KR100991219B1

KR100991219B1 - 인삼과 화기삼의 구별을 위한 마커, 상기 마커를 증폭하기위한 프라이머, 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR100991219B1
Application number: KR1020080076367A
Authority: KR
Inventors: 양태진; 김준하; 최홍일
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2008-08-05
Filing date: 2008-08-05
Publication date: 2010-11-01
Anticipated expiration: 2028-08-05
Also published as: KR20100016756A

Abstract

본 발명은 인삼(Panax ginseng)과 화기삼(Panax quinquefolius) 엽록체 게놈에서 다형성을 나타내는 2종의 새로운 InDel(insertion and deletion) 마커와 9종의 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커, 상기 마커를 증폭하기 위한 프라이머, 상기 프라이머를 이용한 빠르고 정확한 인삼과 화기삼을 구별하는 방법, 상기 프라이머를 포함하는 인삼과 화기삼을 구별하기 위한 키트, 상기 마커가 고정화된 기판을 갖는 마이크로어레이 및 상기 마커와 프라이머를 이용한 혼성화를 통해 빠르고 정확한 인삼과 화기삼을 구별하는 방법에 관한 것이다.

인삼, 화기삼, 엽록체 게놈, 다형성, InDel, SNP, 마커, 프라이머, 마이크로어레이, 키트

Description

인삼과 화기삼의 구별을 위한 마커, 상기 마커를 증폭하기 위한 프라이머, 및 이들의 용도{Marker for discrimination of Panax ginseng and Panax quinquefolius, primer for amplifying the marker, and uses thereof}

본 발명은 인삼과 화기삼의 구별을 위한 마커, 상기 마커를 증폭하기 위한 프라이머, 및 이들의 용도에 관한 것으로서, 우리나라에서 재배되는 고려인삼(高麗人蔘)과 미국, 캐나다 등지에서 재배되는 화기삼(花旗蔘)의 종(種)이 다른 점을 감안하여 인삼 세포 내 엽록체 게놈 DNA의 염기서열 차이를 이용한 종간 구별 방법을 분자생물학적인 방법을 통해 정립한 것이다.

최근 건강에 대한 관심 고조로 인삼 가공품류 (홍삼분말, 백삼분말, 홍삼정)의 일본 및 미국 수출이 점진적 증가 추세에 있다. 고려인삼의 주요시장은 홍콩, 일본, 대만 등이지만 인삼의 세계적 집산지로 거래량의 70%를 차지하는 홍콩시장에서 고려인삼의 점유율이 하락 추세에 있어 이에 대한 대책이 시급한 형편이다.

한국인삼의 생산비는 2007년도 기준 21,317원/kg으로 중국인삼 3,590원/kg의 5.9배, 캐나다삼 8,604원/kg의 2.5배에 해당한다. 10a당 생산량도 미국이나 캐나다에 비하여 크게 낮으며 이는 생산비를 높이는 요인 중의 하나이다. 한국인삼의 가 격 경쟁력 역시 이러한 생산비와 생산량을 바탕으로 매우 낮으며, 홍콩 시장의 홍삼가격을 기준으로 한국삼은 중국삼의 12배, 미국삼의 5배, 캐나다삼의 8배에 해당한다. 이러한 양상은 캐나다와 중국의 인삼 재배면적의 확대 및 저가 공세로 인해 고려인삼의 소비위축을 더욱 촉진시키고 있다.

미국과 캐나다삼 (화기삼)은 시장점유율의 지속적 우위로 최근 60% 이상의 시장 점유율을 보이면서 세계 인삼 시장을 주도하고 있다. 우리나라의 2004년도 인삼 수입액은 수출액 대비 7% 수준이며, 주요 수입국은 중국(72%, 407만불), 스위스(21%, 116만불), 일본(4%, 22만불) 순이다. 주된 수입 형태는 중국의 경우 엑기스 등 가공원료이고 스위스나 일본으로부터는 캡슐 등의 의약품 형태이다. 수입 자유화 품목인 인삼정 등 백삼제품의 수입이 증가되고 있는데, 특히 2004년 전면적 수입자유화로 관세율 인하에 따른 저가삼이 대량 유입되고 있으며, 이에 따른 국내 인삼시장 및 생산 기반의 약화가 우려된다.

