KR102416250B1

KR102416250B1 - 독도강치 판별용 snp 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102416250B1
Application number: KR1020210115350A
Authority: KR
Inventors: 손호선; 김현우; 이종희; 김은미; 유미현; 김정은; 김민선; 최재필
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2021-08-31
Publication date: 2022-07-07

Abstract

본 발명은 독도강치와 캘리포니아 바다사자를 판별할 수 있는 미토콘드리아 DNA 유래 SNP 마커 및 이를 이용한 독도강치와 캘리포니아 바다사자의 판별방법에 관한 것이다.
본 발명의 독도 강치 판별용 SNP 마커 세트는 육안으로 쉽게 구분할 수 없는 독도강치와 캘리포니아 바다사자에 대한 종 구분을 신속하고 정확하며 경제적으로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 SNP 마커를 활용함으로써, 독도강치를 바다사자 속 동물들과 손쉽게 구별할 수 있어 바다사자 속 동물들에 대한 종 분류에 활용할 수 있다.

Description

독도강치 판별용 SNP 마커 및 이의 용도{SNP Markers for Identification of Zalophus japonicus and Use thereof}

본 발명은 독도강치 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 독도강치와 캘리포니아 바다사자를 판별할 수 있는 미토콘드리아 DNA 유래 SNP 마커 및 이를 이용한 독도강치와 캘리포니아 바다사자의 판별 방법에 관한 것이다.

2010년 공표된 나고야의정서는 생물자원을 활용하여 생기는 이익을 공유하기 위한 국제협약으로, 동 협약은 2017년 8월 17일부터 우리나라에서도 발효 중이다. 우리나라는 국립생물자원관과 2012년 설립된 국립생태원을 중심으로, 10만여 종의 국내 생물 유전자원을 발굴하고 자원 이용을 위한 데이터베이스를 만들어 나고야의정서에 대비하고 있다.

‘나고야의정서’가 발효되면서 우리 생물주권을 지키고 보전하는 것이 매우 중요한 문제로 떠오르고 있다. 우리 생물자원 보존과 관련하여 지리산과 한라산의 대표 식물인 구상나무는 1904년 서양으로 반출되어 크리스마스 트리로 외국에서 널리 사용된 바 있고, 1947년 미국으로 반출되어 ‘미스킴라일락’으로 불리며 정원수로 높은 인기를 누리고 있는 정향나무나, 소로나로 알려진 우리나라 토종 밀인 앉은뱅이밀은 모두 해외로 반출된 우리나라 생물자원이다. 따라서, 우리나라 고유생물의 무단 반출을 막고, 생물자원을 확보하기 위한 다양한 노력이 필요하다.

독도강치(Zalophus japonicus)는 대한민국 동해 연안 및 일본 영해에 주로 서식하였던 해양 포유류로, 물개과(Otariidae) 바다사자속(Zalophus)에 속하는 종이다(Wolf et al., 2007). 독도강치는 1970년대에 대량 포획으로 인한 개체수가 급감한 것으로 추정되며, 세계자연 보전 연맹(International Union for Conservation of Nature, IUCN)에 의해 1996년 절멸종으로 분류된 바 있다.

그러나, 최근에도 독도강치를 독도 인근 해역에서 관찰하였다는 목격담이 꾸준하게 이어지고 있으며, 독도강치가 지구상에서 생존하고 있을 것이라는 추측이 지속되고 있다.

이에, 한반도 인근에 서식 중인 바다사자속에 속하는 동일 속의 다른 개체들과 서로 구별될 수 있는 독도강치 종 특이적인 마커의 개발이 필요하며, 이러한 마커 개발을 통해 독도를 비롯한 한반도 인근 독도강치 서식지에서 발견되는 바다사자속 생물체의 샘플에 대한 유전체 분석을 통해 독도강치 종의 생존 가능성을 확인할 필요가 있다.

한편, 최근 고유골의 뼈나 연조직으로부터 DNA(aDNA, ancient DNA)를 채취(extraction)하여 NGS(Next Generation Sequencing) 방식을 기반으로 한 유전체 연구가 다양한 종, 예를 들면 맘모스(Miller et al., 2008; Palkopoulou et al., 2015), 곰(Barlow et al., 2018), 늑대(Skoglund et al., 2015), 소(Park et al., 2015; Upadhyay et al., 2017), 말(Orlando et al., 2013) 등의 동물에서 연구된 사례가 있다.

이러한 배경지식 하에, 본 발명자들은 고유골에서 분리한 독도강치 유전체 정보를 바탕으로 바다사자 속 동물들의 유전적 연관성을 밝혔고, 독도강치와 가장 가까운 근연종인 독도강치와 캘리포니아바다사자를 구별할 수 있는 마커를 개발하기 위해 독도강치 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 기반으로 하는 종 특이적 SNP 마커를 발굴하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 독도강치를 다른 바다사자속 동물들과 신속하고 정확하게 구분 가능한 독도강치 종 판별용 SNP 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 독도강치 종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 독도강치 종 판별용 키트 또는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 2,916번째 염기가 A이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 2,916번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (b) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 4,349번째 염기가 T이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 4,349번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (c) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 5,676번째 염기가 T이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 5,676번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (d) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 8,075번째 염기가 C이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 8,075번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (e) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 8,495번째 염기가 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 8,495번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (f) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 12,320번째 염기가 C이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 12,320번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (g) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 12,554번째 염기가 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 12,554번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (h) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 12,767번째 염기가 C이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 12,767번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; (i) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 14,728번째 염기가 T이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 14,728번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 (j) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 14,839번째 염기가 C이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 14,839번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 독도강치 판별용 SNP 마커 세트를 제공한다.

본 발명에 있어 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 길이는 제한되지는 않으나 5 내지 500 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드는 독도강치 고유골에 대한 NGS 데이터 분석을 통해 복원한 독도강치의 미토콘드리아 유전체(mtGenome; Mitochondrial genome) 서열로, 전처리(Preprocessing), 오염도 확인, 리드 얼라인먼트(Read alignment) 및 미스-인코포레이션(Mis-incorporation) 테스트를 포함하는 독도강치 NGS 데이터 분석 과정과, NGS 시퀀싱 및 게놈 커버리지(Genome coverage)를 포함하는 독도강치 디프 시퀀싱(deep sequencing) 과정, 그리고, 미토콘드리아 게놈 리드 확보 및 미토콘드리아 DNA 어셈블리를 포함하는 미토콘드리아 게놈 어셈블리(Mitochondrial genome assembly) 과정을 통해 복구한 독도강치의 미토콘드리아 유전체(mtGenome; Mitochondrial genome) 서열이다.

본 발명의 독도강치 판별용 SNP 마커는 하기 [표 18]에 표시된 마커로서, 독도강치의 SNP 마커 부위가 분류학적으로 독도강치와 가장 가까운 근연종인 캘리포니아바다사자의 미토콘드리아 유전체와 뚜렷하게 구분되어, 독도강치와 캘리포니아바다사자를 판별할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 독도강치 판별용 SNP 마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 독도강치 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어 “제제”는 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트, 상기 유전자 또는 그로부터 발현된 핵산 발현 산물과의 혼성화 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 제제에는 반응의 매질이 되는 버퍼, 용매 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제제는 서열번호 2 내지 서열번호 11로 중 하나 이상의 독도강치 SNP 마커 증폭을 위한 매스 어레이(Mass array) 분석용 익스텐디드(Extended) 프라이머;를 포함하는 독도강치 판별용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 상기 매스 어레이(Mass array)는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 합성 폴리머, 및 염기 분석에 쓰이는 매우 정밀한 분석 방법이다. SNP 분석에도 이용되는데, 해당 SNP가 포함된 게놈 DNA를 증폭하여 증폭 산물을 얻은 후, SNP 부위 바로 전 위치까지의 서열을 포함하는 프라이머와 ddNTP를 이용하여 1bp만 연장(extension)시킨 후, 이에 따라 발생한 각 단편의 질량 차이를 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight) 질량 분석을 통하여 SNP 유전좌형을 밝힐 수 있다.

상기 DNA 마커를 증폭시키기 위한 서열번호 2 내지 서열번호 11의 익스텐디드(Extended) 프라이머는 하기 실시예의 [표 17]에 정리되어 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제제는 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 18 및 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 20 및 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 24 및 서열번호 25의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 26 및 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 30 및 서열번호 31의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트;로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트;를 포함하는 독도강치 판별용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 상기 프라이머는 바람직하게 15~30 염기쌍의 길이로 이루어져 있다.

상기 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

상기 DNA 마커를 증폭시키기 위한 서열번호 12 내지 서열번호 31의 프라이머 세트는 하기 실시예의 [표 19]에 정리되어 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 독도강치 종을 판별할 수 있는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 독도강치 판별용 키트를 제공한다. 본 발명에 있어서, PCR 증폭과정에 적용되는 경우, "키트"는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다. 본 발명에 있어 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어 상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 독도강치 종을 판별할 수 있는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 독도강치 판별용 마이크로어레이를 제공한다. 본 발명에 있어 "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다. 마커에 대하여는 상기 기재한 바와 같다. 용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선할 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂ 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 SNP 마커가 포함된 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 독도강치 판별용 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 독도강치 종의 판별방법을 제공한다.

본 발명의 독도강치 종의 판별방법에서, 상기 증폭된 독도강치 판별용 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 2,916번째 염기가 A, 4,349번째 염기가 T, 5,676번째 염기가 T, 8,075번째 염기가 C, 8,495번째 염기가 G, 12,320번째 염기가 C, 12,554번째 염기가 G, 12,767번째 염기가 C, 및 14,728번째 염기가 T, 14,839번째 염기가 C로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상에 해당하는 경우에 해당 개체를 독도강치 종으로 판별할 수 있다.

본 발명에 있어 시료는 독도강치로 의심되는 개체의 DNA 일 수 있고, 상기 DNA는 독도강치로 의심되는 개체의 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 혈액, 타액, 모발, 각질, 분변 등으로부터 얻을 수 있다.

