CN103436615A - 一种pcr-dgge\tgge\sscp引物筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的筛选方法，从所研究的微生物生态体系的菌群序列特性出发进行PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选，筛选指标包括引物对的匹配情况及其扩增片段的区分度、平均差异度、平均长度和平均GC含量，最适的引物对是通过综合比较各引物对之间指标的优劣来确定的。本发明选取的引物具有很强的针对性同时无需进行繁琐的多引物筛选或联用的实验操作工作，有助于采用PCR-DGGE\TGGE\SSCP技术对所研究微生态体系的菌群多样性进行快速而准确的解析。

Description

一种PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法
技术领域
本发明属于微生物分子生态学技术领域，具体涉及一种PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的筛选方法，特别是一种适合于所研究微生物生态体系菌群多样性解析的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的筛选方法。
背景技术
PCR-DGGE简称DGGE即变性梯度凝胶电泳、PCR-TGGE简称TGGE即温度梯度凝胶电泳和PCR-SSCP简称SSCP即单链构态多样性分析是三项DNA指纹技术，目前均已经成为微生物菌群多样性研究的重要手段。这三项技术可以用于分离长度相同但序列不同的DNA片段：对于DGGE和TGGE技术，双链DNA片段的分离是依靠其在含有化学变性剂梯度（DGGE）或温度梯度（TGGE）的凝胶当中泳动时具有不同的解链行为而实现的；对于SSCP技术，单链片段的分离是依靠其在低温下具有不同的构像而实现的。与微生物学传统研究手段相比，这三项微生物分子生态学技术最大的特点在于它们是不基于培养的方法——是以样品总DNA或RNA出发进行研究的，因此能检测到生态体系中大量的不可培养微生物。同时这三技术还具有可靠性强、重现性高、方便快捷的优点，目前被广泛应用于土壤、活性污泥、生物膜、动物肠道、湖泊等各种环境的微生物生态解析中。
PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的选择对于特定微生物生态中菌群多样性的研究十分关键：如果引物和研究体系中某些微生物种群不匹配，结果就会导致相关菌群的遗漏，甚至包括优势菌群；如果引物扩增的片段可变性不足，就难以通过DGGE\TGGE\SSCP获得全面准确的菌群多样性信息。因此既要求引物要从研究体系中各微生物种群共有的保守序列中选取，又需要引物扩增的片段在研究体系的各菌群中具有足够的可变性。目前针对rDNA序列已经开发出了一些常用的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物，而当前大多数菌群多样性研究往往只选择其中的一对引物开展——并未考查该引物是否适合于所研究体系，或者是否有更加合适的引物。有研究表明，选择不同的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物进行研究结果往往存在差异。针对适合于所研究体系菌群多样性研究的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的选择，有关研究表明可以采用比较不同类型的引物进行多样性分析的效果，然后从中筛选出最佳的引物；或者采用多对引物分别进行PCR-DGGE\TGGE\SSCP分析，最后共同解析菌群多样性。然而多对引物择优或者联用的研究策略将大大增加工作量，此外还是具有一定的盲目性。因此应该采用从所研究的菌群体系出发选取或者设计PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物的策略，这样则选取或者设计得到的引物将具有很强的针对性，同时无需进行繁琐的多引物筛选或联用的实验操作工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于序列特性分析的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法，从而实现对所研究微生态体系的菌群多样性进行快速而准确的解析。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法，其特征在于：从所研究的微生物生态体系的菌群序列特性出发进行PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选，筛选指标包括引物匹配情况及其扩增片段的区分度、平均差异度、平均长度和平均GC含量。
具体步骤如下：
步骤1：确定所研究体系涉及的微生物种属。
所研究体系涉及的微生物种属可以结合文献报道和前期研究进行确定，因此该方法更加适用于体系较为明确的研究。此外相关分析是基于已知涉及的菌群信息及其现有的DNA序列，随着相关研究的开展、进行和深入，菌群信息及其DNA序列将会得到更新或者补充，因此可以采用同样的方法进行完善。
