CN115786584A - 一种非洲猪瘟病毒消毒效果的快速评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种非洲猪瘟病毒消毒效果的快速评价方法，属于疫病防控领域。该评价方法包括：取待检样品，添加PMA工作液和PBS缓冲液，暗处理后曝光；提取总DNA，以所述总DNA作为模板，采用ASFV‑1‑F和ASFV‑1‑R进行PCR扩增；ASFV‑1‑F序列如SEQ ID NO:1，且在5’端标记有地高辛；ASFV‑1‑R序列如SEQ ID NO:2，且在5’端标记有生物素；取PCR扩增产物与PBS缓冲液混合后，滴加于PCR试纸条的样品垫，放置后肉眼判读结果；所述PCR试纸条的检测线含有链霉亲和素，质控线含有羊抗鼠IgG抗体。本发明评价方法灵敏度高、特异性强、操作简便、耗时短且成本低。
Description
技术领域
本发明属于疫病防控领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒消毒效果的快速评价方法。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染野猪和家猪引起的一种急性、烈性、出血性传染病，该病被世界动物卫生组织(Office international desépizooties，OIE)列为法定上报的动物疫病，也是我国重点防范的一类动物疫病。根据毒力的不同，ASFV可分为强毒力、中等毒力和低毒力三种类型，猪感染不同毒力毒株的病程可分为急性型、亚急性型和慢性型，急性感染表现为高热、咳嗽、呼吸困难和全身广泛性出血等，感染猪一般在3-10d内死亡，死亡率可达100％。
ASFV是一种虫媒病毒，可感染软蜱、蚊、蝇等，在环境中的循环方式主要是丛林传播循环、蜱-猪循环和猪-猪循环。ASFV可通过直接和间接接触传播，直接传播途径主要经口、鼻的接触和表皮破溃伤口而传播，间接传播则是由各种形式的人类活动和被病毒污染的饲料、工具、环境等传播。ASFV感染家猪后，可导致感染猪的迅速死亡，而在其体内迅速增殖的病毒粒子，在动物血液、尿液、唾液、鼻液和眼部分泌物中大量存在，因此，很容易导致环境污染，包括饲料和饮用水，是ASF疫情扩散的主要因素，气溶胶传播方式则仅在短距离内发生。从已发生的疫情来看，相比于动物之间的接触传播，人为因素导致的病毒扩散似乎占据了更大比例。由于当前尚无ASFV疫苗和抗病毒药物上市，严格的生物安全防控仍是控制ASF疫情的关键。
消毒剂消杀是动物疾病防治的重要组成部分，消毒效果的评价更是关乎防治的成败。特别是对于ASF，当疾病爆发时，扑杀和消毒是唯一的选择，准确评价消毒效果至关重要。细胞培养是检测病毒感染性的金标准方法，与之相关的检测方法主要包括50％的红细胞吸附吸附(HAD50)、免疫blot、间接IFA和Cell-ELISA。使用细胞培养，一些肠道病毒很容易繁殖，而其他病毒的则很难繁殖，比如ASFV。目前，没有培养ASFV的成熟细胞系，ASFV的培养通常采用猪肺泡巨噬细胞(PAM)原代细胞，这些细胞难以制备，对猪要求高，且往往不稳定。在较差的状态下，病毒不易感或在感染后不久死亡，不可用于后续的检测。此外，细胞培养法耗时、费力且成本昂贵，不适合作为评价ASFV消毒效果的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒消毒效果的快速评价方法，该方法灵敏度高、特异性强、操作简便、耗时短且成本低。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种非洲猪瘟病毒消毒效果的快速评价方法，包括如下步骤：
(1)从采用消毒剂消杀后的环境中取拭子样本或液体样本，离心取上清液作为待检样品；
(2)取待检样品，添加PMA工作液和PBS缓冲液，暗处理后曝光；提取总DNA，以所述总DNA作为模板，采用ASFV-1-F和ASFV-1-R为引物进行PCR扩增；所述ASFV-1-F的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，且在5’端标记有地高辛；所述ASFV-1-R的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，且在5’端标记有生物素；
(3)取PCR扩增产物与PBS缓冲液混合后，滴加于PCR试纸条的样品垫，放置后肉眼判读结果；所述PCR试纸条的检测线含有链霉亲和素，质控线含有羊抗鼠IgG抗体。
在本发明中，当试纸条质控线和检测线均变红色，检测结果为阳性，判定为检出感染性非洲猪瘟病毒；当试纸条质控线变红色，且检测线不变色，检测结果为阴性，判定为未检出感染性非洲猪瘟病毒；所述PCR试纸条的金标垫上耦合有抗地高辛抗体。
在本发明中，步骤(2)中所述PMA工作液的溶剂为二甲基亚砜水溶液，PMA的浓度为0.8-1.2mM；待检样品为180-220μL，PMA工作液为20-30μL，PBS缓冲液为20-30μL，暗处理时间为8-15min后，曝光时间为15-25min。