상기 독도강치로 의심되는 개체에서 분리된 mtDNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 인삼에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl₂ 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg²⁺이온이 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭 산물이 증가하고, Mg²⁺ 이온이 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 독도 강치 판별용 SNP 마커 세트 및 이를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 제공한다.

(b) 본 발명의 독도 강치 판별용 SNP 마커 세트는 육안으로 쉽게 구분할 수 없는 독도강치와 캘리포니아 바다사자에 대한 종 구분을 신속하고 정확하며 경제적으로 수행할 수 있다.

(c) 또한, 본 발명의 SNP 마커를 활용함으로써, 독도강치를 바다사자 속 동물들과 손쉽게 구별할 수 있어 바다사자 속 동물들에 대한 종 분류에 활용할 수 있다.

도 1은 캘리포니아바다사자 유전체의 어셈블리(assembly) 결과를 나타내는 그이다.
도 2는 독도강치 유전체 분석 방법을 설명하는 설명도이다.
도 3은 독도강치 뼈의 오염 물질 제거 과정을 설명하는 설명도이다.
도 4는 독도강치 gDNA 추출 방법을 설명하는 설명도이다.
도 5는 독도강치 및 캘리포니아바다사자 gDNA를 분석기기(Bioanalyzer TapeStation)로 측정한 피크 패턴(Z1~Z10, CalZ) 그래프이다.
도 6은 고래연구소에서 제공받은 프라이머의 제작 위치를 설명하는 설명도이다.
도 7은 독도강치 gDNA 증폭을 위한 PCR 믹쳐(mixture) 조합 및 반응조건을 설명하는 설명도이다.
도 8은 독도강치 근연종의 mtDNA 서열 확보 과정을 설명하는 설명도이다.
도 9는 생거 시퀀싱(Sanger sequencing) 결과를 기반으로하여 mtDNA DB를 구축하는 과정을 설명하는 설명도이다.
도 10은 Cytb-Ja 프라이머를 이용한 계통도 분석 결과(A), 및 alignment를 기반으로 DB 상의 서열의 일부를 제거한 후 재분석하여 수정한 계통도 분석 결과(B)이다.
도 11은 Cytb_F2 프라이머를 이용한 계통도 분석 결과이다.
도 12는 Cytb_F3 프라이머를 이용한 계통도 분석 결과이다.
도 13은 Za-DL-F2 프라이머를 이용한 계통도 분석 결과이다.
도 14는 독도강치 Z7 내지 Z9 샘플, 및 캘리포니아바다사자 샘플과 Cytb-Ja 및 Za_DL_F2 마커의 PCR 결과이다.
도 15는 독도강치 미토콘드리아 유전자의 계통도 분석 결과이다.
도 16은 독도강치 NGS 데이터 분석 과정을 설명하는 설명도이다.
도 17은 DNBSEQ-T7 플랫폼을 이용하여 독도강치 뼈(Zalophus-4,5,6)에서 추출한 DNA로부터 WGS(whole genome sequencing)를 수행하는 과정에서 전처리 전후의 퀄리티를 비교하여 설명하는 그래프이다.
도 18은 일루미나 시퀀싱 플랫폼(Illumina sequencing platform)으로 맵핑된 싱글톤 리드(singleton read)의 길이 분포를 나타내는 그래프이다.
도 19는 미스-인코포레이션 패턴(Mis-incorporation pattern)을 확인한 결과 그래프이다.
도 20은 독도강치와 캘리포니아 바다사자의 mtGenome 비교 그래프이다.
도 21은 NGS 리드 맵핑 결과 모호한 뉴클레오타이드(ambiguous nucleotide) 서열을 확인하는 과정을 나타낸 그림이다.
도 22는 독도강치의 미토콘드리아 유전체 지도이다.
도 23은 독도강치 및 캘리포니아 바다사자의 mtGenome 비교 그래프(mummer 분석 결과)이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 참조 유전체용 캘리포니아바다사자 유전체 정보 DB 구축

1-1. 미토콘드리아 게놈(mtGenome, Mitochondrial genome) 확보

독도강치 whole genome sequence 결과가 캘리포니아바다사자의 미토콘드리아 유전체에 얼라인(align) 되는지를 확인하기 위하여, 16,677bp 캘리포니아바다사자 mtGenome을 NCBI database(Acc. NC_008416.1)에서 다운로드 받았다.

1-2. 바다사자 유전체 확보

독도강치 고유골로부터 생산한 NGS read를 맵핑(mapping)하여 유전체 분석 및 어노테이션(annotation) 하기 위하여, 기존에 공지(publish)된 캘리포니아바다사자 유전체를 확보하였다(도 1).

캘리포니아바다사자의 유전체 크기는 약 2.4G로 스텔라바다사자(약 2.5G)와 거의 유사하며. 10,423개의 Scaffold가 어셈블리(assembly) 된 것으로 보고 되었으나, 스캐폴드(Scaffold) L50이 7M, N50이 143M 크기인 것을 감안하면, 염색체 수준의 어셈블리(assembly)가 되었을 것으로 판단된다(표 1).

	Z. californianus (캘리포니아바다사자)	E. jubatus (스텔라바다사자)
GenBank acc.	GCA_900631625.1	GCA_004028035.1
Version	zalCal2.2	ASM402803v1
Total length	2,372,369,564	2,418,263,165
Total ungapped length	2,367,602,164	2,404,049,571
No. of scaffolds	10,423	7,472
Scaffold N50	143,424,588	14,018,600
Scaffold L50	7	54
GC %	41.29	41.13
No. of gene	32,113	30,336

실시예 2. 독도강치 고유골로부터 고순도 gDNA 확보

독도강치 유전체 분석은 독도강치 뼈에서 추출한 gDNA를 추출하여, i) PCR(polymerase chain reaction) 반응을 통하여 증폭한 DNA를 생거 서열분석(sanger sequencing) 및 계통도 분석을 통한 독도강치 유전체 여부 판단 및 ii) NGS(next generation sequencing) 서열분석(sequencing analysis)을 통하여 유전체를 해독하는 과정으로 나누어 분석하였다(도 2). 계통도 분석을 통하여 독도강치로 밝혀진 개체의 서열은 QC(DNA quality control) 과정을 통하여 NGS 라이브러리(library)로 구축되고, NGS read를 충분히 확보하는 방향으로 연구를 진행하였다.

2-1. 독도강치 고유골의 미생물 오염 제거

독도강치 뼈 샘플 10개를 고래연구소로부터 공여받아 사용하였다. 오염원을 제거하기 위해 뼈조각을 에탄올로 세척하였고, 샘플의 앞뒷면에 10분씩 UV-irradiation 처리한 후, 샘플의 겉면을 제거하였다. 뼈 조직 내부의 뼈만을 회수하였고, UV cross-linker 장비를 이용하여 샘플의 앞면과 뒷면을 각각 10분씩 UV-irradiation 처리하여 눈에 보이는 않는 박테리아, 곰팡이 등의 오염물질을 제거하였다(도 3).

2-2. 독도강치 gDNA 추출 및 NGS용 gDNA 확보

독도강치 gDNA 추출은 Qiagen 社의 Tissue & Blood kit를 사용하는 column type과 CTAB(Cetrimonium bromide) Manual을 이용하여 수행하였다.

오염물질이 제거된 10종 뼈 조각을 액체 질소와 막자사발을 이용해 미세 분말로 만들고, 뼈 석회화(Bone decalcification)를 위해 0.5M EDTA 20ml에 미세 분말을 넣고, 55℃ 인큐베이터에 하루 동안 보관한 후, 조직 양에 따라 컬럼 타입(Column type)과 CTAB 매뉴얼 추출 방법(Cetrimonium bromide Manual extraction method, Organic Extraction)을 이용하여 라이시스(lysis)를 진행하였다.

비교 실험을 위한 캘리포니아바다사자 조직은 신선한 냉동 조직(fresh frozen tissue)이므로, 액체 질소와 막자사발을 사용하여 CTAB 매뉴얼 추출 방법(Cetrimonium bromide Manual extraction method, Organic Extraction)에 따라 라이시스(lysis)를 진행하였다.

독도강치의 뼈는 산성도가 높은 흙 속에서 장기간 보관된 상태여서 뼈에서 분리된 gDNA의 순도(purity)가 좋지 않았다. 따라서, gDNA의 순도(purity) 회복을 위해 비드(Bead)를 이용한 DNA 클린업 컬럼(clean up Column)을 이용하여 gDNA를 정제하였다(도 4 참조).

실시예 3. 독도강치 gDNA 퀄리티 체크

3-1. 독도강치 gDNA 정성 분석

추출된 독도강치 gDNA의 순도는 나노드롭(Nanodrop) 장비를 이용하여 대략적인 농도만 확인하고, 260/280 및 260/230 비율로 gDNA의 단백질 및 불순물(EDTA, 기타 무기질) 오염 정도를 확인하는 정성 분석을 수행하였다. 추출된 독도강치 gDNA의 정확한 농도 측정을 위해 이중나선(Double strand) DNA만을 측정할 수 있는 형광 다이(dye)를 이용한 큐빗(Qubit) 장비를 활용하였으며, 큐빗(Qubit)으로 측정한 농도를 기준으로 mtDNA PCR과 NGS의 입력 값(input amount)을 적용하였다.

3-2. 독도강치 gDNA 정량 분석

10개의 독도강치 뼈 조직과, 캘리포니아바다사자에서 분리된 gDNA의 Nanodrop 농도, 260/280 및 260/230 비(ratio), 및 Qubit 농도를 측정하고, 하기 표 2에 정리하였다.

[표 2]

독도강치 뼈 조직과 캘리포니아바다사자에서 분리된 gDNA를 Bioanalyzer chip(Z1~Z3)과 TapeStation Screen tape(Z4~Z10, CalZ) 기기를 이용하여 큰 사이즈의 gDNA가 어떻게 분리되었는지 확인하였다(도 5 참조). Z2 샘플의 경우 조직량이 작아서 gDNA 피크 패턴(peak pattern)이 확인되지 않았다.

