WO2020246688A1 - 오핀 바이오센서 및 이를 이용한 뿌리혹병과 뿌리혹선충병 진단방법 - Google Patents

오핀 바이오센서 및 이를 이용한 뿌리혹병과 뿌리혹선충병 진단방법 Download PDF

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    • C12Y105/01011—D-Octopine dehydrogenase (1.5.1.11)
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    • C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
    • C12Y105/01019—D-Nopaline dehydrogenase (1.5.1.19), i.e. D-nopaline synthase

Definitions

  • the present invention relates to an OPIN biosensor and a method for diagnosing root-knot nematode disease and root-knot nematode disease using the same.
  • root gall disease is a soil epidemic that occurs worldwide and causes great damage.
  • crown gall known as root gall disease
  • root gall disease is a disease that occurs mainly in pears, apples, and roses
  • pathogen is known as Agrobacterium tumefaciens .
  • root gall disease a root cancer disease
  • the diagnosis of root-knot disease is mainly made through the isolation culture method, PCR assay, and serological method.
  • the density of root-knot nematodes at the infected site is very low, so this method has limitations.
  • root-knot nematode disease can often be misdiagnosed with symptoms of root-knot nematode disease, and experts are also having difficulty in diagnosing, so there are limitations in selecting appropriate treatment and control methods.
  • the present inventors developed a biosensor to diagnose root-knot nematode disease and root-knot disease symptoms, and confirmed that the root-knot nematode disease and root-knot disease were diagnosed and completed the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a composition for detecting root lump disease capable of distinguishing and diagnosing root lump disease.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for detecting root lump disease capable of distinguishing and diagnosing root lump disease.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting root lump disease capable of distinguishing and diagnosing root lump disease.
  • composition for detecting root lump disease comprising the noxB nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the ooxB nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the noxB may be prepared from a primer set represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4
  • the ooxB may be prepared from a primer set represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • kits for detecting root gall disease comprising the composition for detection.
  • Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ) strain for detecting root gall disease mutated with the noxB nucleotide sequence or the ooxB nucleotide sequence is provided.
  • the step of culturing a plant root lump tissue in an incubator containing the detection composition and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ⁇ -D-galactopyranoside ( It provides a method for detecting root gall disease comprising the step of adding X-gal).
  • the detection method is characterized in that when the color changes, it is diagnosed as a root-knot disease caused by a root-knot disease.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the production of a biosensor for diagnosing root-knot nematodes of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of applying the biosensor for diagnosing root-knot nematodes of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing the reaction results of the biosensor for diagnosing root-knot nematodes according to the present invention to synthetic Opine.
  • Figure 4 shows the reaction result of the plant Opine (Opine) of the biosensor for root-knot nematode diagnosis of the present invention.
  • Figure 6 shows the results of quantification of offin through ⁇ -Galactosidase activity test of the biosensor for diagnosing root-knot nematodes of the present invention.
  • the present invention relates to an OPIN biosensor and a method for diagnosing root-knot nematode disease and root-knot nematode disease using the same.
  • an offin biosensor capable of easily distinguishing and diagnosing root-knot nematode disease and root-knot nematode disease, which are difficult to distinguish and diagnose, and a method for diagnosing root-knot nematode disease and root-knot nematode disease using the same.
  • the bioassay method of the present invention can be diagnosed by distinguishing between root lump disease and root lump worms from plant tissues infected with root lump disease bacteria.
  • Root-knot disease produces Opine from lump tissue caused by Agrobacterium tumefaciens, and Opine is not produced in lump tissue of root-knot nematode disease.
  • the biosensor in the present invention can be distinguished by recognizing Opines made by plant tissues. Nopaline introduced from the outside binds to the transcriptional regulatory protein NocR. The NocR/nopaline conjugate activates noxB-lacZY transcription to induce beta-galactosidase ( ⁇ -Galactosidase) expression.
  • Beta-galactosidase decomposes the substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ⁇ -D-galactopyranoside (X-gal), and the resulting product becomes blue.
  • Octopine introduced from the outside binds to the transcriptional regulatory protein OccR.
  • the OccR/Octopine conjugate activates ooxB-lacZY transcription and induces beta-galactosidase expression.
  • Beta-galactosidase ⁇ -Galactosidase decomposes the substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ⁇ -D-galactopyranoside (X-gal), and the resulting product becomes blue.
  • an embodiment of the present invention provides a method for detecting root gall disease. Specifically, a part of the root nodule tissue is placed in an incubator mixed with the biosensor of the present invention, cultured at 28°C for 6 to 12 hours, and then beta-galactosidase ( ⁇ -Galactosidase) activity is assayed. And culturing the plant root-knot tissue in an incubator containing the composition, and adding 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ⁇ -D-galactopyranoside (X-gal) to the incubator.
