CN117737309A - 琅琊病毒、墨江病毒、尼帕病毒和雪松病毒的四重qRT-PCR方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了琅琊病毒、墨江病毒、尼帕病毒和雪松病毒的四重qRT‑PCR方法，属于生物检测领域。本发明基于琅琊病毒(LayV)、墨江病毒(MojV)、尼帕病毒(NiV)和雪松病毒(CedV)的全基因组序列，设计了相对保守区域的特异性引物和探针，建立了四重实时荧光qRT‑PCR检测方法。本方法与其他病毒核酸无交叉反应，最佳线性检测范围为10¹～10⁸copies/μL，下限为10copies/μL，并且具有良好的重复性。因此，可用于检测亨尼帕病毒及其他相关临床标本。

Description

琅琊病毒、墨江病毒、尼帕病毒和雪松病毒的四重qRT-PCR 方法

技术领域

本发明公开了琅琊病毒、墨江病毒、尼帕病毒和雪松病毒的四重qRT-PCR方法，属于生物检测领域。

背景技术

尼帕病毒病是最近20年新出现的传染病，为尼帕病毒(Nipah virus，NiV)所致，严重者出现急性脑炎综合征或肺综合征，致死率达40％～100％。由于尼帕病毒病的高死亡率、人兽共患性、可发生人—人传播、无特效药和疫苗，世界卫生组织在《研究和发展蓝图》的优先病原体清单中将尼帕病毒列为需要监测和制定大流行应对措施的8种最危险病原体之一。病毒核酸的快速检测对于早期发现感染病例至关重要。琅琊病毒(Langya virus，LayV)以山东省琅琊镇命名，是一种系统发育独特的人畜共患亨尼帕病毒。对家畜进行的血清调查中，山羊和狗的血清阳性率分别为2％和5％。在所检测的25种野生小型哺乳动物中，LayV RNA主要在鼩鼱中检测到(27％)，但尚未有人际传播的记录。在中国，LayV被鉴定为与墨江病毒(Mojiang virus，MojV)的系统发育关系为最密切的亨尼帕病毒属的新成员。Wu等研究指出从黄胸大鼠身上采集的九个肛拭子样本中检测出三个MojV阳性，推测黄胸鼠属大鼠是MojV的天然宿主。在澳大利亚昆士兰州雪松林的飞狐群落中发现雪松病毒(Cedarvirus，CedV)，为另一种亨尼帕病毒。

LayV、MojV、NiV和CedV都是负向单链RNA病毒，均属于亨尼帕病毒属副粘病毒科。在副粘病毒科中，亨尼帕病毒属是唯一可造成人畜共患高致病性疾病的属类。亨尼帕病毒既可以在蝙蝠之间传播，也可以在溢出事件中传播给其他物种。除了一些关于利巴韦林和法匹拉韦对NiV有抗病毒活性的报道外，目前还没有批准人类用于亨尼帕病毒的药物或疫苗。因此，至关重要的是监测方法的建立，以实现对病毒暴露风险及时、准确、全方位的管理，为突发事件的预警、预报、处置以及事后恢复等阶段的工作做好准备。如2018年NiV爆发期间使用的监测方法，包括分离培养、血清学方法、分子生物学方法等，采用血清法诊断的缺陷在于，当基因序列有高度的同源性时，使用高免疫原性抗原，可以用来检测这两种病毒的抗体，但困难的是无法鉴别两者。病毒分离和中和方法也用于诊断，但仅限于BSL-4设施。二代测序是一种有助于有效鉴定病毒株的替代方法，但该方法在诊断和考虑费用时并不经常使用。最优选和极其敏感的诊断方法是PCR包括常规的逆转录PCR(RT-PCR)和巢式PCR，虽然实时荧光定量RT-PCR价格昂贵，但由于其极高的灵敏度，被广泛用于NiV检测/诊断。关于雪松病毒的检测方法研究介绍较少，主要研究抗体及受体特异性检测(P基因)，也开发了针对P基因的TaqMan MGB检测方法，但未用临床样本进行检测。关于墨江病毒的检测方法研究介绍也较少，主要研究是G蛋白和F蛋白进入细胞的途径，开发了L基因的特异性巢式引物组，并用肛拭子或其他组织样本进行验证。关于琅琊病毒的检测方法研究介绍较少，主要研究是F蛋白的融合结构，现目前检测为宏基因组测序。可见，在现有技术中仍然没有一个系统的方法用于检测和区分尼帕病毒、琅琊病毒、墨江病毒、雪松病毒这四种病毒。