인삼의 판별은 지금까지 주로 외형적인 특징 및 이화학적인 분석에 의존해서 이루어져 왔다. 하지만 이러한 식별은 그 기준이 불명확하고 개체 간에도 차이가 있는데, 특히 이화학적 분석의 대상이 되는 2차 대사 산물은 식물체의 연령이나 생육환경 등에 따라 변이를 나타내기 때문에 품종을 정확히 구별하는 척도로서는 이용되기 어려운 경우가 많다. 식물체의 이러한 외형적, 이화학적 특성과는 달리 유전적인 성질은 환경에 따른 변화가 적고 변이가 거의 없는 고유한 정보이기 때문에 그 기본 구조인 DNA를 이용한 분석은 식물체의 분류 또는 종간 구별에 있어 매우 유용한 도구로서 활용되고 있다. 따라서 외형적으로 쉽게 차이를 확인할 수 없거나 가공 과정을 통해 외형이 훼손되거나 성분에 변화가 생겨 판별이 어려울 경우 이러한 DNA 마커를 효율적으로 이용할 수 있다.

우리나라는 이미 인삼가공제품의 원료를 '고려인삼'과 '화기삼'으로 구분하여 표기하도록 하고 있지만, 이러한 표기는 소비자의 눈에 쉽게 띄지 않을뿐더러 화기삼을 원료로 하고 있음에도 상표명을 마치 고려인삼인 양 판매되고 있는 경우가 많다. 또한 상대적으로 값싼 화기삼이 가공과정 초기부터 고려인삼으로 둔갑되어 사용될 가능성이 있기 때문에 성분 유무를 쉽게 확인할 수 없는 인삼가공품의 원료에 대한 분석방법은 국내 인삼시장의 보호라는 측면에서도 절실한 상황이다. 이는 앞으로의 자유무역시대에 다가올 우리나라의 인삼 산업의 흥망과 직관된 문제이기도 하다.

고려인삼은 사포닌의 종류가 많아서 우수하다는 주장을 하고 있는 동안 미국과 캐나다 등에서 고려인삼은 열을 발생시키는 작용이 있고 화기삼은 열을 낮추는 작용이 있다는 선전으로 동남아시아를 중심으로 하는 아열대 지방의 화기삼 소비를 촉진시키고 있다. 우리나라의 경우에 소비자의 인식이 아직까지는 외형과 인지도에서 떨어지는 화기삼보다는 예로부터 전해오는 고려인삼을 월등히 선호하고 있기는 하지만, 인삼가공업자들에게 있어서 상대적으로 값싼 화기삼이 더욱 매력적일 수밖에 없다. 이러한 값싼 원료에 대한 선호도는 WTO나 FTA 등의 자유무역추세와 맞물려 화기삼의 국내 유통을 더욱 활발하게 할 것으로 생각된다. 따라서 현재 개발된 DNA 마커의 경우 신속하고 정확한 고려인삼과 화기삼의 구별에 효과적으로 응용될 수 있을 것으로 예상된다.

원료삼이 고가로 판매됨에 따라 홍삼 가격 역시 가격이 높게 형성되고 있다. 값비싼 원료삼으로 가공품을 만들면 가공품 역시 고가로 판매될 수밖에 없다. 한국인삼공사의 홍삼이 품질의 우수성을 내세워 고가 전략으로 일관하는 동안 외국에서는 자국의 수삼으로 홍삼을 만들어 저가로 수출하여 국제시장을 장악하고 있다. 국제 사회에서 가격경쟁력이 없으면 수출은 감소하고 밀수가 증가할 수밖에 없다. 세계적인 물가 상승과 고려 홍삼의 낮은 가격경쟁력은 양질의 값싼 외국산 홍삼의 유통과 소비를 더욱 장려하고 있다. 물론 외국산 홍삼의 소비를 막을 수는 없지만 고려 홍삼과 외국산 홍삼을 구별하기 위한 DNA 마커는 유용하게 이용될 것이다.