步骤2：根据研究需要选择特定的DNA片段，收集步骤1所述微生物种属的该DNA片段并找出现有的靶向该片段的系列PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物对。
rDNA可变区常被选择作为菌群多样性研究的靶标片段，如采用16S rDNA的V3区研究细菌菌群多样性。而对于某一微生物种属，其特定DNA片段的检索最好是在专门的数据库中进行（如RDP：http://rdp.cme.msu.edu/ 和SILVA：http://www.arb-silva.de/ 等），所得序列将更加可靠和具有代表性；此外检索结果可能不止一条，应选择长度最长的作为代表。
步骤3：将步骤2中收集到的微生物种属的DNA序列和各引物对分别进行比对，分析各引物对的匹配情况。
各引物对和收集的微生物种属DNA的比对可以采用生物信息学软件Clustal完成。引物的匹配情况是指引物与所研究体系各微生物种属相应靶标序列的匹配情况，这决定了PCR扩增的成败以及扩增的好坏，将直接影响到对菌群多样性的准确而有效的解析。理想的情况是最优引物和所研究体系各微生物种属相应靶标序列均能够完全匹配，以保证最佳的扩增（; 邢德峰, 任南琪. 应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析. 微生物学报, 2006, 46（2）：331-335.）。 
步骤4：对各引物对扩增片段的序列特性进行包括区分度、平均差异度、平均长度和平均GC含量的分析。
引物一般设计在保守区内，其扩增的可变区片段需要尽可能多地区分研究体系中的微生物种属，这样才能保证获得准确而可靠的菌群多样性信息（59, 695-700; Ercolini, D., 2004. PCR-DGGE fingerprinting: novel strategies for detection of microbes in food. J Microbiol Methods. 56, 297-314.）；因此引物对扩增片段需要保证良好的区分度，这是非常重要的。对于所研究微生物体系，某一引物对扩增片段的区分度是指该片段序列存在差异的微生物种属数量占全体微生物种属数量的比例；该比例越高越好，最好的结果是1。对于某一引物对的扩增片段，各微生物种属之间该片段的差异度是指通过比对得到的差异碱基数占比对全长的百分数，这是一个与相似度相对的指标；而平均差异度为所有存在扩增片段序列差异的微生物种属片段差异度的平均值，表征了扩增片段的整体差异程度。由于序列差异越大其分离情况越复杂，因此平均差异度越低越好，其最低值在两两之间均只相差一个碱基的情况下取得（Lyons, J. 1994. Identification of mutant forms of G-protein a subunits in human neoplasia by polymerase chain reaction-based techniques. Meth. Enzymol. 237: 295-308; Colin R. Jackson, Eric E. Roden, Perry F. Churchill. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Can Fail to Separate 16S rDNA Fragments with Multiple Base Differences. Molecular Biology Today 2000. 1(2): 49-51.）。平均长度是指可变区核苷酸的平均数量，可变区长度一般在200bp-500bp之间（13, 3131-3145; Freeman, K., Woods, E., Welsby, S., Percival, S.L., Cochrane, C.A., 2009. Biofilm evidence and the microbial diversity of horse wounds; Can J Microbiol. 55, 197-202; Lee, S., Choi, B., Yi, S.-M., Ko, G., 2009. Characterization of microbial community during Asian dust events in Korea. Science of the Total Environment. 407, 5308-5314.），在此范围内一般越短分辨率越高。平均GC含量是指G碱基和C碱基之和占总碱基数的平均比例，相同长度的两个可变区相比，平均GC含量低的发生序列变异所引起的效果（解链或构象形成差异）会更明显，因此更有利于序列不同的片段的分离。
步骤5：根据各引物对的匹配情况和其扩增片段的序列特性进行综合分析，筛选最适的引物对。
进一步的，所述的步骤3和步骤4各引物对匹配情况及其扩增片段的序列特性，匹配情况和区分度是核心评估指标，需要首先保证良好的匹配度和区分度；而平均差异度、平均长度和平均GC含量是辅助评估指标，需要低的平均差异度、短的片段平均长度和低的平均GC含量。