传统的检测方法包括病原分离培养法和免疫检测法。但这些方法操作流程繁琐，灵敏度低，检测时间长；因此，它们不能满足快速诊断的要求。有研究报道，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测具有高灵敏度和特异性，可以在疾病早期检测病毒，目前是各实验室最常用的检测方法。TaqMan荧光探针仅与目标序列结合，不受非特异性产物的影响。不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针，因此可以在同一反应体系中使用不同荧光标记的探针，同时检测多个靶标，从而节省实验成本，大大缩短检测时间。多重qRT-PCR的反应原理、反应试剂和操作过程与传统PCR相似，而多重qRT-PCR可以同时检测或鉴定多种病原微生物、遗传疾病和癌症基因。此外，与传统PCR相比，多重qRT-PCR具有高效、高通量、简便、低成本、系统性强等优点。并且多重qRT-PCR检测灭活的临床样本只需在BSL-2实验室就可进行。

发明内容

本方法以实时荧光qRT-PCR为基础，分别设计检测4种病毒的特异性引物并进行组合优化，能够以1次检测对4种病毒进行区分，在节省了试剂耗材与标本用量的同时也缩短了确定病原体所需时间。为快速排查疑似感染人群提供参考信息，为相关疾病的鉴别诊断提供技术支持，适合省、市、县各级实验室开展。

本发明提供了一种多重qRT-PCR检测病毒的引物和探针组，用于检测亨尼帕病毒属。

在本发明的一种实施方式中，所述亨尼帕病毒属包括琅琊病毒(Langya virus，LayV)、墨江病毒(Mojiang virus，MojV)、尼帕病毒(Nipah virus，NiV)和雪松病毒(Cedarvirus，CedV)。

在本发明的一种实施方式中，用检测LayV的引物如SEQ ID NO.1和2所述，探针如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，用检测MojV)的引物如SEQ ID NO.4和5所述，探针如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，用检测NiV的引物如SEQ ID NO.7和8所述，探针如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，用检测CedV的引物如SEQ ID NO.10和11所述，探针如SEQ ID NO.12所示。

在本发明的一种实施方式中，所述探针的5’端修饰有报告基团，所述报告基团包括FAM、HEX、VIC、ROX或Cy5；四种探针采用不同的报告基团修饰。

在本发明的一种实施方式中，所述探针的3’端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1和BHQ2。

进一步的，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列与SEQ ID NO.9所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ1修饰，SEQ ID NO.6所示核苷酸序列与SEQ ID NO.12所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ2修饰。

本发明提供了一种检测试剂盒，所述试剂盒中含有所述多重qRT-PCR检测病毒的引物和探针组。

在一种实施方式中，所述试剂盒中还含有四种亨尼帕病毒的阳性对照和阴性对照。

在一种实施方式中，所述阳性对照分别为连接有LayV、MojV、NiV、CedV基因片段的质粒。

本发明提供一种检测四种亨尼帕病毒的方法，所述方法不以疾病的诊断为目的，所述方法为利用所述多重qRT-PCR检测病毒的引物和探针组或所述试剂盒进行四种亨尼帕病毒的检测，所述四种亨尼帕病毒为LayV、MojV、NiV、CedV。

在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

S1、从样品中提取核酸；

S2、以S1提取的核酸为模板，利用所述多重qRT-PCR检测病毒的引物和探针组进行多重实时荧光定量PCR扩增反应；

S3、根据实时荧光定量PCR的荧光扩增信号判定样品中是否含有LayV、MojV、NiV、CedV。

在一种实施方式中，S2中所述实时荧光定量PCR的扩增体系为Taq酶0.5μl、逆转录酶0.5μl、四种探针各0.25μl和四对上下游引物各0.5μl、PCRbuffer 12.5μl和核酸模板4μl。