在本发明中，步骤(2)中PCR扩增的体系为：TaKaRa Z-Taq 0.25μL，10×Z-TaqBuffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，ASFV-1-F 0.5μL，ASFV-1-R 0.5μL，总DNA 2μL，无核酸酶水17.25μL。
在本发明中，步骤(2)中PCR扩增方法的程序如下：98℃预变性3min；98℃5s，60℃10s，72℃10s，35个循环；72℃延伸3min。
在本发明中，步骤(3)中所述PCR扩增产物与PBS缓冲液的体积比为6：50-58。
检测原理：消毒剂杀灭非洲猪瘟病毒后病毒生物膜破损、通透性增强，PMA穿透病毒膜结构同DNA结合，在卤素光作用下PMA同DNA发生不可逆共价偶联，多余PMA在自然光的作用下会与水分子结合失活。由此，含氯消毒剂灭活的病毒经PMA处理后其核酸无法进行PCR扩增，通过PCR试纸条检测结果为阴性；未灭活病毒的核酸不受影响可以进行PCR扩增，通过PCR试纸条检测结果为阳性。
本发明的有益效果：本发明快速评价方法用分子生物学的方法替代细胞培养法进行消毒剂对非洲猪瘟病毒消毒效果的评价，解决了采用病毒培养法无成熟细胞系的难题，此外该方法操作简单、特异性强、灵敏度高、耗时短、成本低，符合消毒效果评价的各方面要求，具有很强的实用性。实验结果显示常见猪病病毒对照组、对照组、空白对照组均为检测阴性，表明了该评价方法的准确性；平行样检测结果完全一致，表明该方法有很好的重复性。
附图说明
图1是PCR试纸条结构简图，其中1-样品垫，2-金标垫，3-NC膜，4-吸水纸，5-PVC胶板。
图2显示了实施例2中稀释度为10-1的病毒稀释液DNA的检测结果，其中1-3道为PMA未处理组，4-6道为PMA处理组，7为空白PMA未处理组，8为空白PMA处理组。
图3显示了实施例2中稀释度为10-2的病毒稀释液DNA的检测结果，其中1-3道为PMA未处理组，4-6道为PMA处理组，7为空白PMA未处理组，8为空白PMA处理组。
图4显示了有效氯含量为320mg/L的含氯消毒剂工作液消杀效果，其中第1道为感染性病毒-无PMA组试纸条检测结果，2道为感染性病毒-PMA处理组试纸条检测结果，3道是与有效氯含量为320mg/L的含氯消毒剂工作液对应的消毒剂-无PMA组试纸条检测结果，4道是与有效氯含量为320mg/L的含氯消毒剂工作液对应的消毒剂-PMA处理组试纸条检测结果，N为空白对照组试纸条检测结果。
图5显示了有效氯含量为350mg/L的含氯消毒剂工作液消杀效果，其中第1道为感染性病毒-无PMA组试纸条检测结果，2道为感染性病毒-PMA处理组试纸条检测，3道是与有效氯含量为350mg/L的含氯消毒剂工作液对应的消毒剂-无PMA组试纸条检测结果，4道是与有效氯含量为350mg/L的含氯消毒剂工作液对应的消毒剂-PMA处理组试纸条检测结果，N为空白对照组试纸条检测结果。
图6显示了有效氯含量为360mg/L的含氯消毒剂工作液消杀效果，其中第1道为感染性病毒-无PMA组试纸条检测结果，2道为感染性病毒-PMA处理组试纸条检测结果，3道是与有效氯含量为360mg/L的含氯消毒剂工作液对应的消毒剂-无PMA组试纸条检测结果，4道是与有效氯含量为360mg/L的含氯消毒剂工作液对应的消毒剂-PMA处理组试纸条检测结果，N为空白对照组试纸条检测结果。
图7显示了有效氯含量为380mg/L的含氯消毒剂工作液消杀效果，其中第1道为感染性病毒-无PMA组试纸条检测结果，2道为感染性病毒-PMA处理组试纸条检测结果，3道是与有效氯含量为380mg/L的含氯消毒剂工作液对应的消毒剂-无PMA组试纸条检测结果，4道是与有效氯含量为380mg/L的含氯消毒剂工作液对应的消毒剂-PMA处理组试纸条检测结果，N为空白对照组试纸条检测结果。
图8显示了本发明评价方法的检测灵敏度结果，其中1-7道分别为稀释度为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6病毒稀释液作为待测样品的检测结果，8为空白对照。
图9是OIE推荐的qPCR检测灵敏度分析，从左至右扩增曲线分别为稀释度为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的病毒稀释液，稀释度为10-6的病毒稀释液和空白对照无扩增曲线。
图10是特异性检测结果，其中A是本发明评价方法的检测结果，B是PCR产物的凝胶电泳图，其中第1道为ASFVCN2018株；第2道为ASFVAH-2018-3株；第3道为经典猪瘟病毒；第4道为猪繁殖与呼吸综合征病毒；第5道为伪狂犬病病毒；第6道为猪圆环病毒；第7道为口蹄疫病毒；第8道为猪细小病毒；第9道为猪流行性腹泻病毒；第10道为阴性对照(PBS缓冲液)。
图11是采用本发明评价方法评价消毒场所中非洲猪瘟病毒的消毒效果结果图，1-6道分别为消毒环境样本1#、2#、3#、4#、5#、6#，7道为空白对照。
图12是各样本无PMA干预后的PCR试纸条检测结果，1-6道分别为消毒环境样本1#、2#、3#、4#、5#、6#的检测结果，7道为空白对照。