실시예 4. 대용량 염기서열 생산 및 퀄리티 컨트롤

4-1. 고유골 유전체 분석을 위한 NGS 라이브러리 제작

(MGI 시퀀싱 라이브러리)

a. 절단 및 사이즈 선택(Fragmentation & Size Selection): DNA를 단편을 100bp~1,000bp 크기로 절단하고, Bead를 사용해 Paired-End 100 또는 Paired-End 150 라이브러리 제작이 가능하도록 300bp~500bp로 사이즈 선택(size selection)을 진행하였다. Agilent 2100 Bioanalyzer 기기(Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent technologies, USA)로 선택된 gDNA의 사이즈(size)를 확인하였고, Qubit dsDNA HS Assay kit(Qubit dsDNA HS Assay kit, Invitrogen, USA)로 농도를 측정하였다.

b. 엔드 리페어 및 A-테일링(End Repair and A-Tailing): 선택된 DNA 단편을 리페어(repair)하여 블런트 엔드(blunt end)로 만들고, 3‘ 말단에 dATP를 붙여주었다.

c. 어뎁터 라이게이션(Adapter Ligation): dTTP tailed 어댑터를 DNA 단편 끝에 연결하여 플로우 세포(flow cell)에 하이브리드(hybridization) 될 수 있도록 처리하였다.

d. PCR 증폭: 어뎁터(Adapter)와 라이게이션(ligation) 된 프로덕트(product)를 PCR을 이용해 증폭시켰다. 최종 PCR 산물의 크기를 Agilent 2100 Bioanalyzer 기기로 확인하였고, Qubit dsDNA HS Assay kit로 농도 측정한 후, 1pmol PCR 산물에 해당되는 Mass(ng)를 계산하였다.

e. 단일 가닥 순환화(Single Strand Circularization): 1pmol PCR 산물을 열변성(heat-denature)하여 생성된 단일 가닥 분자(single-strand molecule)를 DNA 리가제(ligase)로 연결하고 남아있는 선형 분자(linear molecule)들은 엑소뉴클레아제(exonuclease)로 제거하였다.

(일루미나 시퀀싱 라이브러리)

Genomic DNA를 소니케이션(Sonication) 방식으로 랜덤하게 단편 형태로 만들고, 블런트 엔드 단편(Blunt end fragments)을 만들었다. 단편들은 샘플 정제 비드(sample purification beads)를 이용해 원하는 사이즈(size)를 선택하였고, A 베이스(base)를 추가하는 단계 이후에 듀얼 인덱스 어뎁터(Dual index adapters)를 단편에 라이게이션 하였다. 결합된 산물은 클러스터 제너레이션(cluster generation)전에 증폭(amplification)하여 준비하였다.

4-2. NGS 플랫폼을 이용한 total NGS 염기서열 생산

(MGI 시퀀싱)

a. DNB(DNA nano ball) 제작: 40fmol의 단일가닥 환형 DNA 라이브러리를 프라이머와 혼성화(hybridization)시키고, DNB Enzyme(Phi29)을 이용한 RCA(Rolling Circle Amplification) 작업을 15분간 수행한 후, Qubit ssDNA Assay kit를 이용하여 라이브러리(library) 농도를 측정하였다.

b. DNB 풀링(Pooling) 계산 : Pooling 하고자 하는 샘플들의 농도 역수(concentration reciprocal)의 합계, 평균값 및 400/평균값인 Parameter B를 계산하여 각 샘플들의 풀링 볼륨(pooling volume)을 확정하였다.

c. DNB 로드(Load): DNB Rapid Reagent kit에 있는 DNB Load Buffer I과 Ⅲ-l을 이용하여 DNB 로딩 믹스(loading Mix)를 준비하였다.

d. 플로우 셀 준비 및 DNB 로딩: MGIDL-7에 플로우 셀과 DNB 로더(loader)의 바코드를 인식하여 장착시키고, 준비된 DNB 로딩 믹스(loading Mix)를 DNB 튜브 홀(tube hole)에 넣은 후, 플로우 셀 로딩(Flow cell loading)을 시작하였다.

e. 스타트 시퀀싱(Start Sequencing): 시퀀싱 카틸리지(Sequencing Cartridge)와 워싱 카틸리지(Washing cartridge)를 DNBSEQ-T7RS에 장착하고 DNB 로딩이 완료된 플로우(flow)을 인식시켜 시퀀싱을 진행하였다.

(일루미나 시퀀싱)

라이브러리 품질검사를 통과한 라이브러리는 각각 NovaSeq 기기(NovaSeq 6000, iIIumina, USA) 내의 정해진 위치에 로딩하였다. 플로우 셀(flow cell)을 기기 내에 위치시킨 후, 시약 전달 체크(Reagent delivery check)를 수행하여 유체 시스템(fluidic system)에 문제가 없음을 확인하였다.

퍼스트 베이스 리포트(First base report) 프로토콜을 수행하여 클러스터 생성 수를 확인였고, 해독 시그널 등이 정상인지를 확인하였고, 품질검사 결과가 정상으로 나온 경우, 염기해독을 진행하였다.

Read 1 해독이 종료되면, Read 2를 위한 DNA 주형인 PEM(Piared End Module) 을 이용하여 합성하였다.

실시예 5. 독도강치 미토콘드리아(mtDNA) 유전자 분석

5-1. 계통도 분석을 위한 PCR

독도에서 수집한 뼈가 독도강치에서 유래한 것인지를 판단하기 위하여, 뼈에서 추출한 DNA를 mtDNA cytb(cytochrome b) 유전자 및 D-loop 영역을 PCR(Polymerase Chain Reaction)로 증폭하였고, 생거 방법(sanger method)를 이용하여 시퀀싱을 수행하였다. 계통도 분석을 통하여 유전적 연관성을 밝힌 후, 독도강치 뼈로 확인된 개체에 한하여 NGS 분석을 수행하였다. 독도강치 mtDNA 증폭을 위한 프라이머 세트(primer sets)는 고래연구소에서 공여받았다(표 3 및 도 6 참조).

[표 3]

독도강치 gDNA 증폭을 위한 PCR mixture 조합 및 반응은 [도 7]에 정리하였다. PCR을 위하여 gDNA를 95℃에서 변성(Denature)시켰고, 어닐링(annealing)은 55℃에서 40cycles로 수행하여 DNA를 증폭하였다.

5-2. 계통도 분석을 위한 mtDNA 확보

(프라이머 기반 근연종의 mtDNA 서열 확보)

고래연구소에서 받은 프라이머를 기반으로 독도강치 근연종의 mtDNA를 수집하기 위해 다음과 같이 파이프라인을 구축하였다(도 8).

a) 프라이머(Foward, Reverse) 서열을 NCBI 데이테베이스에 입력하여 BLASTn 작업을 수행하였고, b) 포워드 및 리버스 서열이 모두 얼라인(align) 되는 mtDNA를 피톤 스크립트(python script)로 평가하여, 각 프라이머 세트에 해당되는 근연종 서열 수집하였다. c) clustalW(Thompson et al., 1994) 알고리즘을 이용하여 얼라인먼트(alignment) 과정을 수행하고, d) MEGA(molecular evolutionary genetics analysis) 프로그램(Hall, 2013)의 NJ 알고리즘(neighbor-joining algorithm)을 이용하여 필로제닉 트리(phylogenetic tree)를 이용한 계통도 분석 및 평가를 수행하였다.

양방향의 프라이머(primer)를 NCBI 서열에 얼라인한 후, 양쪽 서열이 모두 얼라인된 경우 근연종의 서열로 확보하고자 하였다. 그러나, 프라이머 서열을 얼라인하고, 검증과정에서 필터 아웃(filter out) 되어 서열 확보가 어려운 경우가 다수 발생하였다.

Cytb-Ja, Za_DL_F 프라이머의 경우 하나의 mtDNA 서열이 확보되었고, Cytb-F2, ZaDL-F4 프라이머의 경우 2개의 서열이 확보되었다. 따라서, BLAST 결과 검증과정에서 높은 기준(criteria)으로 인해 계통도 분석을 위한 충분한 서열 확보가 어려운 것을 확인하였다.

(시퀀싱 기반 근연종의 mtDNA 서열 확보)

테스트 세트(Test set)로 받은 독도강치 뼈 3조각으로 DNA 추출 및 PCR 한 결과, 3번째 뼈 조각에서 5개의 프라이머(primer)에 대한 band를 확인할 수 있었다(도 9). PCR 결과가 독도강치 유래의 뼈 조각인지 검증하기 위하여 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)을 통해 분석된 결과를 사용하였다.

확보된 서열을 쿼리(query)로 NCBI “nr” 데이터베이스에 BLASTn 작업을 수행한 결과, 총 10,539개의 서열이 확보되었다. 이러한 결과는 계통도 분석시 복잡도가 커지기 때문에, 쿼리(query) 서열의 90% 이상을 커버(cover)하는 서브젝트(subject) 서열만 조사하였다. 이 후, 총 2,360개의 서열이 남았고, BLASTn 작업에서 최소 서열 유사성(minimum identity)이 78% 이상으로 높게 나타났다.

트리 토폴로지(Tree topology) 분석을 용이하게 하기 위하여, 얼라인 된 서열의 분류(taxonomy) 분석을 통하여 바다사자와 상대적으로 먼 바다코끼리, 물범의 mtDNA 서열은 제거하고, 동종이 3개체 이상일 경우 3개체까지만 계통도 분석에 사용하였다.

상기 방법으로 만들어진 mtDNA 데이터베이스를 생거 시퀀싱(sanger sequencing) 작업에서 얻은 서열과 같이 얼라인(alignment) 작업을 수행하여 계통도 분석을 수행하였다.

Cytb-Ja 프라이머의 기본 트리(primary tree)의 경우에는 독도강치의 Forward(F) 서열과 Reverse(R) 서열이 각각 캘리포니아바다사자(AM181017.1) mtDNA 서열로 나누어져 있는 것을 확인할 수 있었다(도 10A 참조).