한국특허등록 제10-842434호에는 인삼에서 유래된 SSR 프라이머 및 이의 용도가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-742712호에는 인삼과 화기삼 간의 종간 다형성을 나타내는 마이크로새틀라이트 마커, 및 이를 증폭하기 위한 프라이머가 개시되어 있으나, 본 발명의 마커와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 고려인삼과 화기삼 간의 동정을 가능하게 하는 새로운 DNA 마커를 개발하기 위하여 인삼 엽록체를 이용한 지속적인 연구를 수행한 결과, 총 11종의 새로운 엽록체 DNA 마커를 밝혀내었고, 이들이 고려인삼과 화기삼 간의 식별에 적합함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인삼(Panax ginseng)과 화기삼(Panax quinquefolius) 엽록체 게놈에서 다형성을 나타내는 2종의 새로운 InDel(insertion and deletion) 마커와 9종의 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마커를 증폭하기 위한 프라이머를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머를 이용한 빠르고 정확한 인삼과 화기삼을 구별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머를 포함하는 인삼과 화기삼을 구별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마커가 고정화된 기판을 갖는 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마커와 프라이머를 이용한 혼성화를 통해 빠르고 정확 한 인삼과 화기삼을 구별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 마커를 아가로스 겔 상에서 쉽고 빠르게 확인하기 위한 염기서열 특이적 프라이머를 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명은 인삼과 화기삼 간의 식별을 가능하게 하는 엽록체 DNA 마커를 제공하여, 화기삼에 비해 약리효과가 월등히 뛰어난 인삼 산업을 보호하고 더불어 정확한 판별방법을 확보함으로써 정확한 품질관리 및 신뢰성 있는 원재료의 공급으로 관련 농가 및 생물소재산업을 활성화하는데 널리 활용될 수 있다.

인삼과 화기삼 간의 구별을 통해 상대적으로 귀한 약재인 인삼 시장의 보호 및 인삼 유래 다양한 제품들의 원재료에 대한 투명성을 확보하고 인삼과 화기삼 간의 명확한 판별 및 혼입 정도를 DNA 분석을 통해 신속 정확하게 판별함으로써 유통 판매중인 인삼 제품의 원재료 구성과 그 기원을 밝혀 상대적으로 값싼 화기삼이 인삼으로 둔갑되어 이용되는 것을 막고, 또한 인삼 제품에 대한 정확한 품질관리 및 신뢰성 있는 인삼 제품의 경쟁력 확보뿐 아니라 FTA 등에 대비하여 화기삼 원재료가 공급되어 유통시 원재료에 대한 명확한 자료 제시가 되게끔 모니터링하는데 유용하다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 인삼(Panax ginseng)과 화기삼(Panax quinquefolius) 을 구별하기 위한 마커를 제공한다. 상기 마커는 구체적으로는 서열번호 1 내지 5, 7 내지 10의 염기서열로 이루어진 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 및 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 InDel(insertion and deletion) 마커로 이루어진다 (도 1 참고).

본 명세서에서, '인삼'은 특별한 언급이 없는 한, 고려인삼(Panax ginseng)을 말한다.

본 발명은 고려인삼과 화기삼 간의 유전적인 차이를 확인할 수 있는 DNA 마커의 개발에 관한 것으로서, DNA 마커를 개발하기 위하여 인삼 시료를 수집하고 엽록체 DNA를 추출하여 이미 완전히 해독된 인삼 엽록체 게놈 염기서열에 기반하여 제작한 프라이머를 이용하여 증폭시키고, 이후 분자생물학적인 방법을 통해 고려인삼과 화기삼 엽록체 DNA의 다형성(polymorphism)을 분석하여 실제 눈으로 확인할 수 있는 종간의 차이점을 발견하였다.

식물의 엽록체 게놈은 한 개의 세포에 동일한 엽록체 게놈이 수백 개 이상 존재하기 때문에 핵 게놈에 비해 상대적으로 분석이 용이하고, 양친 유전자간의 교잡 없이 모계 유전을 통해서만 후대로 전이되어 종내 변이가 거의 없기 때문에 특정 종 혹은 동일 종내 특정 계통을 구분하는 마커로서 가장 신뢰할 수 있으면서도 신속하게 분석할 수 있는 마커이다.