图13是各样本的qPCR方法进行检测结果，扩增曲线从左至右分别为1#、2#、6#、3#，4#、5#样本和空白对照无扩增曲线。
图14采用本发明评价方法中的PCR试纸条验证引物二聚体，试纸条1为对照引物对1的反应体系的检测结果，试纸条2为对照引物对3的反应体系的检测结果，试纸条3为对照引物对4的反应体系的检测结果，试纸条4为对照引物对2的反应体系的检测结果，试纸条5为本发明评价方法中的引物对(ASFV-1-F、ASFV-1-R)的反应体系的检测结果，试纸条6为空白对照的检测结果。
图15琼脂糖凝胶电泳验证引物二聚体，M道为Mark，泳道1为对照引物对1的反应体系，泳道2为对照引物对3的反应体系，泳道3为对照引物对4的反应体系，泳道4为对照引物对2的反应体系，泳道5为本发明评价方法中的引物对(ASFV-1-F、ASFV-1-R)的反应体系，N为空白对照组。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例中采用的仪器、试剂等，如无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂，可通过商业途径获得。
实施例1非洲猪瘟病毒消毒效果的快速评价方法及相关试剂的配制
一.非洲猪瘟病毒消毒效果快速评价方法的相关试剂
非洲猪瘟病毒消毒效果快速评价方法的相关试剂，包括：PMA工作液、PBS缓冲液(pH7.4)、引物、PCR试纸条。
1.PMA工作液
在200μL、体积百分浓度为20％的二甲基亚砜(DMSO)水溶液中加入1mg的PMA(叠氮溴化丙锭)，混合均匀，得到浓度为10mM的PMA储存液，放置于-20℃冰箱中避光保存。将PMA储存液用体积百分浓度为20％的二甲基亚砜水溶液10倍比稀释后得到PMA工作液，置于-4℃冰箱中避光保存。PMA工作液的浓度为1mM。
2.PBS缓冲液(pH7.4)
PBS缓冲液(pH7.4)：取5.84g氯化钠、0.1794g磷酸二氢钠、0.071g十二水合磷酸氢二钠和50μL浓度为1M的氯化镁水溶液，溶于100mL去离子水中，制成pH＝7.4的PBS缓冲液。
3.引物溶液
用于扩增非洲猪瘟病毒p72基因的引物对，包括ASFV-1-F和ASFV-1-R。ASFV-1-F序列如下：5’-Digoxin-TGCCAGGACGAATGAC-3’。ASFV-1-R序列如下：5’-Biotin-CCCGAACCCACTTTGA-3’。其中Digoxin为地高辛，Biotin为生物素。ASFV-1-F的核苷酸序列如SEQIDNO:1，ASFV-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2。
引物ASFV-1-R和ASFV-1-F由宝生物工程(大连)有限公司合成。将ASFV-1-F和ASFV-1-R分别采用去离子水配制成10μM的溶液，得到正、反向引物溶液。
4.阳性质粒
阳性质粒是将非洲猪瘟病毒的P72基因(1941碱基对，GenBank：AY578706)插入pUC57载体所得，浓度200ng/μL。
5.PCR试纸条制备
(1)试剂配制
以超纯水为溶剂配制下列水溶液：1mol/L、pH＝8.0的Tris-HCl溶液，质量百分浓度为10％的蔗糖水溶液，质量百分浓度为10％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液、0.1mol/L的K2CO3水溶液、质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液。
10mM的PB缓冲液：以超纯水为溶剂配制0.2mol/L的磷酸二氢钠水溶液(记为A液)，0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液(记为B液)。取A液0.95mL和B液4.05mL，加入到95mL超纯水中，混合均匀，得到浓度为10mM的PB缓冲液。
氯金酸溶液：将1g氯金酸溶于200mL超纯水，配制成5g/L的氯金酸水溶液，棕色广口瓶冷藏避光保存；
山羊抗小鼠IgG(H+L)，购自上海生工生物科技有限公司，产品编号D111024-0010)。
(2)胶体金试纸条制作
①洗瓶
将待使用的锥形瓶和磁力搅拌子洗净后用王水浸泡，然后洗净，烘干。
②制金
向装有磁力搅拌子的洁净锥形瓶中，加入196mL超纯水和4mL浓度为5g/L的氯金酸水溶液，用铝箔半封口。将锥形瓶置于磁力搅拌器上，开始加热。当瓶中液体开始暴沸，开启搅拌器，同时向瓶中快速加入2.4mL质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液。持续加热搅拌，待液体颜色由黑色逐渐变至酒红色稳定后，开始计时，继续加热搅拌5min后，停止加热搅拌，自然冷却至室温，得到胶体金，用封口膜封口，在2～8℃下保存。
③胶体金偶联物制作