얼라인 결과, 포워드 시퀀싱(Forward sequencing) 된 시작 위치와 리버스 시퀀싱 된 끝 위치, 그리고 DB 상의 서열 시작 위치의 차이로 인하여 clustalW scoring(Thompson et al., 1994) 결과의 차이를 유도한 것으로 판단되었고, 얼라인먼트(alignment)를 기반으로 DB 상 서열의 일부를 제거한 후 재분석하였다. 재분석 결과 3개체의 독도강치 고유골 샘플은 동일 클레이드(clade)를 형성하는 것을 확인할 수 있었다(도 10B 참조).

Cytb_F2 프라이머의 경우, 2개체의 캘리포니아바다사자와 3개체의 스텔라바다사자와 같은 클레이드를 형성하였으며, 근연종 바다사자의 데이터가 많지 않은 단점이 있었으나, 계통도상의 문제가 발견되지 않아 수집된 서열은 DB로 사용하기에 충분한 것으로 판단하였다(도 11).

Cytb-F3 프라이머의 경우에도, 1개체의 캘리포니아바다사자와 3개체의 스텔라바다사자와 같은 클레이드를 형성하였으며, 근연종 바다사자의 데이터가 많지 않은 단점이 있었으나, 계통도상의 문제가 발견되지 않아 수집된 서열은 DB로 사용하기에 충분한 것으로 판단하였다(도 12).

Za-DL-F2 프라이머의 경우, Z1의 개체에서는 유사성 90%, coverage 90%이상의 mtDNA 서열 확보가 가능하였으나, Z3 개체의 리버스(Reverse) 서열은 전반적으로 시퀀싱 퀄리티(sequencing quality)가 낮아 계통도 분석에 사용할 수 없는 것으로 판단하였다.

Z1 개체로부터 확보한 Za-DL-F2 마커의 유사성 서열 데이터와 Z1 개체의 포워드(Forward), 리버스(Reverse) 서열 및 Z3 개체의 포워드(Forward) 서열을 ClustalW(Thompson et al., 1994)를 이용하여 얼라인먼트(alignment) 작업 후, 계통도 분석을 수행하였다(도 13).

도 13을 참조하면, Z1 및 Z3의 Za-DL-F2 유전자위 서열은 모두 가까이 클러스터링(clustering) 된 것으로 보이나, 분류학적으로 거리가 먼 뉴질랜드바다사자 (New Zealand sea lion, Phocarctos hookeri)의 서열(Acc. KJ648153.1)이 독도강치 서열과 동일 클레이드(clade)로 묶인 것을 확인할 수 있었다(도 13A). 반면, 다른 뉴질랜드바다사자의 Za-DL-F2 유전자위 서열(Acc. KX3881441.1, AM181019.1)은 남극물개 (Antarctic fur seal, Arctocephalus gazelle)와 동일 클레이드를 형성하면서, 강치속(Zalophus)이나 스텔라바다사자의 아웃그룹(outgroup)에 속하는 것으로 보아 KJ648153.1 서열의 퀄리티(quality)가 좋지 않을 가능성을 배재할 수 없었다. 이러한 이유로 KJ648153.1 서열은 Za-DL-F2 유전좌위 계통도분석을 위한 DB에서 제거하였다.

KJ648153.1 서열을 제거한 계통도 분석에서는 Z1 및 Z3 개체에서 확보된 서열이 모두 단일 클레이드(clade)로 형성되었으며, 갈라파고스바다사자(Zalophus wollebaeki)나 캘리포니아바다사자(Zalophus californianus)의 아웃그룹(outgroup)으로 묶였으며(도 13B), 기존에 publish 된 데이터(Lee et al., 2019)와 동일한 토폴로지(topology)를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.

정리하면, Za-DL-F2 마커의 유전좌위는 강치 유사종 및 아웃그룹(outgroup)에 해당하는 종에 다양하게 분포할 뿐만 아니라, 기존에 비교 가능한 선행연구에 부합하는 것으로 나타나서 계통도 분석 및 해석에 용이하게 적용될 수 있음을 확인하였다.

5-3. 계통도 분석 기반 독도강치 식별

샘플 Z4, Z5 및 Z6 뼈 조각에서 추출한 DNA 중 PCR 밴드가 뚜렷한 Z5 및 Z6 샘플을 생거 시퀀싱(sanger sequencing) 방법으로 염기서열을 분석하였다.

또한, 샘플 Z7, Z8, Z9 및 Z10 뼈 조각과 캘리포니아바다사자 조직에서 추출한 DNA의 mtDNA PCR 산물을 생거 시퀀싱(sanger sequencing) 방법으로 염기서열을 확인하였다(도 14).

전달받은 Za_DL_F2 서열은 기존에 구축한 mtDNA DB에 있는 서열을 기구축한 DL 데이터베이스와 BLAST를 수행하여 하이 퀄리티 리드(high quality read) 부분을 파싱(parsing) 하였다. 하이 퀄리티 리드는 DL 데이터베이스의 서열과 함께 clustalW(Thompson et al., 1994)로 얼라인먼트(alignment)를 수행하였다.

계통도 분석 결과를 정리한 도 15를 참조하면, 캘리포니아바다사자와 인접하게 클러스터링(clustering) 되면서, 샘플에서 추출된 독도강치 DNA 사이에서 서로 동일한 클레이드(clade)를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 독도강치 NGS 데이터 분석

고유골 유전체 분석은 동종 내에서 유전체 분석을 하는 방법과는 다른 특별한 단계들을 요구한다. 특히, 고유골의 특성상 채취한 DNA 내에 세균, 바이러스, 사람에 의한 서열 오염이 있을 수 있으므로 오염된 서열을 제거하고 근연종의 유전체에 NGS 리드(read)를 얼라인(align) 하여 유전적 특성을 분석하는 방법을 채택하였다(도 16 참조).

6-1. 전처리(Preprocessing)

독도강치 뼈(Zalophus 4, 5, 및 6)에서 추출한 DNA로부터 DNBSEQ-T7 플랫폼을 이용한 WGS(whole genome sequencing) 작업을 수행하여, 총 99M의 리드(개체별 평균: 33M)로부터 15Gbp(개체별 평균: 4.9Gbp)의 서열을 확보하였다(표 4).

[표 4]

두 번째 시퀀싱 라이브러리(sequencing library)(Z1, Z3)는 일루미나 시퀀싱(Illumina sequencing)을 기반으로 수행하였고, 약 16M의 리드(read)로부터 2.4Gb의 일루미나 플랫폼의 NGS 서열이 생산되었다(표 4 참조).

생산된 데이터를 기반으로 전체 NGS 리드(read)로부터 박테리아 오염(contamination) 및 독도강치 유전체 서열의 비율을 확인하였다.

DNBSEQ-T7 플랫폼의 어뎁터(adaptor) 서열을 제거(trimming)하기 위하여 어뎁터(adaptor) 서열을 확보하였고(표 5 참조), 일루미나 어뎁터 시퀀스(Illumina adaptor sequence)는 Trimmomatic 프로그램에서 제공하는 값을 이용하여 제거(trimming)하였다.

[표 5]

제공받은 어뎁터(adaptor) 서열 및 로우 퀄리티(low quality) 서열(기준: Q<20)은 Trimmomatic(ver. 0.36)(Bolger et al., 2014) 프로그램을 이용하여 제거하였고 전처리 후 시퀀싱 수율은 [표 6]에 정리하였다.

[표 6]

로우 퀄리티(low quality) 서열 제거 후, 총 98.5M(98.95%)의 리드(read)로부터 4.9G의 서열을 확보하였다. 이는 개체별 평균 4.8Gb의 서열을 시퀀싱 한 것이며, 캘리포니아바다사자 및 스텔라바다사자 유전체 크기의 1.8~2.1 배의 서열이다.

두 번째 실험 방법으로 시퀀싱(Illumina sequencing) 한 개체에서 생산된 리드(read) 역시 Trimmomatic(ver. 0.36)(Bolger et al., 2014) 프로그램을 이용하여 전처리를 수행하였다. 그 결과 96~98%의 리드(read)로부터 98%~96%의 고퀄리티 서열을 획득하였으며(표 6 참조), 이러한 결과는 캘리포니아바다사자 유전체의 약 0.9배에 해당한다.

DNBSEQ-T7 플랫폼의 특성상 포워드(Forward) 및 리버스(Reverse) 서열의 앞 15bp 정도에서 리드(read)의 GC 컨텐츠(contents)가 15bp 이하의 서열에서 나타나는 GC contents와 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다(도 17).

이러한 서열은 퀄리티가 좋지 않다고 판단되어 seqtk script (https://github.com/lh3/seqtk)를 이용하여 15bp를 트리밍(trimming) 하였고, 15bp 트리밍(trimming) 작업을 통해 하이 퀄리티 시퀀스(high quality sequence)를 획득하였다.

6-2. 오염도 확인

독도강치 WGS 리드(read)로부터 박테리아, 바이러스 등의 생물체 DNA 서열의 오염(contamination)을 확인하기 위하여, MEGAN(Metagenome Analyzer Microbiom ananlysis using a single application, ver. 6)(Huson et al., 2016)을 이용하였다. MEGAN DB에서는 NCBI에서 제공하는 단백질 서열에 리드(read)를 얼라인(align)하여 분류(classification)하였다.

MEGAN6(Huson et al., 2016)를 이용하여 분석한 결과, 전체 리드(read)의 41~50%가 MEGAN DB에 얼라인(align) 되었고, 얼라인된 서열 중 91% 이상이 박테리아 단백질에 대한 오염(contamination)으로 확인되었으며, 1~4%는 고세균 게놈(Archaea genome)에 의한 오염으로 분석되었다(표 7).

[표 7]

6-3. 리드 얼라인먼트(Read alignment)

상기 두 가지 방법의 오염(contamination) 확인 과정들은 모두 맵핑되지 않은(unmapped) 리드(read)가 많이 분포하고 있어, 독도강치 뼈에서 뽑은 NGS 리드(read)를 오염(contamination) 여부와 상관없이 캘리포니아바다사자 유전체에 맵핑(mapping) 하였다.