인삼 엽록체 게놈은 2004년 김 등에 의해 이미 그 염기서열이 완전히 해독되었는데, 본 발명에서는 알려진 엽록체 게놈의 정보를 이용하여 인삼과 화기삼을 포함하는 다른 근연종을 구분할 수 있는 종 특이 변이를 탐색하여 마커를 개발하고자 하였다. 이러한 유전적 변이는 생명현상에 필수적인 유전자(gene) 지역보다는 유전자와 유전자 사이에 해당하는 유전자간 부위(intergenic region)에서 더욱 빈번하게 발생하는 것으로 알려져 있고, 이러한 중간 지역에서의 변이가 최근에 여러 가지 생명현상에 직간접적인 영향을 끼치는 것으로 확인되고 있기 때문에 이 지역에서 나타나는 다형성에 대한 연구는 앞으로의 유전자의 기능을 밝히는 연구에 큰 도움이 될 것이다. 본 발명 역시 이러한 이론적인 배경을 토대로 실시되었으며, 본질적으로 품종간의 정확한 판별 방법 개발이 요구되는 고려인삼과 화기삼의 식별에 대해서 엽록체 게놈 내 유전자간 부위를 이용한 마커를 개발하여 활용하고자 수행되었다.

총 10개의 프라이머 지역에서 11개의 다형성을 확인하였다. 대부분 다형성의 형태는 SNP(single nucleotide polymorphism)였고 InDel(insertion and deletion)은 두 곳의 마커 지역에서 나타났다. 엽록체 게놈상의 rbcL 내지 accD 지역에서는 특이적으로 두 개의 다형성이 발견되었다 (서열번호 5). 고려인삼과 화기삼의 구별을 위해 제작된 프라이머와 이를 이용해서 밝혀낸 마커는 표 1과 표 2에 나타내었다.

하기 표 1은 인삼 엽록체 게놈상의 DNA 마커를 나타낸다. 적색 부분은 유전적 다형성(polymorphism)을 나타내고, 황색 부분은 마커의 증폭을 위해 사용한 프라이머를 표시한다.

표 1. 인삼 엽록체 게놈상의 DNA 마커

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 1의 SNP 마커는 서열 내의 적색으로 표시된 부분에서 인삼은 T인 반면, 화기삼은 C이며, 서열번호 2의 SNP 마커는 서열 내의 적색으로 표시된 부분에서 인삼은 TT인 반면, 화기삼은 GA이며, 서열번호 3의 SNP 마커는 서열 내의 적색으로 표시된 부분에서 인삼은 A인 반면, 화기삼은 C이며, 서열번호 4의 SNP 마커는 서열 내의 적색으로 표시된 부분에서 인삼은 T인 반면, 화기삼은 C이며, 서열번호 5의 SNP 마커는 서열 내의 적색으로 표시된 부분에서 인삼은 A인 반면, 화기삼은 C이며, 서열번호 7의 SNP 마커는 서열 내의 적색으로 표시된 부분에서 인삼은 A인 반면, 화기삼은 C이며, 서열번호 8의 SNP 마커는 서열 내의 적색으로 표시된 부분에서 인삼은 G인 반면, 화기삼은 C이며, 서열번호 9의 SNP 마커는 서열 내의 적색으로 표시된 부분에서 인삼은 G인 반면, 화 기삼은 T이며, 서열번호 10의 SNP 마커는 서열 내의 적색으로 표시된 부분에서 인삼은 G인 반면, 화기삼은 A이다.

서열번호 5의 InDel(insertion and deletion) 마커는 서열 내의 적색으로 표시된 부분에서 인삼은 GTTGGAAT가 존재하는 반면, 화기삼은 상기 8bp 서열이 삭제되어 있으며, 서열번호 6의 InDel 마커는 서열 내의 적색으로 표시된 부분에서 인삼은 23bp가 존재하는 반면, 화기삼은 23bp 서열이 중복되어 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 11 내지 33 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 인삼(Panax ginseng)과 화기삼(Panax quinquefolius)을 구별하기 위한 마커를 증폭하기 위한 프라이머를 제공한다.

고려인삼과 화기삼의 구별을 위해 제작된 프라이머는 하기 표 2에 나타낸다.

표 2. 마커 증폭을 위한 프라이머

상기 프라이머는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머가 하나의 세트로 구성되며, 서열번호 1의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍으로 이루어지며, 서열번호 2의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍으로 이루어지며, 서열번호 3의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍으로 이루어지며, 서열번호 4의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 17 및 18의 프라이머 쌍으로 이루어지며, 서열번호 5의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍으로 이루어지며, 서열번호 6의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 21 및 22의 프라이머 쌍으로 이루어지며, 서열번호 7의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 23 및 24의 프라이머 쌍으로 이루어지며, 서열번호 8의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍으로 이루어지며, 서열번호 9의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 27 및 28의 프라이머 쌍으로 이루어지며, 서열번호 10의 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍으로 이루어진다.