取1000μL胶体金注入1.5mL锥形离心管，加入7μL浓度为0.1mol/L的碳酸钾水溶液，混匀。加入5μL浓度为1mg/mL的抗地高辛抗体(Anti-Digoxin，购自上海生工生物科技有限公司，产品编号是D190209-0200)水溶液，混匀，在振荡条件下反应60min。加入85μL质量百分浓度为10％的BSA水溶液，混匀，在振荡条件下封闭30min。反应结束后，在4℃、10500r/min条件下离心15min，用移液枪快速吸取底部25μL酒红色沉淀物转移至PCR管中，加入10μL质量百分浓度为10％的蔗糖水溶液、50μL质量百分浓度为10％的BSA水溶液和25μLPBS缓冲液(pH7.4)混匀，即得胶体金偶联物，于4℃保藏备用。
④金标垫制备
将VL98聚酯纤维膜(购自上海捷宁生物技术有限公司)裁切成6*300mm的预处理条，置于胶体金(本实施例标题(2)中②制备)中浸泡2h，然后在37℃烘箱中干燥120min，再切割为4*6mm尺寸的片状，用移液枪滴加胶体金偶联物，7uL/片，37℃烘干60min，得到金标垫。
⑤NC膜制备及黏贴
将山羊抗小鼠IgG(H+L)采用PBS缓冲液(pH7.4)稀释至1mg/mL，得到C线抗体溶液。
将SA(链霉亲和素，购自上海百灵威科技有限公司，产品编号S4762)采用PBS缓冲液(pH7.4)稀释至1mg/mL，得到T线抗体溶液。
将尺寸为25*300mm的NC膜(硝酸纤维素膜)贴在PVC胶板中间，将C线抗体溶液、T线抗体溶液分别采用划膜喷金仪喷涂在NC膜上，形成相对应的C线和T线，于37℃烘箱烘干120min。C、T线划线量为0.6μL/cm。
⑥样品垫制备
将玻璃纤维板裁切成17*300mm长条，采用10mM的PB缓冲液浸泡120min后，37℃烘干120min，得到样品垫。
⑦吸水纸制备
将纸板裁切成19*300mm的长条，作为吸水纸。
⑧组装及切条
按照图1，在黏贴有NC膜的PVC胶板5(步骤⑤所得)的两端，分别贴合上样品垫1和吸水纸4，吸水纸的一侧压覆于NC膜3上(压覆尺寸2.0±0.3mm)，然后切割成宽度为4mm的条状，最后在样品垫和NC膜之间贴合金标垫2，金标垫的两端与样品垫和NC膜的压覆尺寸均为2.0±0.2mm。
二.非洲猪瘟病毒消毒效果的快速评价方法
非洲猪瘟病毒消毒效果的快速评价方法(缩写为本发明评价方法)，包括如下步骤：
1.在采用消毒剂(例如含氯消毒剂)消杀后的环境中，取液体样品1mL(例如，可以是养猪场消杀后的水槽中的液体)，离心取上清液作为待检样品。在待检样品中取200μL，添加25μL PMA工作液和25μL的PBS缓冲液(pH7.4)，配制250μL检测体系；10min暗处理后，使用BLU-V system 40W曝光20min。
2.使用QIAGEN公司的试剂盒DNeasy Blood&Tissue Kit提取总DNA。
3.取2μL总DNA作为模板，采用ASFV-1-F和ASFV-1-R为引物，PCR扩增p72基因，目的条带为221bp。
25μL的PCR反应体系，如下：
其中TaKaRa Z-Taq(2.5U/μL)、10×Z-Taq Buffer(Mg2+plus)和dNTP Mixture(10mM)购自宝生物工程(大连)有限公司。
通过ABI Veriti PCR仪进行扩增，反应程序为：98℃预变性3min；98℃5s，60℃10s，72℃10s，35个循环；72℃延伸3min。
同时设置阴性对照和阳性对照；其中阴性对照中以去离子水替代待检样品，阳性对照中以阳性质粒替代待检样品，步骤1-3中的其他操作均同待检样品。
4.取6μL的PCR扩增产物与54μL的PBS缓冲液(pH7.4)混合均匀后，滴加于PCR试纸条的样品垫，室温放置3-5分钟，肉眼判读结果。
阳性：试纸条质控线(C线)变红色，且检测线(T线)变红色，检测结果为阳性，判定为检出非洲猪瘟病毒。
阴性：试纸条质控线(C线)变红色，且检测线(T线)不变色，检测结果为阴性，判定为未检出非洲猪瘟病毒。
无效：(1)阴性对照的T线显色；
(2)阳性对照的T线未显色；
(3)C线都未显色。
实施例2
采用实施例1中PMA工作液、PBS缓冲液(pH7.4)、引物、PCR试纸条进行如下实验。
从-80℃冰箱中取出冻存的ASFV细胞培养液(病毒含量为106.28HAD50/mL)，室温融化后，取100μL加入到900μL的PBS缓冲液(pH7.4)中，得到稀释度为10-1的感染性非洲猪瘟病毒稀释液。同理，配制稀释度为10-2的感染性非洲猪瘟病毒稀释液。各组病毒稀释液分别取250μL，使用QIAGEN公司的试剂盒DNeasy Blood&Tissue Kit提取总DNA。具体操作严格按照试剂盒说明书执行。
两个浓度的总DNA均进行如下操作：设PMA处理组，取20μL总DNA，添加2.5μLPMA工作液和2.5μL的PBS缓冲液(pH7.4)；设PMA未处理组，在20μL总DNA中仅添加5μL的PBS缓冲液(pH7.4)；设空白PMA处理组，取20μL的PBS缓冲液(pH7.4)，添加2.5μL的PMA工作液和2.5μL的PBS缓冲液(pH7.4)；设空白PMA未处理组，在20μL的PBS缓冲液(pH7.4)中仅添加5μL的PBS缓冲液(pH7.4)。上述有PMA工作液参与的混合过程要快速。PMA处理组和空白PMA处理组均暗处理10min后，使用BLU-V system 40W(卤素灯，购自QIAGEN公司)曝光20min；PMA未处理组和空白PMA未处理组均暗处理10min后，从暗环境中取出静置20min。处理结束后，各组取2μL作为模板，采用ASFV-1-F和ASFV-1-R为引物，PCR扩增p72基因(221bp)。