BWA-aln(http://bio-bwa.sourceforge.net/)(Li and Durbin, 2009) 플랫폼의 옵션(option)은 고대 동물에서 주로 사용되었던 (-l 16500 -o 2 -n 0.01)와 최근 TAPAS 툴(Tool)로 맵핑 테스트(mapping test) 시에 가장 좋은 결과를 보였던 (-l 19, -n 0,0004)를 시도해서 비교해 보았다(표 8 참조).

[표 8]

이들 두 결과에서 독도강치 NGS 맵핑 결과는 Zalophus 4 및 6에서 0.16%와 0.17%가 맵핑되었고, Zalophus 5에서는 0.002% 정도의 리드가 맵핑되었다.

상기 분석 결과에서 캘리포니아바다사자의 유전체에 맵핑된 독도강치 유전체 서열의 비율이 낮아 제대로 짝을 이루는 엔드(properly paired end)로 맵핑된 리드(read) 이외에, 맵핑된 싱글톤(mapped singletons)의 비율도 같이 분석하였다(표 9).

[표 9]

분석 결과, 전체 맵핑된 리드는 Zalophus 4 및 5에서 0.5% 정도로 증가하였으나 유전체 분석을 위해서는 여전히 낮게 나타났다.

일루미나 시퀀싱 플랫폼(Illumina sequencing platform)으로 생산한 Z1 및 Z3를 캘리포니아바다사자 유전체에 동일한 방법으로 BWA-aln(Li and Durbin, 2009)플랫폼을 이용하여 맵핑한 결과, 각각의 샘플(Z1, Z3)에서 0.7%와 1.2%의 맵핑 비율을 보였다(표 10).

[표 10]

특히, Z3 개체의 경우 맵핑 그룹(mapping group) 별로 맵핑된 리드(read)의 수 및 비율이 다름을 알 수 있었는데, 제대로 짝을 이루는 엔드(properly paired end)의 비율이 0.05%로 가장 낮게 나타났고, 싱글 리드(single read)만 맵핑된 비율이 0.46%로 가장 높게 나타났다. 전체 맵핑된 비율을 기반으로 봤을 때, 62%의 리드(read)가 싱글로 맵핑된 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 독도강치 aDNA의 분해(degradation)로 하여 독도강치 페어드 엔드 라이브러리(paired end library) 구축에 어려움이 있었을 것으로 해석할 수 있다.

독도강치 aDNA의 맵핑 비율(mapping rate)이 낮은 이유가 DNA 분해(degradation)로 인한 페어드 엔드(paired end, insert size: 350 bp) 리드(read)의 생산이 어려웠는지에 대한 검증을 위해, Z3 데이터의 맵핑 그룹(mapping group) 별로 생산된 리드의 길이를 비교 분석하였다.

분석 결과, 전체 맵핑된 리드 중에서 제대로 짝을 이루는 엔드 리드(properly paired, 350bp 정도의 거리를 두고 맵핑된 리드들), 페어드 리드(paired, 양방향의 리드가 모두 얼라인된 리드), 싱글 맵드 리드(single mapped, 양방향 리드 중 한 가닥만 얼라인 된 경우)의 비율은 각각 6%, 33%, 61%로 절반 이상이 싱글 맵드 리드였다 (그림 28). 제대로 짝을 이루는 엔드 리드로 맵핑된 리드 길이의 경우 140bp 인근에서 모두 나왔고, 페어드 엔드 리드 길이의 분포는 20~140 사이로 골고루 분포하는 경향을 보였으나, 140bp 근처에서 피크를 보였다. 반면, 싱글 맵드 리드의 경우 20~40bp의 리드 길이(read length) 분포를 보이며, 피크도 20bp로 매우 짧게 나타났다.

Bam 파일의 cigar 값을 기반으로 리드의 길이와 매치(얼라인)된 뉴클레오타이드 수를 비교했을 때, 99% 이상 매치되어 따로 분류(distribution)하지 않았다.

일루미나(Illumina) 플랫폼의 페어드 엔드(paired end)로 서열을 생산 후, 시퀀스 QC 과정에서 한쪽 리드의 퀄리티가 좋지 않아 빠지는 싱글톤(singleton)의 맵핑 비율과 리드 길이를 비교 분석하였다(도 18).

분석 결과, 전체 맵핑 비율은 R1 및 R2가 각각 0.3% 및 0.5%로 맵핑되었고, 맵핑된 리드 길이의 피크는 모두 150에서 확인되었다.

싱글톤(Singleton)의 개수가 많은 R2의 경우 맵핑된 리드 길이가 40~100bp 사이로 나온 것도 다수 관찰되었다. 이러한 결과는 독도강치 DNA의 분해(degradation)로 인하여, 인서트 사이즈(insert size)가 350bp 정도 길이의 DNA 수확이 어려울 가능성을 시사한다. 이에 따라, 인서트 사이즈(insert size)를 150~200bp 정도로 해서 PE(paired-end) 시퀀싱하는 것을 테스트할 필요가 있다.

Z3 개체의 얼라인먼트(alignment)로부터 캘리포니아 바다사자 유전체의 얼마나 광범위한 범위를 커버(cover)하는지 조사한 결과, 1x 이상의 리드를 갖는 부분은 3,521,339bp로 나타났고, 이는 캘리포니아바다사자 전체 유전체 크기 (2,372,369,564 bp)의 0.14% 정도를 커버하는 것이다. 특히, 변이(variant) 분석이 가능한 5x 이상이 얼라인 된 위치(loci)는 15,686bp로 캘리포니아바다사자 유전체의 0.0007% 밖에 커버하지 못하였다.

6-4. Mis-incorporation test

mapDamage 프로그램(ver. 2.0)(Ginolhac et al., 2011)을 이용하여 미스 인코퍼레이션 테스트(mis-incorporation test)를 수행하였으나, 현 데이터들이 대부분이 오염된 박테리아 DNA로 구성되어 있어 명확한 패턴은 나타나지 않았다(도 19)

실시예 7. 독도강치 디프 시퀀싱(deep sequencing)

7-1. NGS 시퀀싱

실시예 6의 멀티플렉스(multiplex sequencing) 분석 결과로부터 90% 이상의 DNA 오염(contamination)을 확인하였다. 또한, 맵핑된 리드의 사이즈를 분석한 결과 독도강치 뼈의 오염 및 분해(degradation)로 인하여 독도강치 유전자 서열의 회수가 어려웠으나, 전체 시퀀싱한 양의 0.1~0.7%가 독도강치 리드(read)로 확인되었다(표 11).

[표 11]

BGI 플랫폼과 일루미나(Illumina) 플랫폼을 비교하였을 때, 전체 맵핑 비율(mapping rate)은 일루미나 데이터(illumina data)가 다소 높게 나타났으나, 제대로 짝을 이룬 맵핑(properly paired mapping) 비율은 BGI-T7과 큰 차이를 보이지 않았으며, 싱글 맵드 리드(Single mapped read) 비율이 0.1~0.46%로 높게 나타났다.

이러한 데이터를 고려하여 Z3 개체에 대하여 100bp PE 라이브러리를 만들어 NovaSeq 플랫폼으로 25G의 데이터를 생산하고 분석하였다. 이렇게 생산된 데이터 생성량은 프리-프로세싱(pre-processing) 데이터의 10배에 해당된다. 생산된 리드의 맵핑 비율을 BGI-T7과 비교했을 때, 맵핑 비율(mapping rate)이 0.75%에서 1.13%로 다소 증가하였다. 그러나, 대부분의 증가량은 싱글 리드(single read)의 맵핑 비율(mapping rate)이 증가한 것으로 분석되었다(표 11 참조).

또한, Z3 개체의 SE(single end) 라이브러리를 구축하고, NextSeq 플랫폼으로 33Gbp의 데이터를 시퀀싱하였다. NextSeq 플랫폼으로 생산한 SE 라이브러리는 캘리포니아바다사자 유전체의 약 14배에 해당한다. 리드 맵핑 비율(read mapping rate)을 기반으로 독도강치 유전체의 리드를 추정하였을 때, 9,000여개의 리드만이 독도강치에서 유래한 것으로 분석되었다.

따라서 SE 라이브러리는 독도강치 aDNA 시퀀싱에 더 낳은 결과를 줄 수 없을 것으로 판단하고, PE(paired end) 라이브러리를 제작하였다.

Z3, Z4 및 Z6 개체로부터 인서트 사이즈(insert size)가 100bp 정도의 짧은 서열에 대한 라이브러리를 구축하여 디프 시퀀싱(deep sequencing)을 수행하였다 (표 12 참조).

[표 12]

약 10Gbp 크기의 NGS 리드[10G paired end(PE)]로부터 1Tbp NGS 데이터를 생산한 시퀀싱 결과는 하이 퀄리티(high quality)로 PE 리드(insert size 100bp)의 경우 프리-프로세싱(pre-processing) 이후에도 97% 이상의 리드가 하이 퀄리티 리드(high quality read)로 회수되었다. 이러한 데이터는 캘리포니아바다사자 유전체 크기의 96~116배에 해당된다. 생산된 리드를 캘리포니아바다사자 유전체에 맵핑하였을 때, 0.33~0.36%의 리드가 맵핑되었고, 0.13~0.19%의 리드가 제대로 짝을 이룬 리드(properly mapped read)임을 확인하였다. 이러한 맵핑 비율(mapping rate)은 멀티플렉스 시퀀싱(multiplex sequencing) 결과와 유사한 패턴으로 나타났다.

7-2. 게놈 커버리지(Genome coverage)

실시예 7-1에서 생산한 NGS 데이터를 개체별로 병합(merge)하였을 때, 캘리포니아바다사자 유전체의 커버리지(coverage)를 계산하였다. Z1 내지 Z6의 개체에서 생산된 리드들이 갖는 캘리포니아바다사자 유전체에 대한 커버리지를 비교할 때, Z6 및 Z4 개체가 각각 30% 및 25%로 가장 많은 영역을 커버하는 것으로 나타났다(표 13).

[표 13]

캘리포나아바다사자의 유전체 영역의 5배 이상 맵핑된 영역은 1.7M~2.7M 영역이며, 10배 이상으로 맵핑된 영역은 450M~691M에 해당된다. 5배 이상의 리드가 맵핑된 영역은 Z6 개체에서 가장 많이 나나탔다.

