1μM～5μM。
4.根据权利要求3所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒，其特征在于，所述PMA预处理感染性PRRSV的结合温度为37℃，PMA结合时间为10min，PMA最佳蓝光照射光解时间为20min～25min，病毒样品灭活最佳温度为72℃～80℃，最佳灭活时间为10min～20min。
5.根据权利要求2所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述感染性PRRSV包括HP-PRRSV2的XJ17-5株、NADC30-like PRRSV2的SD17-38株和NADC34-likePRRSV2的rBJ1805-2株。
6.根据权利要求5所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别试剂盒，其特征在于，PMA的浓度为5μM，PMA最佳结合温度为37℃，PMA结合时间为10min，PMA最佳蓝光照射光解时间为20min，病毒样品灭活最佳温度为72℃，最佳灭活时间为10min。
7.根据权利要求1所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒或权利要求5所述的三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述探针用任意一种荧光素标记，且探针标记的必须是使用不同检测通道的荧光素，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5荧光素。
8.根据权利要求1所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒或权利要求5所述的三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Premix Ex Taq和RNase Free H2O。
9.根据权利要求1所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒或权利要求5所述的三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序包括：
10.根据权利要求1和2所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒和三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述引物对的浓度均为10μM，所述引物对用量均为0.2～0.3μL，所述探针的浓度均为10μM，所述探针用量为0.1～0.2μL。
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