进一步的，所述的步骤5各引物对的匹配情况及其扩增片段序列特性的综合分析将决定其是否适合于所研究微生物体系菌群多样性的解析，最适引物对是通过综合比较各引物对之间指标的优劣来确定的。
本发明是从所研究的微生物生态体系的菌群序列特性出发进行引物筛选的，因此选取的引物将具有很强的针对性，同时无需进行繁琐的多引物筛选或联用的实验操作工作，这样将有助于采用PCR-DGGE\TGGE\SSCP技术对所研究微生态体系的菌群多样性进行快速而准确的解析。
附图说明
图1是引物筛选方法实施步骤的简要流程。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
以红曲黄酒酿造体系中的真菌菌群为研究对象，通过三对靶向18S rDNA片段的引物对（FR1-FF390、NS3-YM951r和NS1-Fung）的匹配情况及其扩增片段序列特性的分析，筛选适合于该体系真菌菌群多样性研究的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物。具体步骤如下：
1、确定红曲黄酒酿造体系中的真菌菌群信息
根据本发明实施例的前期研究（Identification and characterization of filamentous fungi isolated from fermentation starters for Hong Qu glutinous rice wine brewing. Xu-Cong Lv, Zhi-Qing Huang, Li Ni*, et al. The Journal of General & Applied Microbiology.2012,58（1）:33-42.另有部分结果尚未发表）和查阅相关文献，确定出红曲黄酒酿造体系中的主要真菌菌群共15种，如表1所示。
2、收集18S rDNA近全长序列
根据表1在SILVA数据库中检索各真菌种属的18S rDNA近全长序列（真菌的18S rDNA序列全长约有1800bp，但是目前数据库中仅有少数真菌种属的18S rDNA全长序列，因此本实施例收集的是18S rDNA近全长序列，至少不少于1500bp），检索结果出现多条序列的则在保证测序质量的前提下选择最长的那条。各真菌种属18S rDNA近全长序列的Accession Number情况详见表1。
Figure 516201DEST_PATH_IMAGE001
注：表中各真菌的18S rDNA序列均来源于Silva数据库，序列收集以2013.7.1的SILVA数据库为准。表中长度仅代表收集到序列长度，而非18S rDNA全长。
FR1-FF390、NS3-YM951r和NS1-fung是常用的三对真菌PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物（需要加上GC夹子），这三对引物的靶标片段都是18S rDNA，它们各自的扩增片段分别为FR1-FF390：1317-1665、NS3-YM951r：553-952、NS1-Fung：20-368（以Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列——Accession Number为Z75578的序列为参考）。三对引物对的序列分别为FR1：AICCATTCAATCGGTAIT，FF390：CGATAACGAACGAGACCT，NS3：GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC，YM951r：TTGGCAAATGCTTTCGC，NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC，Fung：ATTCCCCGTTACCCGTTG。其中FR1引物中的I碱基表示的是次黄嘌呤碱基，该碱基能与A或者C互补配对。
3、三对引物对匹配性情况分析
下载这15条序列，用Clustalx软件（Clustalx1.8）分别将三对引物对和收集的15条序列的体系进行比对分析，配对情况结果详见表2。
Figure 433342DEST_PATH_IMAGE003
注：在收集的15条序列中，有6条缺失了NS1引物的匹配区域，所述分析是基于其余9条序列做出的。由于NS1是常用的真菌通用引物，因此认为其还是具有很高的适用性。
引物FF390和NS3完全匹配，引物FR1、NS1、Fung只有个别存在不匹配，而引物YM951r匹配性较差（表2）。因此通过初步分析，引物对FR1-FF390和NS1-Fung只有个别存在不匹配，总体匹配性良好，可以应用于红曲黄酒酿造体系中的真菌菌群多样性研究；而引物对NS3-YM951r匹配性较差，需要进行改造。
4、三对引物对扩增片段的序列特性分析
统计三对引物扩增片段的序列特性，相关特性是在利用EMBL-EBI提供的ClustalW2进行比对的基础上进行结果的统计和分析下得出的，结果如表3所示。
Figure 2013103723135100002DEST_PATH_IMAGE004