이렇게 생산된 독도강치 유전체 양을 기반으로 했을 때, 전체 캘리포니아바다사사 유전체 영역의 47%를 커버하는 것으로 나타났다(표 14).

[표 14]

실시예 8. 미토콘드리아 게놈 어셈블리(Mitochondrial genome assembly)

8-1. 미토콘드리아 게놈 리드 확보

독도강치의 미토콘드리아 유전체(mtGenome; Mitochondrial genome) 분석을 위하여, 디프 시퀀싱 한 리드(개체 Z4 및 Z6)의 NGS 리드를 캘리포니아바다사자 mtGenome(Acc. NC_008416.1)에 BWA-aln(option: -l 16500 -o 2 -n 0.01) 플랫폼을 이용하여 얼라인하였다.

맵핑 파일(Mapping file)로부터 제대로 짝을 이룬 엔드 리드(properly paired-end read)를 파싱(parsing)하여 독도강치 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 리드를 확보하였고(표 15), Z6 개체에서 mtDNA 리드가 가장 많이 나오는 것을 확인하여, 미토콘드리아 유전체 어셈블리(mtGenome assembly)에 활용하였다.

[표 15]

8-2. 미토콘드리아 DNA 어셈블리

실시예 8-1에서 파싱(parsing)한 독도강치 mtDNA 리드를 NOVOPlasty(V 4.2)를 이용하여 프라이머리 어셈블리(primary assembly)를 수행하였고, 2개의 콘티그(contigs)(15,630bp, 589bp)를 얻었다.

이렇게 얻은 2개의 콘티그를 캘리포니아바다사자의 mtGenome과 비교한 결과, D-loop 영역의 일부가 어셈블리(assembly) 되지 않음을 확인하였다(도 20 왼쪽). 이에 독도강치 종 동정에 이용한 생거 시퀀스(sanger sequence)를 붙여 갭 클로징(gap closing)이 되는지 확인하기 위해, Cap3 프로그램을 이용하여 프라이머리 어셈블리(primary assembly) 결과와 생거 시퀀스(sanger sequence) 결과를 어셈블리하는 방식으로 갭 클로징(gap closing)에 활용하였다. 캘리포니아바다사자 mtDNA와 비교하였을 때 완전하게 어셈블리(complete assembly)가 되는 것을 확인하였다(도 20 오른쪽).

어셈블리 결과를 확인하기 위해, 앞에서 어셈블리에 사용된 리드를 다시 BWA-MEM 플랫폼을 이용하여 cap3 프로그램으로 어셈블리한 독도강치 미토콘드리아 유전체에 얼라인(align) 하였다. 그 결과, 16,071bp~16,191bp 영역에 갭(gap) 및 모호한 뉴클레오타이드(ambiguous nucleotide) 서열(N, R, Y) 등이 발견되었다(도 21). 이 부분은 다시 프라이머를 제작하여 생거 시퀀싱으로 확인하였다.

갭 필링을 위한 프라이머는 primer3 프로그램(ref)을 이용하여 플랭킹 부위(flanking region)에서 프라이머를 제작하고 시퀀싱하였다(표 16).

[표 16]

[표 16]의 프라이머를 기반으로 생거 시퀀싱을 통한 프라이머 워킹(primer working)을 수행한 결과, 서열번호 1로 표시되는 16,678bp 길이의 완전한 독도강치 미토콘드리아 유전체(mtGenome)를 얻을 수 있었다(도 22).

독도강치 미토콘드리아 유전체(mtGenome)를 캘리포니아바다사자의 미토콘드리아 유전체(mtGenome)(Acc. NC_000416, 16,677bp)와 비교한 결과, 구조적으로 동일함을 확인할 수 있었고, 게놈 시퀀싱 얼라인먼트(genome sequence alignment) 결과에서는 독도강치의 미토콘드리아 유전체(mtGenome)가 캘리포니아바다사자 미토콘드리아 유전체(mtGenome) 보다 1bp 더 큰 것을 확인할 수 있었다(도 23).

독도강치의 미토콘드리아 유전체는 MITOS(http://mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index.py) 프로그램을 이용하여 예측(prediction)하였으며, 이를 통해 13개의 단백질 코딩 유전자와, 23개의 tRNAs 유전자, 2개의 rRNAs 유전자, 그리고 2개의 복제 오리진(replication origin) 유전자를 동정하였다.

실시예 9. 마커 후보군 선정 및 매스 어레이를 이용한 독도강치 SNV 마커 검증

독도강치와 캘리포니아바다사자의 유전체 서열을 비교하여 총 96개의 미토콘드리아 유전자좌가 SNV 마커의 후보군으로 도출되었다.

매스 어레이(Mass array)는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 합성 폴리머, 및 염기 분석에 쓰이는 매우 정밀한 분석 방법이다. SNP 분석에도 이용되는데, 해당 SNP가 포함된 게놈 DNA를 증폭하여 증폭 산물을 얻은 후, SNP 부위 바로 전 위치까지의 서열을 포함하는 프라이머와 ddNTP를 이용하여 1bp만 연장(extension)시킨 후, 이에 따라 발생한 각 단편의 질량 차이를 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight) 질량 분석을 통하여 SNP 유전좌형을 밝힐 수 있다.

매스 어레이(Mass array) 분석을 위하여, 도출된 총 96개의 유전자좌에 해당하는 SNP 마커 후보군 중에서 각 유전자좌에 대한 매스 어레이 프라이머를 작성하여 매스 어레이(Mass array) 기반 유전형 분석(genotyping)을 수행하였다.

매스 어레이(Mass array) 분석을 수행한 결과, 캘리포니아바다사자와 구별되는 독도강치 특이적인 SNV 마커 10개를 발굴하였다. 발굴된 SNV 마커 10개에 대응하는 Extended 프라이머 서열은 하기 [표 17]에 정리하였다.

[표 17]

구체적으로, 캘리포니아바다사자와 구별되게 독도강치 특이적인 SNV 마커는 서열번호 1로 표시되는 독도강치의 미토콘드리아 유전체(mtGenome) 서열에서 다형성 부위인 2,916번째 염기가 A의 이형 형질(heterozygous)의 SNP 서열을 갖는 것으로 나타났고, 4,349번째 염기가 T의 이형 형질(heterozygous)의 SNP 서열을 갖는 것으로 나타났으며, 5,676번째 염기가 T의 이형 형질(heterozygous)의 SNP 서열을 갖는 것으로 나타났고, 8,075번째 염기가 C의 이형 형질(heterozygous)의 SNP 서열을 갖는 것으로 나타났으며, 8,495번째 염기가 G의 이형 형질(heterozygous)의 SNP 서열을 갖는 것으로 나타났고, 12,320번째 염기가 C의 이형 형질(heterozygous)의 SNP 서열을 갖는 것으로 나타났으며, 12,554번째 염기가 G의 이형 형질(heterozygous)의 SNP 서열을 갖는 것으로 나타났고, 12,767번째 염기가 C의 이형 형질(heterozygous)의 SNP 서열을 갖는 것으로 나타났으며, 14,728번째 염기가 T의 이형 형질(heterozygous)의 SNP 서열을 갖는 것으로 나타났고, 14,839번째 염기가 C의 이형 형질(heterozygous)의 SNP 서열을 갖는 것으로 나타났다.

[표 18]

2차적으로 상기 10개의 캘리포니아바다사자와 구별되는 독도강치 특이적인 SNV 마커 품종 특이적 마커를 검증하기 위한 프라이머 세트(primer set)를 제작하였다. PCR 반응을 수행하기 위해 제작된 프라이머 세트는 하기 [표 19]에 정리하였다.

[표 19]

상기 [표 19]의 Forward 프라이머와 Reverse 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과, 매스 어레이(Mass array) 분석 결과와 동일하게 캘리포니아바다사자와 구별되는 독도강치 특이적인 SNV 마커 10개가 확인되었다.