본 명세서에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레 오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 5에서 나타난 InDel 마커를 이용하여 아가로스 겔 상에서 PCR 밴드의 유무만으로 고려인삼과 화기삼을 구별할 수 있는 염기서열 특이적인 프라이머를 제작하였고 (표 3), 이를 이용하여 직접 겔 상에서 고려인삼과 화기삼을 구별하였다 (도 3 참고).

표 3. 염기서열 특이적 프라이머

본 발명은 또한, 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11 내지 33 중 어느 하나의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 동정하는 단계를 포함하는, 인삼(Panax ginseng)과 화기삼(Panax quinquefolius)을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료는 인삼 또는 화기삼일 수 있다. 상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11 내지 33 중 어느 하나의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 인삼에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액 은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl₂ 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg² ⁺가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭 산물이 증가하고, Mg² ⁺가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다.

상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 동정하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 동정은 InDel 마커의 경우에는 증폭 산물을 겔 전기영동함으로써 수행될 수 있다. 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. SNP 마커의 경우에는 증폭 산물을 SNP 자리를 자르는 적당한 제한효소로 절단하여 절단 산물을 전기영동하거나 증폭 산물을 직접 시퀀싱함으로써 동정할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 프라이머를 포함하는 인삼(Panax ginseng)과 화기삼(Panax quinquefolius)을 구별하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 필요에 따라 제한효소를 포함할 수 있으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 마커가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 명세서에서, "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다. 마커에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.

용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기 판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂ 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한,

대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11 내지 33 중 어느 하나의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;

상기 증폭 산물을 본 발명의 마커와 혼성화하는 단계; 및

상기 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는, 인삼(Panax ginseng)과 화기삼(Panax quinquefolius)을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서, 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계 및 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11 내지 33 중 어느 하나의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계는 전술한 바와 같이 수행할 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 본 발명의 마커와 혼성화하는 단계 및 상기 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함한다. 증폭 산물을 본 발명의 마커와 혼 성화할 때, SNP 마커의 경우에는 엄격도 (stringency)를 높여, 즉 혼성화 온도를 높이고 염 농도를 낮추어 서열 유사성이 매우 높은 것만 혼성화할 수 있는 조건하에 혼성화를 수행하며, InDel 마커의 경우에는 SNP 마커의 경우보다는 덜 엄격한 조건에서 혼성화를 수행한다. 예를 들면, 인삼 유래의 증폭 산물은 본 발명의 마커와 혼성화를 할 것이며, 화기삼 유래의 증폭 산물은 본 발명의 마커와 혼성화하지 않을 것이다.

본 명세서에 있어서, "혼성화"란 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 과정을 말한다. 본 발명의 방법에 있어서 상기 혼성화는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 수행되는 것인 방법이다.

또한, 본 명세서에 있어서, "엄격도 (stringency)"란 혼성화 및 그 후의 처리 단계 동안 존재하는 온도 및 용매 조성을 기술하기 위하여 사용되는 용어이다. 높은 엄격도 조건하에서는 고도로 상동적인 핵산 혼성체가 형성될 것이다. 즉, 충분한 정도의 상보성이 없는 혼성체는 형성되지 않을 것이다. 따라서, 분석 조건의 엄격도는 혼성체를 형성하는 2 핵산 가닥 사이에 필요한 상보성의 양을 결정한다. 엄격도는 표적과 비표적 핵산과 형성된 혼성체 사이의 안정성의 차이를 최대화하기 위하여 선택된다.

혼성화 정도를 검출하기 위해, 상기 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 본 구체예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표 지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.