在一种实施方式中，S2中所述实时荧光定量PCR的反应程序为45℃反转录5min，95℃预变性10s；95℃5s和60℃30s；40个扩增循环，60℃退火延伸。

有益效果：

副粘病毒科亨尼帕病毒属新出现的病毒对公共生物安全构成重大威胁，建立四重实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测方法对人畜共患传染病的早期预警至关重要。基于琅琊病毒(Langya virus，LayV)、墨江病毒(Mojiang virus，MojV)、尼帕病毒(Nipah virus，NiV)和雪松病毒(Cedarvirus，CedV)的全基因组序列，设计了相对保守区域的特异性引物和探针，建立了四重实时荧光qRT-PCR检测方法。本方法与其他病毒核酸无交叉反应。LayV、MojV、NiV和CedV的最佳线性检测范围为101～108copies/μL，下限为10copies/μL。LayV、MojV、NiV、CedV的3种不同DNA浓度(104、105、106copies/μL)重复检测14次，具有良好的重复性。各浓度Ct值的标准差<0.5，变异系数<3％。四重实时荧光qRT-PCR检测扩增效率>90％，相关系数>0.99。本研究建立的四重实时荧光qRT-PCR检测LayV、MojV、NiV和CedV的方法具有良好的灵敏度、特异性和重复性。因此，可用于检测亨尼帕病毒及其他相关临床标本。

附图说明

图1四重实时荧光定量逆转录聚合酶链反应特异性评价.A)多种病毒核酸混合1管检测；B)每种病毒核酸单管检测.1)琅琊病毒.2)墨江病毒.3)尼帕病毒.4)雪松病毒，横坐标：循环数；纵坐标：实时荧光信号强度；

图2四重实时荧光定量逆转录聚合酶链反应灵敏度分析(横坐标：循环数；纵坐标：实时荧光信号强度)及标准曲线(横坐标：拷贝数对数值；纵坐标：循环数).A)琅琊病毒，标准曲线为：y＝-3.335x+37.351，R²＝0.9999.B)墨江病毒，标准曲线为：y＝-3.4462x+38.819，R²＝1.C)尼帕病毒，标准曲线方程为：y＝-3.365x+40.999，R²＝0.9999.D)雪松病毒，标准曲线为：y＝-3.4666x+37.859，R²＝0.9998；

图3四重实时荧光定量逆转录聚合酶链反应方法检测NiV毒株.1)标准品对照.2)NiV毒株.3)阴性对照，横坐标：循环数；纵坐标：实时荧光信号强度；

图4四重实时荧光定量逆转录聚合酶链反应方法检测样品.1)标准品对照.2)检测样品及阴性对照，横坐标：循环数；纵坐标：实时荧光信号强度；

图5设计并筛选的引物序列。

具体实施方式

实施例1引物、探针的设计

从NCBI GenBank数据库中检索并下载LayV、MojV、NiV和CedV的全基因组序列，采用MEGA1111.0.11版ClustalW软件进行分析比较。根据TaqMan PCR引物和探针设计原则，选择相对保守的L区和N区作为扩增目的基因片段。利用引物设计软件进行引物和探针的设计，其中，根据MojV(GenBank登录号NC_025352)和CedV(GenBank登录号JQ001776)的基因组中的核衣壳(N)基因进行引物的设计，根据LayV(GenBank登录号OM101130)和NiV(GenBank登录号NC_002728)的基因组中的L聚合酶(L)基因进行引物的设计。

利用BLAST验证了这些引物和探针的广谱性和特异性。所有引物和探针均由上海生工生物科技有限公司合成。LayV探针用5'6-FAM和3'-BHQ1标记；MojV探针用5′-ROX和3′-BHQ2标记；NiV探针用5′-VIC和3′-BHQ1标记；CedV探针用5'-CY5和3'-BHQ2标记。所有引物和探针在12000×g下离心2min，按说明书用无菌双蒸馏水稀释至贮存浓度为100μmol/L，于4℃冰箱储存备用，荧光探针避光保存。

表1用于实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测的引物与探针序列信息

实施例2四重实时荧光qRT-PCR检测的体系构建

(1)LayV、MojV、NiV及CedV阳性对照DNA模板的制备

根据LayV(登录号：OM101130，L蛋白的Genbank登录号:UUV47242.1，)、MojV(登录号:NC_025352，N蛋白的Genbank登录号:YP_009094088.1)、NiV(登录号:NC_002728，L蛋白的Genbank登录号:NP_112028.1，)和CedV(登录号:JQ001776，N蛋白的Genbank登录号:AFP87274.1)的L或N基因片段序列，合成包含四重实时荧光qRT-PCR检测所需片段序列的DNA片段，克隆到pUC57载体上，转化到大肠杆菌中，使用质粒DNA提取试剂盒(Takara Bio,Liaoning,China)纯化，获得pUC57-LayV、pUC57-MojV、pUC57-NiV和pUC57-CedV，作为阳性对照DNA模板。换算其拷贝数为3×10¹⁰copies/μL，将阳性对照DNA稀释至1×10¹⁰copies/μL，保存于-80℃。