상기와 같은 결과를 통해, 상기 10종 SNP 마커는 캘리포니아바다사자와 독도강치를 종특이적으로 판별할 수 있는 SNP 마커임을 검증할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Republic of Korea(National Fisheries Research and Development Institute) <120> SNP Markers for Identification of Zalophus japonicus and Use thereof <130> PN210048AN <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16678 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Zalophus japonicus <400> 1 gttaatgtag cttaactaaa cttaaagcaa ggcactgaaa atgcctagat gagtcacgag 60 actccataaa cacaaaggtt tggtcctagc ccttccgtta gtttttaata aaattataca 120 tgcaagcttc cacgccccag tgagaatgcc cttcagatcc ctacagccga tcaaaaggag 180 cgggtatcaa gcacactcaa cgagtagctc acaacgcctt gctcaaccac acccccacgg 240 gacacagcag taataaaaat taagccatga acgaaagttc gactaagtta tattaatcat 300 aagggttggt aaatttcgtg ccagccaccg cggtcatacg attaacccaa actaacgggc 360 tcacggcgta aagcgtgtaa aagatctacc tacactaaag ttaaaattta accaagccgt 420 aaaaagctgc cgttaataca aaatacacta cgaaagtgac tttaataatt ctgattacac 480 gatagctaag acccaaactg ggattagata ccccactatg cttagcccta aacataaata 540 attcacttaa caaaattatc cgccagagaa ctactagcaa tagcttaaaa ctcaaaggac 600 ttggcggtgc 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taggacacca atgatattga acctatgagt atactgatta 7380 tgaagaccta agctttgact cctacataat tcctacacaa gaattaaaac ctggcgaact 7440 acgactatta gaagtggata atcgagtcgt actacccata gaaataacag tccgtatact 7500 aatttcatca gaagatgtac ttcactcatg agctgtgcca tccctaggac tgaaaaccga 7560 cgctatccca ggacgattaa accaaaccac cttaatggct atacgaccag gactatacta 7620 cggtcaatgc tcagaaatct gtggttccaa ccatagcttt atacccatcg ttattgaatc 7680 tgtcccatta tcttgcttcg agaaatggtc cgcctcaatg ctttaatcac taagaagcta 7740 tacagcatta accttttaag ttaaaaattg tgagtaccct aacctctcct tagtgaaatg 7800 ccacaactag acacatcaac atggtttact acaattgtat ccataatcct aacactattt 7860 atcgtatttc aattaaaaat ttccaaacac cacttcccaa taagcccaga attgaaaccg 7920 ttattaacat caaaaaccaa taccccctga gaaaaaaaat gaacgaaaat ctattcacct 7980 ctttcgcttc ccctacaata ataggccttc ctatcgtaac cctaatcatc ctatttccaa 8040 gcatattatt cccttcacca ggccgactga tcaacaaccg cctcacctca attcaacagt 8100 gactgatcca attaacatca aagcaaataa tattaattca caatcacaaa ggacaaacat 8160 ggacattaat actcatatcg ctcatcatat tcattggatc taccaatcta ctgggtctac 8220 taccacactc atttactccc actacccaac tatctataaa tctaggaata gccattcccc 8280 tgtgagcagg aacagtcgcc ataggactac gacacaaaac taaagcatcc ttagcccact 8340 ttctacccca aggaacaccc ttccccctca tcccaatact agtaatcatt gaatctatta 8400 gcttactcat tcaacctata gccttagccg tacgactaac agccaatatc actgcaggcc 8460 acctattaat tcacctaatt ggtggagcca ccctggccct cattaacatc agcgcaatta 8520 cggcccttat cactttcatt atcctcactc tacttacagt acttgagttc gctgtagcct 8580 taatccaagc ctacgtcttc actttactag taagcctata cttacatgat aacacctaat 8640 gacacaccaa acccatgcat accatatagt caaccctagc ccttgaccat taacaggggc 8700 cctatcagcc ctccttataa cctcaggcct aatcatatga ttccacttta attcaaccca 8760 cctcctacta ctgggcctta taaccaacac actaactata tatcaatgat gacgagatgt 8820 cgtccgggaa agcacattcc aaggccatca caccccgacc gtccaaaagg gcctacgata 8880 tggcataatc cttttcatcg tatccgaagt attctttttc gcaggatttt tctgagcttt 8940 ctatcattcc agcctagcac ctacccccga actaggagga tgctggcccc ccacaggaat 9000 tacacctcta aacccactag aagtccctct actaaacacc tcagtactat tggcatcggg 9060 cgtatcaatc acctgagccc accacagttt aatagaagga aatcgtaaac acatgcttca 9120 agccctatca atcactatcc tcctaggcct atacttcaca cttctacaag cctcagagta 9180 ctacgaaacc tcttttacaa tctccgacgg aatttacggc tccactttct ttgtggctac 9240 aggattccac ggactacacg tgattatcgg ctcgaccttc ctaaccgtgt gcttcctacg 9300 acaattaaaa ttccatttca catccaacca tcacttcgga tttgaagctg ctgcctggta 9360 ctgacatttc gtagacgtcg tatgactgtt cctrtatgta tctatctatt gatgaggatc 9420 atgtttcctt agtattaact agtacagttg acttccaatc aaccagttct ggccacaatc 9480 cagaaggaaa taataaacat aattctagcc ctacttacca acacaatcct agcctcctta 9540 cttgtactaa tcgcattctg actcccccaa ctaaacatct actcagaaaa grctagccct 9600 tacgaatgcg gatttgaccc cataggatca gcgcgtttgc ccttctccat aaaatttttt 9660 ctagtagcta ttacatttct actatttgac ctagaaatcg cactactact acccctccca 9720 tgagcatctc acgcaaacaa cctaacaact accctcacta tagcactcat attaatctct 9780 ctactagccg caagtctagc ttacgaatga accgaaaaag gactagaatg aacagaatat 9840 gataattagt ttaaaataaa acaaatgatt tcgactcatt agactacgac ttaccccgta 9900 attatcaaat gtccataata tacttcaaca tcttcatagc cttcaccgta tctctcgtag 9960 ggttactcat gtatcgatcc cacctcatat cctccctact ttgcctagaa ggcataatac 10020 tatcattatt cgtaataata tcagtgacaa tcctaaacaa ccattttaca ctagctagca 10080 tagcccccat tatcctactt gtattcgcag cttgcgaggc ggcccttgga ctatccctcc 10140 tagtaatagt atctaacaca tacggaactg actacgtaca aaacctaaac ctcttacaat 10200 gctaaaaatc attatcccca ccattatact aatacccata acatgaatat caaaacccca 10260 tataatctga attaatacaa caacctatag cctactaatt agtctcacca gcctaccact 10320 cctaagccaa cctaacgaca acagcctaaa ctcatcatta ctattcttca cggactccct 10380 atcagccccc ctcctaacac ttactacatg actcttaccc ctgatactca tagctagcca 10440 atcccaccta tcaaaagagc cactagcccg aaaaaaactt tatattacaa tattagtcct 10500 tctacaatta tttctaatta taacattcac cgctacagaa ctaatcatat tctacatctt 10560 attcgaagca actctagtgc ccacactaat tattattacc cgatgaggta accaaacaga 10620 acgcctgaac gcaggactat acttcctatt ctatactctg gtaggatcac tacccctact 10680 agtagcatta ctatatatac aaaacaatat aggcacacta aatttcttaa tagcccaata 10740 ctggacccaa gccctaccaa actcctgatc caatattctc ttatgactag cgtgcataat 10800 agcgtttata gtaaaaatac ccctctatgg gctccaccta tgacttccca aagcacatgt 10860 agaagccccc attgctggat ccatagtact tgccgccgtg cttctaaaac taggaggcta 10920 cggcataata cgaattacca tcttgctcaa tcctctaaca agtttcatgg catacccctt 10980 tataatatta tcaatatgag gtataatcat gacaagctcc atctgtttac gccaaactga 11040 cctgaaatca ttaatcgcat actcctccgt aagccacatg gccctagtaa tcgtagccat 11100 cctcgtccag acaccattaa gctatatagg cgcaaccgcc ctaataatcg cccacggcct 11160 tacatcatct atactattct gcttagccaa ctccaattat gaacgcaccc acagtcgaat 11220 tataatcctc gcacgtggcc tacaaaccct actaccacta atagcggcat gatgactatt 11280 agcaagccta accaacctag cactaccccc taccattaat ctaatcggag aattactcgt 11340 ggtaatagcc tcattctcat gatctaacgc taccattatt cttataggag taaacatcac 11400 cattactgcc ctatactccc tatatatact tattacaaca caacgcggaa aacatactca 11460 tcacatcaaa aacattaaac cctcgtttac acgagaaaac accctaataa tactacacct 11520 tataccacta ctactactat cattaaatcc taaattaatt ctagggcccc tttactgtaa 11580 atatagttta agaaaaacgt tagattgtga atctaataat atgagctcaa acctccttat 11640 ttaccgaaaa agaatgcaag aactgctaac tcatgctacc gtgcatgaaa acacggcttt 11700 ttcaactttt aaaggataga agtaatccat tggccttagg agccagagaa ttggtgcaac 11760 tccaaataaa agtaatcaat ttattcgcct cattcattat tataacacta tccatactca 11820 ccataccaat tatcctaacc agcactccaa tctacgaaag caaactctac ccacagtacg 11880 tgaaaactac catctcctac gcctttataa ccagtataat ccccacaaca atattcattt 11940 cctcaggaca ggaaatagtc atctcaaact gacactgaat gacgattcaa actataaaat 12000 tatcactaag cttcaaacta gattacttct cgataatttt cgtgcccgta gccctattcg 12060 tcacatgatc catcatagaa ttctcaatat gatacataac ttcagacccc tacatcaacc 12120 ggttcttcaa gtatctacta atattcctta ttacaataat aattttagtt accgcgaata 12180 atctatttca attattcatc ggctgagaag gagtaggcat tatgtctttc ctactcatcg 12240 gatgatggta cggacggtca gatgcaaaca cagccgctct tcaagcaatc ctctacaatc 12300 gcatcggaga cgtaggcttc atcatagcca tagcatgatt cttaattaat ctaaacacgt 12360 gagacctcca acaaatcttt ataattcacc atgataacct aaatatacca ctcgcaggtc 12420 tcctgctagc ggcaactggc aaatcagccc aatttggcct acatccatga ctaccctcgg 12480 ccatagaagg acccacacca gtatcagccc tattacactc gagcactata gttgtagctg 12540 gagttttcct cctgatccga ttccaccctc taatagaaaa taatatgata atacaaacaa 12600 tcaccctatg cctaggagcc atcaccaccc tattcacagc ggtatgcgct ctcacccaaa 12660 atgacatcaa aaaaatcatc gcattctcaa cttcaagcca actaggattg ataatcgtca 12720 caatcggaat tggtcagcca tatctagcat tcctacacat ctgcacccac gcattcttta 12780 aagcaatact atttatatgc tccggatcca tcatccacaa cctaaacgac gaacaagata 12840 ttcgaaagat aggaggccta ttcaaaccaa taccattcac tactacctca ctaattattg 12900 gcagtctagc actcacaggc atgccatttc ttacaggatt ttactcaaaa gacttaatca 12960 tcgaaaccgc caacacatcg aataccaacg cctgagccct gctactaacc ctaatagcca 13020 catccataac agctgcctac agcacccgaa taatattctc cacacttctg ggacaacccc 13080 gattcaatgc tacaatttca gtaaatgaga gcaatccact actaatcaac cctattaaac 13140 gtctactact cggaagcatc ttcgcaggat acctaataac tcttaacatc ccacccacaa 13200 cgatcccaca actaactata ccacatcacc taaaacttac agctctcacc gtaacactac 13260 taggtttcgt actggcccta gaactcaata caacctcact aaaccttaaa ttcaaacacg 13320 catcaggcct gtccaaattc tcaaacctcc taggatattt ccccaccatc attcaccgtt 13380 tggtaccaac aataaaccta gcagcaagcc aaaaattagc ctccacatta atagacataa 13440 tctgactaga atacctactg ccaaagtcta tttcccatct aaacatgaaa tcatcaatca 13500 ccatctctaa ccaaaaaggc ctgattaaac tgtatttcct gtccttcata attaccctga 13560 ccctagccct aatcctaaca acagctaatt tccacgagta atctccatga taactagcac 13620 tccaacaaga agagatcaac cagtcacaat aaccaaccaa gtaccataac tgtataaagc 13680 cgcaataccc atggcctctt cactaaaaaa tcccgagtct cccgtgtcat aaactactca 13740 atcacccata ccattaaacc caaacacaac atcagcctca tcatctttta aaatataaca 13800 agccaatagt aactcagata gaaggcccgc aataaacgca cccagcacag ccttattaga 13860 cacccagacc tcaggatatt gctcagtggc tatagcagtt gtataaccaa aaacaacgag 13920 cataccaccc aaataaatta aaaatactat taagcccaaa aaggacccac caaaactcaa 13980 cacaatacca caaccaaccg ctccactaac aatcaaaact aaccctccat agataggaga 14040 aggcttagaa gagaacccca caaaacctac tacaaagaca atacttaaaa taaacacaaa 14100 atatgtcatc attattctca catggaattt aaccaagacc aatgacatga aaaatcatcg 14160 ttgtaattca actataagaa cactaatgac caacattcga aaagtacatc cactggccaa 14220 aattatcaac agctcactta tcgacctgcc cgcaccatct aacatctcag catgatgaaa 14280 ctttggatcc ctcctcgcag catgcttagc cttacaaatc ctaacaggcc ttttcctagc 14340 tatacactat accycagaca ccaccacagc cttttcatca gtcacccaca tttgccgaga 14400 cgtcaactac ggctgaatca tccgatacat gcacgcaaat ggggcctcca tattctttat 14460 ctgtctctac atgcacgtag gacgaggact gtactacgga tcctatacac taacagaaac 14520 atgaaacatt ggcatcatcc tcctatttac aatcatagct acagcattta taggctatgt 14580 acttccatga ggacaaatat cattctgagg agcaaccgtc attaccaacc tcctatcagc 14640 agtcccttac atcggaacca acctagtaga atgaatttga ggaggatttt cagtcgacaa 14700 agcaacccta acacgattct ttgcctttca ctttattctc cccttcatag catcagcact 14760 agtaatagta cacctattat tcctacacga aactgggtcc aacaatccat caggaatctc 14820 ctctgactca gacaaaatcc cattccaccc atattacaca attaaagata tcctaggaac 14880 cctcctacta atcttaaccc taatactact agtaatattt tcaccggacc tgctgggaga 14940 cccagacaac tacattccag ccaaccccct cagcactcca ccacatatta aacctgaatg 15000 atatttccta ttcgcctatg ctatcttacg atccatcccc aacaaattag ggggagtcct 15060 agccctactc ctatcaatct taattctagc tatcattcca ctacttcata catcaaaaca 15120 acgaggaata atattccgac ccatcagcca atgcctcttc tgactcctag tagcagacct 15180 actcacattg acatgaatcg gaggacaacc agtcgaacac cccttcatca ccatcggcca 15240 actagcctca atcctatact tcactatcct cctaattttc atacccatcg ccggcattat 15300 cgaaaataat atcctaaaat gaagagtctt tgtagtataa taattacttt ggtcttgtaa 15360 accaaaaatg gagaacacca tgaccctccc taagactcaa ggaagaagca acagccccac 15420 catcaacacc caaagctgac attctaatta aactattccc tgacatgatt aaactcccca 15480 cattcatata taccactacc cctactgtgc caccatagta tcttttcttc ccctatgtac 15540 gtcgtgcatt aatggcttgc cccatgcata taagcatgta catatcatga ttgattttac 15600 ataatgacat aactttaaac accttgactc aaacactgta acttcttgat acaaatgtaa 15660 ctcacttagt ccacgaagct taatcaccag gcctcgagaa accagcaacc cttgtgaaaa 15720 gtgtacctct tctcgctccg ggcccatctc aacgtggggg tagctagacc agatctatac 15780 ctggcatctg gttcttactt cagggtcata aggctcacga attcaatcct actaacctct 15840 caaatgggac atctcgatgg acttatgaca aatcagccca tgatcacaca taactgtgat 15900 gtcatacatt tggtattttt taatttttag ggggggggga ctggtatcac tcagctatga 15960 ccgtaaaggt cttgacgcag tcagataact tgtagctggg cttaattatt atcatttacc 16020 agcatcatac aaccatgagg cgcattttag tcaatggtcg caggacatac acgtatacac 16080 gcacacgtat acacgtatac acgtatacac gcacacgtat acacgtatac acgtatacac 16140 gtatacacgt atacacgtat acacgcacac gtatacacgt atacacgtat acacgtatac 16200 acgtatacac gtatacacgt atacacgtat acacgcacac gtatacacgt atacacgtat 16260 acacgtatac acgtatacac gtatacacgt atacacgtat acacgtatac acgtatacac 16320 gtatacacgt atacacgcac acgtatacac gtatacacgt atacatattc atgttaattt 16380 aaatgacaga cattaagtta actaagacaa acccccctta ccccccgtaa cttcaaaaag 16440 tatacagata tccacttttg tcctgccaaa ccccaaaaac agaactagat aaatgcaaca 16500 aaaatgaagc caggatctgc aaccaaattt aacttaacca acccagtcaa caggtcacaa 16560 aacacaaaca taatacttaa atcttaagtc tatctataga tatacatttc ccgcctctaa 16620 ctccccccta tcaaccttcc acttttattc ccaccaacca tccccataaa atcaacca 16678 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extended primer <400> 2 ttgtaaccaa ttgcggacgc t 21 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extended primer <400> 3 cgcaccccta tccat 15 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extended primer <400> 4 aacataagtt tctgacttct acc 23 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extended primer <400> 5 aggccgactg atcaa 15 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extended primer <400> 6 ggggctgatg ttaatgaggg c 21 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extended primer <400> 7 cggccatcgc atcggagacg taggctt 27 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extended primer <400> 8 tagggtggaa tcggat 16 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extended primer <400> 9 ctcctacaca tctgcac 17 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extended primer <400> 10 gaggacacga ttctttgcct t 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extended primer <400> 11 actctcctct gactcagaca aaat 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2916_W1_F primer <400> 12 actctcctct gactcagaca aaat 24 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2916_W1_R primer <400> 13 acgttggatg gtggtcgtaa gggttctttg 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4349_W1_F primer <400> 14 acgttggatg catgacaaaa aatcgcaccc 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4349_W1_R primer <400> 15 acgttggatg atggtggtta gtaggttggg 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5676_W1_F primer <400> 16 acgttggatg tggcatttcc ccgaataaac 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5676_W1_R primer <400> 17 acgttggatg ggcttcaact agagaagagg 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8075_W1_F primer <400> 18 acgttggatg taggccttcc tatcgtaacc 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8075_W1_R primer <400> 19 acgttggatg cactgttgaa ttgaggtgag 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8495_W1_F primer <400> 20 acgttggatg acagccaata tcactgcagg 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8495_W1_R primer <400> 21 acgttggatg taagggccgt aattgcgctg 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12320_W1_F primer <400> 22 acgttggatg tctacaatcg catcggagac 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12320_W1_R primer <400> 23 acgttggatg tggaggtctc acgtgtttag 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12554_W1_F primer <400> 24 acgttggatg cactatagtt gtagctggag 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12554_W1_R primer <400> 25 acgttggatg tcctaggcat agggtgattg 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12767_W1_F primer <400> 26 acgttggatg gccatatcta gcattcctac 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12767_W1_R primer <400> 27 acgttggatg cgtcgtttag gttgtggatg 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14728_W1_F primer <400> 28 acgttggatg ttcagtcgac aaagcaaccc 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14728_W1_R primer <400> 29 acgttggatg agtgctgatg ctatgaaggg 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14839_W1_F primer <400> 30 acgttggatg tcaggaatct cctctgactc 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14839_W1_R primer <400> 31 acgttggatg ggttaagatt agtaggaggg 30