본 발명의 방법은 검출가능한 신호를 발생시키는 물질로 상기 PCR 산물을 표지하고, 이를 상기 마커와 혼성화시키고, 그로부터 발생하는 신호를 검출하여 이루어질 수 있다. 상기 검출가능한 신호는 예를 들면, 광학적 신호 또는 전기적 신호가 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 광학적 활성 물질은 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신(fluorescein), Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 또한, 상기 PCR 산물은 혼성화 전 또는 후에 검출가능한 신호를 발생시키는 물질로 표지되거나, 표지되어 있지 않을 수 있다. 표지되어 있지 않은 경우의 상기 PCR 산물과 마커의 혼성화 결과는 예를 들면, 전기적 신호를 통하여 검출할 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 있어서 상기 마커는 마이크로어레이의 기판 상에 고정화될 수 있다. 마이크로어레이 기판 상에 고정화되는 마커에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 인삼 시료의 준비 및 게놈 DNA 의 추출

실험을 위한 재료로 국내외에서 재배중인 고려인삼 13종과 화기삼 3종, 화기삼(母)과 고려인삼(父) 종간교잡 1종, 죽절삼(P. japonicus) 1종을 사용하였다. 18개 종은 KT&G(Korea Tobacco and Ginseng)의 실험 포장에서 수집하였다. 엽록체 DNA의 추출은 CTAB 방법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980)을 통해서 실시하였다.

실시예 2: 본 발명의 프라이머의 디자인 및 마커의 선발

프라이머는 완전 해독된 인삼 엽록체 염기서열에서 100~500bp, 500~1000bp의 지역을 증폭시킬 수 있도록 제작하였다. 약 156kb에 해당하는 고려인삼 엽록체 게놈에서 총 89개의 프라이머 조합을 제작하였고, 그 중 60개 조합을 이용하여 DNA 상의 다형성을 확인하였다.

총 10개의 프라이머 지역에서 11개의 다형성을 확인하였다. 각각의 길이는 200~500bp, 700bp이었다. 대부분 다형성의 형태는 SNP(single nucleotide polymorphism)였고, InDel(insertion and deletion)은 두 곳의 마커 지역에서 나타났다. 엽록체 게놈상의 rbcL 내지 accD 지역에서는 특이적으로 두 개의 다형성이 발견되었다 (서열번호 5). 고려인삼과 화기삼의 구별을 위해 제작된 프라이머와 이를 이용해서 밝혀낸 마커는 표 1과 표 2에 나타내었다.

추출된 엽록체 DNA는 완전히 해독된 인삼 엽록체 염기서열에 기반하여 제작된 프라이머를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 증폭시켰고, 아가로스 겔과 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 증폭된 DNA의 길이를 확인하였다. 또한, DNA에 형광염색시약(Syto9)을 붙인 후 Light Cycler

을 이용하여 HRM(high resolution melting) 곡선을 그어 염기서열에 따른 흡광도를 분석하여 인삼과 화기삼 간 염기서열 차이를 확인하였다 (도 2).

HRM 곡선은 실시간(realtime) PCR을 이용한 결과를 나타낸 것으로, 증폭된 PCR 산물에 형광염색시약인 Syto9을 넣고(DNA 이중나선 상태에서만 발광) 95℃에서 1분, 40℃에서 1분, 70℃에서 5초간 반응시켜 DNA와 Syto9 염색시약을 안정되게 결합시킨 후, 70℃부터 90℃까지 8분 동안 서서히 온도를 증가시켜 이중나선 DNA를 단일나선으로 변성될 때 Syto9이 DNA로부터 분리되며 발광이 줄어드는 변화를 온도(℃) 당 25회 단위로 측정하여 그래프로 나타낸 것이다 (도 2).

최종적으로 ABI3730XL 자동염기서열 분석기(sequencer)를 이용하여 다형성을 나타내는 마커의 게놈상 실제 염기서열을 확인하였다 (표 1).

실시예 3: 본 발명의 마커 특이적인 프라이머를 이용한 고려인삼과 화기삼의 구별

서열번호 5에 나타난 InDel 마커를 이용하여 아가로스 겔 상에서 PCR 밴드의 유무만으로 고려인삼과 화기삼을 구별할 수 있는 염기서열 특이적인 프라이머를 제작하였고 (표 3), 이를 이용하여 직접 겔 상에서 고려인삼과 화기삼을 구별하였다 (도 3 참고). 자세한 프라이머 조합은 표 3에 기재되어 있다. PCR 조건은 하기와 같다: 1) 예비변성 94℃ 4분, 2) 38 사이클 (변성 94℃ 15초, 어닐링 60℃ 18초 (조합 1)/63℃ 8초 (조합 2)/61℃ 16초 (조합 3), 연장 72℃ 30초), 3) 최종연장 72℃ 7분.