ASFV-1-F序列如下：5’-Digoxin-TGCCAGGACGAATGAC-3’；
ASFV-1-R序列如下：5’-Biotin-CCCGAACCCACTTTGA-3’。
其中Digoxin为地高辛，Biotin为生物素。
25μLPCR反应体系，如下：
| 试剂 | 使用量 |
| TaKaRa Z-Taq(2.5U/μL) | 0.25μL |
| 10×Z-Taq Buffer(Mg2+plus) | 2.5μL |
| dNTP Mixture(10mM) | 2μL |
| ASFV-1-F(10μM) | 0.5μL |
| ASFV-1-R(10μM) | 0.5μL |
| DNA模板 | 2μL |
| 无核酸酶水 | 17.25μL |
| 总体积 | 25μL |
其中TaKaRaZ-Taq、10×Z-Taq Buffer(Mg2+plus)和dNTP Mixture(10mM)购自宝生物工程(大连)有限公司。
通过ABI Veriti PCR仪进行PCR扩增，反应程序为：98℃预变性3min；98℃5s，60℃10s，72℃10s，35个循环；72℃延伸3min。
取6μL的PCR扩增产物与54μL的PBS缓冲液(pH7.4)混合后，滴加于PCR试纸条检测并判断结果。每组样品做3个平行重复。
检测结果如图2-3。由图可见，PMA未处理组检测结果均为阳性，PMA处理组检测结果均为阴性，空白PMA处理组与空白PMA未处理组均为阴性，表明该PMA处理体系能有效排除10-1、10-2病毒稀释液提取纯化的DNA，且核酸染料PMA不会对PCR扩增造成影响。上述结果说明：核酸物质如果没有经过PMA处理，则可以在后续的PCR程序中扩增，继而被试纸条检测到；核酸物质经过PMA处理后，核酸被PMA抑制，无法扩增，从而不能被试纸条检测，因此，本发明评价方法能够排除灭活后非洲猪瘟病毒对检测的干扰。该试验是为说明本发明评价方法具有排除暴露于膜结构外核酸的能力。
实施例3
称取0.5g有效氯含量为10％(质量百分数)的二氯异氰脲酸钠粉，溶解于50mL的PBS缓冲液(pH7.4)中，得到有效氯含量为1g/L的含氯消毒剂工作液。采用相同方法，配制有效氯含量为320mg/L，350mg/L，360mg/L，380mg/L的含氯消毒剂工作液。各含氯消毒剂工作液均存于室温避光处备用。
取病毒含量为106.28HAD50/mL的ASFV的细胞培养液100μL，加入到900μL的PBS缓冲液(pH7.4)中，得到稀释度为10-1的感染性非洲猪瘟病毒稀释液。在200μL稀释度为10-1的感染性非洲猪瘟病毒稀释液中，加入800μL有效氯含量为1g/L的含氯消毒剂工作液，使消杀反应体系终体积为1mL。按照上述相同方法，配制1mL消杀反应体系，不同之处仅在于分别采用有效氯含量为320mg/L，350mg/L，360mg/L，380mg/L的含氯消毒剂工作液替代有效氯含量为1g/L的含氯消毒剂工作液。上述各消杀反应体系在室温消杀20min后，分别加入50μL质量百分浓度为10％的硫代硫酸钠水溶液，以终止反应。
(1)使用红细胞吸附实验(HAD)考察消杀效果
采用常规红细胞吸附实验，考察有效氯含量为320mg/L，350mg/L，360mg/L，380mg/L和1g/L的含氯消毒剂工作液对非洲猪瘟病毒稀释液的消杀效果。
HAD验证实验结果：有效氯含量为320mg/L的含氯消毒剂工作液杀灭20min，不能使病毒完全灭活；而有效氯含量为350mg/L，360mg/L，380mg/L和1g/L的含氯消毒剂工作液在作用20min后，可以完全杀灭病毒。
(2)采用本发明方法考察消杀效果
采用本发明评价方法(实施例1)考察消杀效果，具体方法如下：消杀反应结束后，以各消杀反应体系为待检样品，采用本发明评价方法进行检测，记为消毒剂-PMA处理组。在200μL稀释度为10-1的感染性非洲猪瘟病毒稀释液(本实施例中配制)中，加入800μL的PBS缓冲液，混合均匀，作为待检样品，采用本发明评价方法进行检测，记为感染性病毒-PMA处理组。
对各消杀反应体系分别取200μL，添加50μLPBS缓冲液(pH7.4)，记为消毒剂-无PMA组。取200μL稀释度为10-1的感染性非洲猪瘟病毒稀释液(本实施例中配制)，加入800μL的PBS缓冲液(pH7.4)，然后取200μL，添加50μLPBS缓冲液，记为感染性病毒-无PMA组。设置空白对照组，为250μLPBS缓冲液(pH7.4)。将消毒剂-无PMA组、感染性病毒-无PMA组和空白对照组暗处理10min后，从黑暗环境中取出，静置20min，然后按照本发明评价方法中的步骤2-4进行检测。