(2)四重实时荧光qRT-PCR检测

采用One Step PrimeScriptRT-PCR Kit(PerfectReal Time)(PerfectRealTime；TakaraBio,Liaoning,China)试剂及其推荐的25μl反应体系及扩增条件。

反应体系组成：

分管检测：10μmol/L的四种上下游引物各0.5μl与10μmol/L的四种探针各0.25μl，单种病毒阳性模板4μl，2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μl，TaKaRa Ex TaqHS(5U/μl)0.5μl和PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5μl，剩余由RNase Free dH₂O补齐。

单管检测：10μmol/L的四种上下游引物各0.5μl与10μmol/L的四种探针各0.25μl，4种阳性模板各1μl，4种病毒模板共4μl，2×One Step RT-PCR BufferⅢ12.5μl，TaKaRa ExTaq HS(5U/μl)0.5μl和PrimeScript RTEnzyme MixⅡ0.5μl，剩余由RNase Free dH₂O补齐。

使用QuantStudio 5Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific,USA)进行扩增。扩增条件为：45℃反转录5min，95℃预变性10s；95℃5s和60℃30s；40个扩增循环，退火延伸阶段60℃收集荧光信号。

实施例3检测体系标准曲线的绘制及灵敏度分析

将LayV、MojV、NiV、CedV用灭菌后的双蒸水进行10倍等比梯度稀释，以1×10⁸～1×10¹copies/μL为模板进行多重扩增并每个梯度设置3个平行孔。采用实施例2步骤(2)中的单管检测反应体系及扩增条件下进行四重实时荧光qRT-PCR扩增。在反应结束后，以循环数CT值为纵坐标，阳性模板起始拷贝数浓度的对数为横坐标绘制标准曲线。

获得检测体系标准曲线方程：LayV的标准曲线方程为：y＝-3.335x+37.351，R²＝0.9999；MojV的标准曲线方程为：y＝-3.4462x+38.819，R²＝1；NiV的标准曲线方程为：y＝-3.365x+40.999，R²＝0.9999；CedV的标准曲线方程为：y＝-3.4666x+37.859，R²＝0.9998。检测到各病毒的扩增效率为：LayV，99.46％；MojV，95.06％；NiV，98.23％；CedV，94.30％。该方法建立的标准曲线R²>0.999，均呈现良好的线性关系，所建立检测方法检测下限为10¹copies/μL，标准曲线线性范围为1.0×10⁸copies/μL～1.0×10¹copies/μL，阴性对照无扩增(图2)。

实施例4检测体系的特异性评价

以人偏肺病毒(HMPV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒3型(HPIV-3)和人副流感病毒4型(HPIV-4)阳性核酸作为待检样本，同时设置阴性及阳性对照，使用实施例2中建立的四重实时荧光qRT-PCR检测方法中的单管检测反应体系进行扩增，评价该方法的特异性。

用HMPV、RSV、HPIV-3和HPIV-4的阳性核酸和LayV、MojV、NiV、CedV的质粒标准品以混合成1管(图1A)和各自单管(图1B)2种方式进行评价，结果显示四重实时荧光qRT-PCR仅对LayV、MojV、NiV、CedV有特异性扩增，对其他检测的副粘病毒科病毒均无阳性扩增信号，说明本发明构建的四重实时荧光qRT-PCR检测方法具有良好的特异性(图1)。

实施例5检测体系的稳定性实验

对实施例2中所获得的LayV、MojV、NiV及CedV标准品pUC57-LayV、pUC57-MojV、pUC57-NiV和pUC57-CedV，进行10倍梯度稀释，取10⁶、10⁵、10⁴稀释的阳性对照DNA模板，用实施例2建立的四重实时荧光qRT-PCR中的单管检测体系和反应条件进行检测，每个浓度设3个平行孔，分别进行14次平行重复检测。根据实验中得到的CT值平均值(Mean)、标准差(S.D.)与变异系数(CV)，用以评价该检测体系的稳定性。计算批间和批内变异系数CV，变异系数CV＝标准偏差SD/平均值X。