对于表3从区分度来看，引物对NS3-YM951r的扩增片段只能区分15种中的10种，是最少的，而引物对FR1-FF390和NS1-Fung的扩增片段能区分的数量是一样的都是12种，区分度少也就意味着多样性信息可能会受影响。引物对NS3-YM951r的扩增片段平均差异度是最高的达到了12.85%，而引物对FR1-FF390和NS1-Fung的扩增片段平均差异度分为为8.42%和9.48%，两者较为接近都比NS3-YM951r的小较多。在存在差异的序列中，如果平均差异程度较高，不仅会使得分离情况更加复杂，而且有可能导致同一种出现多条条带的情况。除了区分度和平均差异度不佳外，引物对NS3-YM951r扩增片段的平均长度也是最长的，将会影响分辨率；虽然其平均GC含量较低为47.15%，然而并非最低的，在三对引物中只是居中。引物对NS1-Fung扩增片段的平均长度为329bp是三者中最短的，同时其平均GC含量也是三者中最低的。
5、最适引物筛选和验证
从引物对的匹配情况以及其扩增片段的区分度这两项核心指标来看，引物对NS3-YM951r都是最差的，此外其平均差异度是最大的、平均长度是最长的、平均GC含量居中，因此排除NS3-YM951r这对引物对。对比FR1-FF390和NS1-Fung这两对引物对，两者与所研究体系菌群匹配情况均属良好且个别不匹配的都可以略加改进；此外，两者的区分度一样。从其它三项辅助指标来看，引物对NS1-Fung扩增片段的平均长度最短为329bp、平均GC含量最低为41.42%，而平均差异度则和引物对FR1-FF390的接近。此外，由于引物对FR1-FF390中的FR1的合成需要用到两个次黄嘌呤碱基I（参见其序列），导致其整体价钱较为昂贵，是普通引物的数倍。因此在分析的三对引物对中，引物对NS1-Fung是最佳引物，即其最适合于红曲黄酒酿造体系真菌菌群多样性解析的。
从十几种典型的红曲黄酒酿造用曲中分离得到了24株真菌纯菌株，分别采用上述三对靶向18S rDNA不同可变区的引物对（FR1-FF390、NS3-YM951r和NS1-Fung，其中FR1、NS3和Fung需要加GC夹子）进行扩增，最后利用DGGE技术解析该体系（1. 黄志清. 红曲黄酒酿造体系中真菌分子生态学方法的构建与应用[D]. 福建: 福州大学, 2012.；2. 吕旭聪. 红曲黄酒酿造微生物学研究[D]. 福建: 福州大学, 2012.）。结果（吕旭聪. 红曲黄酒酿造微生物学研究[D]. 福建: 福州大学, 2012.）发现：对于该24株纯菌体系，三对引物均能成功实现扩增；然而，不同扩增片段的DGGE指纹图谱存在着差异。在所使用的DGGE分离条件下，引物对NS1-Fung、FR1-FF390和NS3-YM951r的区分度分别为22/24、17/24和15/24。由此可见，引物对NS1-Fung比FR1-FF390和NS3-YM951r更适合于解析红曲黄酒酿造体系真菌菌群多样性，这与本研究提出的引物筛选方法分析出的结果是一致的。
以上是本发明的较佳实施例，凡依本发明技术方案所作的改变，所产生的功能作用未超出本发明技术方案的范围时，均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法，其特征在于：从微生物生态体系的菌群序列特性出发进行PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选，筛选指标包括引物匹配情况及其扩增片段的区分度、平均差异度、平均长度和平均GC含量。
2.根据权利要求1所述的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤1：确定所研究体系涉及的微生物种属；
步骤2：根据研究需要选择特定的DNA片段，收集步骤1所述微生物种属的该DNA片段并找出现有的靶向该片段的系列PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物对；
步骤3：将步骤2中收集到的微生物种属的DNA序列和各引物对分别进行比对，分析各引物对的匹配情况；
步骤4：对各引物对扩增片段的序列特性进行包括区分度、平均差异度、平均长度和平均GC含量的分析；
步骤5：根据各引物对的匹配情况和其扩增片段的序列特性进行综合分析，筛选最适的引物对。
3.根据权利要求2所述的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法，其特征在于：所述的步骤3和步骤4各引物对匹配情况及其扩增片段的序列特性，匹配情况和区分度是核心评估指标，需要首先保证良好的匹配度和区分度；而平均差异度、平均长度和平均GC含量是辅助评估指标，需要低的平均差异度、短的片段平均长度和低的平均GC含量。
4.根据权利要求2所述的PCR-DGGE\TGGE\SSCP引物筛选方法，其特征在于：所述的步骤5各引物对的匹配情况及其扩增片段序列特性的综合分析将决定其是否适合于所研究微生物体系菌群多样性的解析，最适引物对是通过综合比较各引物对之间指标的优劣来确定的。
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