检测结果如图4、5、6和7。由图4可见，有效氯浓度为320mg/L的消毒剂工作液，20min灭活处理后，消毒剂-无PMA组、消毒剂-PMA处理组均为阳性，空白对照组为阴性，表明了有效氯浓度为320mg/L的消毒剂工作液处理非洲猪瘟病毒20min不能完全灭活。由图5、6和7可见，有效氯浓度350mg/L、360mg/L、380mg/L的消毒剂工作液20min灭活处理后，感染性病毒-无PMA组、感染性病毒-PMA处理组、消毒剂-无PMA组试纸条检测结果均为阳性，而消毒剂-PMA处理组和空白对照检测结果为阴性，说明350mg/L、360mg/L、380mg/L等浓度有效氯可以完全灭活本实验所用浓度的ASFV，但未能完全损毁其中的核酸，不经过PMA前处理仍能检测到阳性结果，但PMA的处理可以有效抑制这些暴露的DNA参与后续核酸扩增，从而消除了灭活病毒残留核酸造成的假阳性的结果。本发明评价方法的结果与HAD结果一致，证明了本发明评价方法的准确性和合理性。
综上，本发明构建了一种可快速评价含氯消毒剂对非洲猪瘟猪瘟病毒消毒效果的PMA-PCR-LFS方法，它兼具检测灵敏度高、适用于户外检测、检测成本低等众多优点，该方法的成熟应用对ASF防控水平的提升具有重要意义。
实施例4本发明评价方法的灵敏度试验
取病毒含量为106.28HAD50/mL的ASFV细胞上清液，采用PBS缓冲液(pH7.4)稀释，制备稀释度为100-10-6的感染性病毒稀释液，同时用PBS缓冲液(pH7.4)替代病毒稀释液作为空白对照组。各病毒稀释液及空白对照采用实施例1中的本发明评价方法进行检测。此外，为了对本发明评价方法的灵敏度做评估，使用OIE推荐的qPCR(参考文献King DP,Reid SM,Hutchings GH,Grierson SS,Wilkinson PJ,Dixon LK,Bastos ADS,Drew TW.Developmentof a
PCR assay with internal amplification control for the detectionof African swine fever virus[J].JVirol Methods,2003,107(1):53-61.)做对比验证。
本发明评价方法检测灵敏度分析中(图8)，稀释度为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的病毒稀释液检测结果为阳性，稀释度为10-6的病毒稀释液和空白对照检测结果为阴性，表明本发明评价方法对于该病毒液的检测灵敏可达到10-5稀释度，通过HAD检测，该稀释度为10-5的病毒稀释液的病毒含量为101.28HAD50/mL。OIE推荐的qPCR检测的灵敏度验证试验(图9)中，稀释度为100～10-5的病毒稀释液有明显扩增曲线，而稀释度为10-6的病毒稀释液和空白对照无扩增曲线，表明该方法对ASFV病毒稀释液的检测灵敏度也为10-5稀释度，即101.28HAD50/mL。综上，本发明评价方法对ASFV的检测限为101.28HAD50/mL，同OIE推荐qPCR有相同的检测灵敏度。
实施例5特异性试验
将两株ASFV病毒(CN2018和AH-2018-3，来源于中国动物卫生与流行病学中心)和7种非ASFV病毒(经典猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、口蹄疫病毒、猪细小病毒和猪流行性腹泻病毒)采用本发明评价方法进行检测，以验证本发明评价方法的特异性。同时，将本发明评价方法中所得PCR产物使用凝胶电泳做对比验证。
由图10可知，两株非洲猪瘟病毒样本在本发明评价方法和常规PCR检测中检测结果呈阳性，而非ASFV病毒，包括经典猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、口蹄疫病毒、猪细小病毒和猪流行性腹泻病毒，检测结果为阴性。因此，本发明评价方法对非洲猪瘟病毒有很好的特异性。
实施例6采用本发明评价方法评价消毒场所中非洲猪瘟病毒的消毒效果1.样本采集
使用一次性棉签，蘸取无菌生理盐水后于采用有效氯含量为10％(质量百分数)的二氯异氰脲酸钠粉消毒的养猪场中涂抹采样，涂抹时旋转棉签，尽量使棉签各部分均匀采集样本，涂抹面积约25cm2。涂抹完成后，将采样棉签放入含1mL无菌生理盐水的EP管中，折断采样棉签并盖好管盖。共采集6份环境样本，分别编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#。
2.环境样本处理
将1#、2#、3#、4#、5#和6#样本分别充分涡旋5min，1500rpm离心5min，各样本取100μL上清液通过红细胞吸附实验验证消杀效果；取200μL上清液作为待检样本，采用实施例1中评价方法进行检测，作为PMA处理组；各样本取200μL上清液加入50μL的PBS缓冲液(pH7.4)，暗处理10min后，从暗环境中取出静置20min，然后按照本实施例1中本发明评价方法中步骤2-4进行检测；各样本另取200μL上清液加入50μL的PBS缓冲液(pH7.4)，作为无PMA对照2组，按照本发明实施例4中qPCR方法进行检测，各组用250μL无菌生理盐水做1个空白对照。