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 인삼에 특이적인 프라이머 조합 1 및 2는 인삼을 특이적으로 검출하였으며 (도 3의 레인 2 내지 8 및 13 내지 17), 화기삼에 특이적인 프라이머 조합 3은 화기삼을 특이적으로 검출하였다 (도 3의 레인 9 내지 12).

도 1은 고려인삼 엽록체 전체 게놈 지도를 나타낸다. 적색 부분은 고려인삼과 화기삼에서 다형성을 나타내는 마커 부위이며, 녹색 부분은 마커 부위를 증폭시키기 위한 프라이머 이름이며, 청색 부분은 유전자 부위와 유전자간 부위(intergenic region)을 모두 포함하는 부분으로 inverted repeat 지역 한 곳은 중복을 피하기 위해서 제외하였다.

도 2는 HRM(high resolution melting) 곡선을 이용한 고려인삼과 화기삼의 구별 방법을 나타낸 것이다.

도 3은 서열번호 5의 마커 내의 프라이머 조합 1, 2, 3을 이용한 아가로스 겔 전기영동 상의 PCR 산물을 나타낸 것이다. 레인 1: 1kb 크기 마커, 레인 2~8: 고려인삼 (Panax ginseng) 품종 (레인 2 내지 8은 순서대로 금풍, 재래황숙, 천풍, 연풍, 고풍, 선원, 자경), 레인 9~12: 화기삼 (Panax quinquefolius) 품종 (레인 9 내지 13은 순서대로 화기삼x고려인삼 F₁ 교잡종, 미국삼, 캐나다삼, 중국산 미국삼(중국 길림성)), 레인 13: 죽절삼 (Panax japonicus), 레인 14~17: 외국산 인삼 (Panax ginseng) 품종 (레인 14 내지 17은 순서대로 미마끼(일본), 러시아삼, 자경(중국 길림성), 중국 집안삼).