各样品平行重复实验Ct值的标准差在0.19～0.49之间，变异系数在0.86～2.23％之间，表明该检测体系稳定性良好(表2)。

表2四重实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测4种病毒的稳定性评价

缩写:SD，标准差；CV，变异系数；LayV，琅琊病毒；MojV，墨江病毒；NiV，尼帕病毒；CedV，雪松病毒

实施例6四重实时荧光qRT-PCR检测方法的应用

用实施例2中建立的四重实时荧光qRT-PCR检测体系和反应条件检测对2015年采集的24份蝙蝠肛门拭子样本和2019年采集的33份蝙蝠咽拭子样本进行检测，利用野生型马来西亚NiV菌株的阳性核酸验证建立的四重实时荧光qRT-PCR检测。阳性DNA模板作为阳性对照，无菌水作为阴性对照。

采用本研究建立的四重实时荧光qRT-PCR方法对NiV马来西亚株的样本核酸进行检测，结果均为阳性，说明本检测方法可以有效地检测出上述两种NiV毒株(图3)。采用本研究建立的四重实时荧光qRT-PCR方法检测广东省怀集县小竹村和鱼藤村的24份蝙蝠肛拭子样本和广东省河源市东源县的33份蝙蝠咽拭子样本核酸，结果均为阴性(图4)。

对比例

按照实施例1的目标基因进行引物探针的设计，结果如图5所示，针对不同病毒设计多条引物，如针对LayV基因设计了三对引物和探针，其中，引物对1和5，引物对5的扩增片段过长，引物对1与MojV基因扩增目的片段出现交叉反应。

针对MojV基因设计了三对引物和探针，其中，引物对10和7，在优化条件下引物对10出现引物二聚体，引物对7的3’端为A碱基，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成。

针对NiV基因设计了三对引物和探针，其中，引物对3和5的扩增片段过短，在优化条件下扩增效果不佳。

针对CedV基因设计了两对引物和探针，其中，引物对10，在优化条件下扩增效率不佳。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种多重qRT-PCR检测病毒的引物和探针组，其特征在于，用于检测亨尼帕病毒属；所述亨尼帕病毒属包括琅琊病毒LayV、墨江病毒MojV、尼帕病毒NiV和雪松病毒CedV；

用检测LayV的引物如SEQ ID NO.1和2所述，探针如SEQ ID NO.3所示；

用检测MojV)的引物如SEQ ID NO.4和5所述，探针如SEQ ID NO.6所示；

用检测NiV的引物如SEQ ID NO.7和8所述，探针如SEQ ID NO.9所示；

用检测CedV的引物如SEQ ID NO.10和11所述，探针如SEQ ID NO.12所示。

2.根据权利要求1所述的引物和探针组，其特征在于，所述探针的5’端修饰有报告基团；四种探针采用不同的报告基团修饰；可选的，所述报告基团包括FAM、HEX、VIC、ROX或Cy5。

3.根据权利要求1或2所述的引物和探针组，其特征在于，所述探针的3’端修饰有淬灭基团；可选的，所述淬灭基团为BHQ1和BHQ2。

4.根据权利要求1～3任一所述的引物和探针组，其特征在于，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列与SEQ ID NO.9所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ1修饰，SEQ ID NO.6所示核苷酸序列与SEQ ID NO.12所示核苷酸序列采用淬灭基团BHQ2修饰。

5.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1～4任一所述多重qRT-PCR检测病毒的引物和探针组。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有四种亨尼帕病毒的阳性对照和阴性对照。

7.一种检测四种亨尼帕病毒的方法，所述方法不以疾病的诊断为目的，其特征在于，所述方法为利用权利要求1～4任一所述多重qRT-PCR检测病毒的引物和探针组，或权利要求5或6所述试剂盒进行四种亨尼帕病毒的检测，所述四种亨尼帕病毒为LayV、MojV、NiV、CedV。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、从样品中提取核酸；

S2、以S1提取的核酸为模板，利用权利要求1～4任一所述多重qRT-PCR检测病毒的引物和探针组进行多重实时荧光定量PCR扩增反应；

S3、根据实时荧光定量PCR的荧光扩增信号判定样品中是否含有LayV、MojV、NiV、CedV。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，S2中所述实时荧光定量PCR的扩增体系为Taq酶0.5μl、逆转录酶0.5μl、四种探针各0.25μl和四对上下游引物各0.5μl、PCRbuffer12.5μl和核酸模板4μl。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，S2中所述实时荧光定量PCR的反应程序为45℃反转录5min，95℃预变性10s；95℃5s和60℃30s；40个扩增循环，60℃退火延伸。