Claims

(a) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 2,916번째 염기가 A이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 2,916번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 4,349번째 염기가 T이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 4,349번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(c) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 5,676번째 염기가 T이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 5,676번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(d) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 8,075번째 염기가 C이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 8,075번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(e) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 8,495번째 염기가 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 8,495번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(f) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 12,320번째 염기가 C이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 12,320번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(g) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 12,554번째 염기가 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 12,554번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(h) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 12,767번째 염기가 C이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 12,767번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(i) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 14,728번째 염기가 T이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 14,728번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
(j) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 14,839번째 염기가 C이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 14,839번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 독도강치 판별용 SNP 마커 세트.
제1항의 독도강치 판별용 SNP 마커 세트를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 독도강치 판별용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 제제는, 서열번호 2 내지 서열번호 11로 중 하나 이상의 독도강치 SNP 마커 증폭을 위한 매스 어레이(Mass array) 분석용 익스텐디드(Extended) 프라이머를 포함하는 독도강치 판별용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 제제는, 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 18 및 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 20 및 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 24 및 서열번호 25의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 26 및 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 30 및 서열번호 31의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트;로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 독도강치 판별용 조성물.
(a) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 2,916번째 염기가 A이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 2,916번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 4,349번째 염기가 T이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 4,349번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(c) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 5,676번째 염기가 T이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 5,676번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(d) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 8,075번째 염기가 C이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 8,075번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(e) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 8,495번째 염기가 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 8,495번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(f) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 12,320번째 염기가 C이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 12,320번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(g) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 12,554번째 염기가 G이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 12,554번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(h) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 12,767번째 염기가 C이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 12,767번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
(i) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 14,728번째 염기가 T이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 14,728번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
(j) 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 14,839번째 염기가 C이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 14,839번째 염기를 포함하는 5 내지 401개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 독도강치 판별용 마이크로어레이.
개체로부터 분리된 시료의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 12 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 14 및 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 18 및 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 20 및 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 24 및 서열번호 25의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 26 및 서열번호 27의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 30 및 서열번호 31의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트;로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 사용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 독도강치 종의 판별방법.
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