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Marker for discrimination of Panax ginseng and Panax quinquefolius, primer for amplifying the marker, and uses thereof <130> PN08138 <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 299 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 1 accttgacgt ggtggaagtc atcagttcga gcctgattat ccctaaaccc aatgtgagtt 60 tttctattat gatttgctcc cccgccgtga ttgaatgaga atggataaga ggctcgtggg 120 attgacgtga gggggcaggg atggctatat ttctgggagc gaactccggg cgaatatgaa 180 gcgcatggat acaagttagg ccttggaatg aaagacaatt ccgaatccgc tttgtctacg 240 aacaaggaag ctataagtaa tgcaactatg aatctcatgg agagttcgat cctggctca 299 <210> 2 <211> 249 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 2 aagctaacga tgcgggttcg attcccgcta cccgctatat attatttata tactttaata 60 gattctaatt attaattatt atttattcat cattgaatat agaatataca attcccgaaa 120 ttatctcaca aaaattctat tctttttttc caaacaacaa acaaaaagta ggtaaagtaa 180 aaaacgaaaa aatatcaata aaaagcgtcc attgtctaat ggataggaca gaggtcttct 240 aaacctttg 249 <210> 3 <211> 247 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 3 gggatttcgt gacatttctg attggctgtc ttgtatttct aataagttgt ttaatggttg 60 gcatgttgaa tcatataaat aatgggctgg tttagatgga tcctaaccgg atgattatga 120 attactttac ttctatttaa tattctatta attaatattc tattaaattc gacaaaaaga 180 gaaaatctga aatcgcggat ttacgcgaaa tccgggctat tttcactcaa ccgctacaag 240 atcaaca 247 <210> 4 <211> 227 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 4 ccgctgttat ccgctacatt caaaagggtc tgaggttgaa tcatatcatt ttttttttta 60 atctattctt tcaatgcaaa gggcgaagaa aaaagaaata ttgtttgtcc aaaaaaataa 120 atcagtacct gcaattgttt tttttttaat tctcaagacc tatttccttt gattctccat 180 ttttatgccg aaataatgaa ttgagttcgt ataggcattt tagacga 227 <210> 5 <211> 700 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 5 cagtggatat tttggatgtt gtgtaatcca ataattaccg ttcgttctct taattgaatt 60 gcaattaaac tcggcccaat cttttactaa aaggattgag ccgaatacaa agaccctatt 120 gcatatatat attatatttt ttagatagat acatacttat ctagatatag aagaatatac 180 aaaatctaag actaaacaac tcaaacgttt ctattggtgt gttgaatcca caattaatcc 240 gatggatcct taggattggt atattctttt ctatcctgga atttctctgg atcgagccaa 300 gtatcacaac tctttctacc catcctgtat attgtccttt tcgttccgtg ttggaatata 360 aacttattac ttattttagt tattggacga gattttacaa aaaaattctt cataggagaa 420 aaatctttct ttttttcgat gcgaatttga cacgacatag tagagtagaa agcccaattc 480 tatttataat tggatattat tggaaagggg gttcatcata ttcatctcta gtgaagtgct 540 aacctggagt ccacaaaaga aaatcatttt ttaatctcac actccttatt agttaataat 600 cctggtgatt ggatttctat gtttattttg acgggaaaaa agagattcaa ataaaagatt 660 tttcatcgaa tgactattca tctattggat tttcatacaa 700 <210> 6 <211> 295 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 6 ctcttccaaa ttgatgttcc aatatctttt tgtcatttct ccacatatcc cccctttttc 60 aaaaaaaaaa gagacgaggg tatcctgaaa taaataattg ttccgatgga accttctctt 120 ctaccgcaaa ttagccgtag atacacgacc caagccatta ttcttttcta ttcgttatta 180 tctttattac taaatcaaat gaccggacaa aatacagatt gttttcaaat aaaaagacga 240 atctactctt aggaatcatt aaatcctata aatgattgtt ctggtgtatc atgga 295 <210> 7 <211> 500 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 7 cccgatccca gaaagactaa 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aaaaaaagtg 240 aatagattca taggttcgat accttgtaat agaactcatg catgagagaa atattggatc 300 gcatagagtc gactaatgag gtgggttcat taaaaattca cagatgaaat gaaaaatggc 360 aaaaaagaaa gcattcactc ctcttt 386 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 11 accttgacgt ggtggaagtc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 12 tgagccagga tcgaactctc 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 13 aagctaacga tgcgggttc 19 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 14 caaaggttta gaagacctct gtcc 24 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 15 gggatttcgt gacatttctg a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 16 tgttgatctt gtagcggttg a 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 17 ccgctgttat ccgctacatt 20 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 18 tcgtctaaaa tgcctatacg aactc 25 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 19 cagtggatat tttggatgtt gtg 23 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 20 ttgtatgaaa atccaataga tgaatag 27 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 21 ctcttccaaa ttgatgttcc aa 22 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 22 tccatgatac accagaacaa tca 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 23 cccgatccca gaaagactaa 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 24 ccgatggcag taattgacg 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 25 tgtttggcaa gctgctgtaa 20 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 26 aaacgaaaag tttgagagta agca 24 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 27 gtcctcggta acgcgacat 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 28 gatggtcatc ggttcgattc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 29 ttcttgcgtg taccgattga 20 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 30 aaagaggagt gaatgctttc tttt 24 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 31 gtccttttcg ttccgtgttg g 21 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 32 gtttatattc caacacggaa cg 22 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 33 gtaataagtt tatacggaac g 21

Claims

서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 인삼(Panax ginseng)과 화기삼(Panax quinquefolius)을 구별하기 위한 엽록체 DNA 마커.
서열번호 11 내지 33 중 어느 하나의 프라이머 세트로 이루어진, 인삼(Panax ginseng)과 화기삼(Panax quinquefolius)을 구별하기 위한 제1항의 엽록체 DNA 마커를 증폭하기 위한 프라이머 세트.
대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 동정하는 단계를 포함하는, 인삼(Panax ginseng)과 화기삼(Panax quinquefolius)을 구별하는 방법.
제2항의 프라이머 세트를 포함하는 인삼(Panax ginseng)과 화기삼(Panax quinquefolius)을 구별하기 위한 키트.
제1항의 엽록체 DNA 마커가 고정화된 기판을 갖는 마이크로어레이.
대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;

상기 증폭 산물을 제1항의 엽록체 DNA 마커와 혼성화하는 단계; 및

상기 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는, 인삼(Panax ginseng)과 화기삼(Panax quinquefolius)을 구별하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 엽록체 DNA 마커는 마이크로어레이의 기판 상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.