红细胞吸附实验结果表明，消毒环境样本中无活病毒；由图12和图13对比可知，消毒处理后环境样本1#、2#、3#、6#中含有非洲猪瘟病毒或非洲猪瘟病毒核酸，4#和5#中不含非洲猪瘟病毒或非洲猪瘟病毒核酸；样本不经PMA处理，采用本发明评价方法中的PCR试纸条或OIE推荐qPCR方法均为非洲猪瘟病毒检测核酸阳性，不能准确体现消毒效果。由图11可知，采用本发明评价方法检测后，PMA处理组中1#、2#、3#、6#检测结果均为阴性，表明PMA处理能消除灭活病毒核酸的干扰，本发明方法能应用于环境样本中非洲猪瘟病毒消毒效果的快速评价。
实施例7
在本发明评价方法中，由于PCR试纸条的灵敏度很高，用于扩增p72基因的引物对(ASFV-1-F、ASFV-1-R)必须无任何引物二聚体的存在，否则会出现假阳性。发明人曾经自己设计了大量的引物对，也曾试验过文献报道的引物对。经过大量富有创造性的劳动，才获得由ASFV-1-F和ASFV-1-R组成的引物。
表1中列举了现有技术中公开的扩增p72基因的对照引物对1、2、3和4。对照引物对1和对照引物对2的核酸序列公开于文献1(李云灿,胡剑武,赵俊龙,等.非洲猪瘟病毒PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2021,42(5):5-8.DOI:10.3969/j.issn.1007-5038.2021.05.002.)，对照引物对3和对照引物对4的核酸序列公开于文献2(杨吉飞,关贵全,刘志杰,等.一种用于非洲猪瘟病毒检测的PCR方法[J].畜牧兽医学报,2011,42(8):1201-1206.)。对照引物对1、2、3、4的正向引物的5’端标记有地高辛，反向引物的5’端标记有生物素。
表1现有技术中公开的扩增p72基因的引物对
注：表中Digoxin表示地高辛，Biotin表示生物素。
分别将对照引物对1、2、3、4和本发明评价方法中引物对(ASFV-1-F、ASFV-1-R)，按照本发明评价方法中的25μL反应体系进行配制，不同之处仅在于使用无核酸酶水替代DNA模板，具体见下表。另外，设置空白对照，以无核酸酶水替代引物和DNA模板。
| 试剂 | 使用量 |
| TaKaRa Z-Taq(2.5U/μL) | 0.25μL |
| 10×Z-Taq Buffer(Mg2+plus) | 2.5μL |
| dNTP Mixture(10mM) | 2μL |
| ASFV-1-F(10μM) | 0.5μL |
| ASFV-1-R(10μM) | 0.5μL |
| 无核酸酶水 | 19.25μL |
| 总体积 | 25μL |
将各引物对的25μL反应体系和空白对照分别在ABI Veriti PCR仪中进行如下程序：98℃预变性3min；98℃5s，60℃10s，72℃10s，共35个循环扩增；72℃延伸3min。
反应结束后，从各体系中取6μL样品与54μL PBS缓冲液混合后，滴加于PCR试纸条检测并判断结果；另外，从各体系中取9μL样品与1μL的loading buffer混合后，进行琼脂糖凝胶电泳，以判断结果。
由图14可见，试纸条1-4的检测结果为阳性，试纸条5-6的检测结果为阴性；表明对照引物对1-4形成了引物二聚体，若用于替换本发明评价方法中的引物对，将产生假阳性结果。
由图15可见，泳道1-4均可见明显条带，泳道5无条带；表明采用现有技术中公开报道的引物及OIE推荐的非洲猪瘟病毒检测用PCR引物，经扩增后均产生了引物二聚体，若用于替换本发明评价发方法中的引物对，将产生假阳性结果。
综上，PCR试纸条的使用对引物设计的要求极为严格，在保证检测灵敏度的同时还需兼顾空间结构。众多研究者报道的非洲猪瘟病毒检测用PCR引物和OIE推荐的引物均会产生引物二聚体，应用于PCR试纸条会产生假阳性结果。本发明所述引物是经过大量富有创造性的劳动才获得的，应用于PCR扩增时无引物二聚体产生，可满足PCR试纸条的需求。
Claims (7)
1.一种非洲猪瘟病毒消毒效果的快速评价方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)从采用消毒剂消杀后的环境中取拭子样本或液体样本，离心取上清液作为待检样品；
(2)取待检样品，添加PMA工作液和PBS缓冲液，暗处理后曝光；提取总DNA，以所述总DNA作为模板，采用ASFV-1-F和ASFV-1-R为引物进行PCR扩增；所述ASFV-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，且在5’端标记有地高辛；所述ASFV-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，且在5’端标记有生物素；
(3)取PCR扩增产物与PBS缓冲液混合后，滴加于PCR试纸条的样品垫，放置后肉眼判读结果；所述PCR试纸条的检测线含有链霉亲和素，质控线含有羊抗鼠IgG抗体。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于当试纸条质控线和检测线均变红色，检测结果为阳性，判定为检出感染性非洲猪瘟病毒；当试纸条质控线变红色，且检测线不变色，检测结果为阴性，判定为未检出感染性非洲猪瘟病毒；所述PCR试纸条的金标垫上耦合有抗地高辛抗体。
3.根据权利要求1或2所述快速评价方法，其特征在于步骤(2)中所述PMA工作液的溶剂为二甲基亚砜水溶液，PMA的浓度为0.8-1.2mM；待检样品为180-220μL，PMA工作液为20-30μL，PBS缓冲液为20-30μL，暗处理时间为8-15min后，曝光时间为15-25min。
4.根据权利要求3所述快速评价方法，其特征在于步骤(2)中PCR扩增的体系为：TaKaRaZ-Taq 0.25μL，10×Z-Taq Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2μL，ASFV-1-F 0.5μL，ASFV-1-R0.5μL，总DNA 2μL，无核酸酶水17.25μL。
5.根据权利要求4所述快速评价方法，其特征在于步骤(2)中PCR扩增方法的程序如下：98℃预变性3min；98℃5s，60℃10s，72℃10s，35个循环；72℃延伸3min。
6.根据权利要求5所述快速评价方法，其特征在于步骤(3)中所述PCR扩增产物与PBS缓冲液的体积比为6：50-58。
7.一种非洲猪瘟病毒消毒效果快速评价试剂盒，其特征在于包括PMA工作液、PBS缓冲液、引物和PCR试纸条；所述PMA工作液的浓度为0.8-1.2mM；所述引物包括ASFV-1-F和ASFV-1-R，浓度为8-12μM；所述PCR试纸条的金标垫上耦合有抗地高辛抗体；检测线含有链霉亲和素，质控线含有羊抗鼠IgG抗体。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110184393A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-08-30 | 四川大学 | 一种检测非洲猪瘟病毒的引物组、用途、试剂盒及其检测方法 |
| CN112695137A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-04-23 | 武汉科前生物股份有限公司 | 猪伪狂犬病毒的PMA-qPCR检测方法 |
| CN112746134A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-05-04 | 华中农业大学 | 非洲猪瘟病毒核酸快速检测试剂盒与应用 |
| CN113462817A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-10-01 | 四川农业大学 | 检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的pcr引物、探针、试剂盒及检测方法 |
| CN113502352A (zh) * | 2021-07-01 | 2021-10-15 | 华中农业大学 | 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用 |
-
2022
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110184393A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-08-30 | 四川大学 | 一种检测非洲猪瘟病毒的引物组、用途、试剂盒及其检测方法 |
| CN112695137A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-04-23 | 武汉科前生物股份有限公司 | 猪伪狂犬病毒的PMA-qPCR检测方法 |
| CN112746134A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-05-04 | 华中农业大学 | 非洲猪瘟病毒核酸快速检测试剂盒与应用 |
| CN113502352A (zh) * | 2021-07-01 | 2021-10-15 | 华中农业大学 | 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用 |
| CN113462817A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-10-01 | 四川农业大学 | 检测非洲猪瘟病毒衣壳完整性的pcr引物、探针、试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王之莹;于文杰;谢瑞彬;乔璐;陈爱亮;: "利用侧流核酸试纸条快速检测非洲猪瘟病毒", 农业工程学报, no. 04, pages 302 - 307 * |
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