  • ⁇ -Galactosidase beta-galactosidase activity
  • beta-galactosidase ( ⁇ -Galactosidase) activity reaction appears only in the lump formed by the root lump disease, and the blue color appears, and through this, it is possible to diagnose the root lump disease caused by the root lump disease. If it turns blue, it can be diagnosed as root-knot nematode disease as a positive reaction, and if it does not turn blue, it is negative for root-knot nematode disease.
  • the'%' used to indicate the concentration of a specific substance is (w/w)% for solids/solids, (w/v)% for solids/liquids, and Liquid/liquid is (v/v) %.
  • a biosensor strain for diagnosing root lump disease-nematodes through lacZY transcriptional fusion was constructed.
  • a part of the noxB (nopaline oxidase) gene was amplified using PCR.
  • a 318 bp (SEQ ID NO: 1) fragment was obtained.
  • the fragment was cloned into vector pVIK112 using EcoRI and KpnI as two restriction enzymes to produce pBY34 plasmid.
  • pBY34 was mutated in Agrobacterium tumefaciens C58 strain (Kalogeraki et al. 1997, Gene 188:69-75) to produce root gall disease-root-knot nematode diagnostic biosensor strain C58 noxB-lacZY (FIG. 1A) .
  • a biosensor strain for diagnosing root lump disease-nematodes through lacZY transcriptional fusion was constructed.
  • OoxBE Using two primers OoxBE (5'-GAATTCCAGCAAGACGGAGCATTT-3', SEQ ID NO: 5) and OoxBK (5'-GGTACCGCGTGACAGGATAGAAAA-3', SEQ ID NO: 6), a part of the ooxB ( Octopine oxidase) gene was amplified by performing PCR. A 345 bp (SEQ ID NO: 2) fragment was obtained. The pBY36 plasmid was constructed by cloning the fragment into vector pVIK112 using EcoRI and KpnI as two restriction enzymes. pBY36 was mutated in Agrobacterium tumefaciens 15955 strain (Kalogeraki et al. 1997, Gene 188:69-75) to produce root gall disease-root-knot nematode diagnostic biosensor strain 15955 ooxB-lacZY (FIG. 1B) .
  • the Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ) NS19 (C58 noxB-lacZY ) strain and the Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ) OS19 (15955 ooxB-lacZY ) strain prepared in this example were each of the Korea Agricultural Microbiological Resources Center It was deposited with the (Korean Agricultural Culture Collection, KACC) on May 21, 2019.
  • Raspberry root nodules showed blue color in nopaline-based biosensors, but no response was observed in octopine-based biosensors. Therefore, it was diagnosed as root lump disease caused by raspberry root or A. tumefaciens based on octopine (FIG. 2A).
  • the zucchini root-knot tissue was also assayed in a similar manner, but the zucchini root-knot tissue did not respond to any biosensors (Fig. 2B), and formed blue only in the positive control group. Therefore, it was finally diagnosed as a root-knot nematode disease caused by a zucchini root or a root-knot nematode. As a result of microscopic examination of the zucchini root nodule, the root-knot nematode was speculum.
  • Synthetic Opine was used to see if the biosensor was working properly.
  • ABX-gal Agrobacterium mannitol media + X-gal; Kim et al. 2012, PloS One 8, e56682
  • nopaline biosensor C58 noxB-lacZY
  • octopine biosensor 15955 ooxB-lacZY
  • Plant Opine was used to see if the biosensor reflected on plant-derived Opine and sensed the presence or absence of Opine. Plant Opine is a common method for inducing lump formation after artificial inoculation of Agrobacterium tumefaciens C58 strain and Agrobacterium tumefaciens 15955 strain, respectively, to tomato stems and potatoes.
  • Plant Opine is a common method for inducing lump formation after artificial inoculation of Agrobacterium tumefaciens C58 strain and Agrobacterium tumefaciens 15955 strain, respectively, to tomato stems and potatoes.
  • Nopaline (nopaline) biosensor (C58 noxB-lacZY ) and octopine (Octopine) biosensor (15955 ooxB-lacZY ) was put into an ABX-gal incubator and hardened, and then the plant-derived hump tissue was placed in the prepared incubator. After 12 hours incubation, the nopaline biosensor (C58 noxB-lacZY ) decomposes X-gal and turns blue only in the lump tissue made by the nopaline-based Agrobacterium tumefaciens C58 strain.
  • Beta-galactosidase ( ⁇ -Galactosidase) activity assay followed a commonly used method (Miller, 1972; Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the sensitivity of the Opine-based biosensor was evaluated by measuring the enzyme activity of beta-galactosidase ( ⁇ -Galactosidase).
  • the linear dose response was calculated using synthetic nopaline and octopine.
  • the results of the nopaline-based biosensor (C58 noxB-lacZY) showed a good linear relationship in the range of 0-100 and 100-500 nM, and the low concentration range (0-100 nM) showed a large slope. Was seen (Fig. 6).
  • the octopine-based biosensor (15955 ooxB-lacZY ) had strong sensitivity to octopine (FIG. 6).
  • the results of the octopine-based biosensor showed an excellent linear relationship in the range of 0-50 and 50-200 nM with the slope following the same pattern represented by C58 noxB-lacZY .
  • the octopine-based biosensor showed excellent sensitivity to octopine detection and was somewhat more sensitive than the nopaline-based biosensor (FIG. 6).

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Abstract

본 발명은 오핀 바이오센서 및 이를 이용한 뿌리혹병과 뿌리혹선충병 진단방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 noxB 염기서열 또는 ooxB 염기서열을 포함하는 뿌리혹병 검출용 조성물은 구별하여 진단하기 어려운 뿌리혹선충병과 뿌리혹병을 쉽게 구별하여 진단할 수 있는 이점이 있어, 식물 질병 치료 및 방제에 활용될 수 있다. [대표도] 도 1

Description

오핀 바이오센서 및 이를 이용한 뿌리혹병과 뿌리혹선충병 진단방법
본 발명은 오핀 바이오센서 및 이를 이용한 뿌리혹병과 뿌리혹선충병 진단방법에 관한 것이다.
일반적으로 뿌리혹병은 전 세계적으로 발생하여 큰 피해를 주고 있는 토양전염병이다. 그 중 뿌리혹병으로 알려져 있는 근두암종병(crown gall)은 배, 사과, 장미 등에 주로 생기는 병을 그 병원균은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 알려져 있다.
그러나, 근도암종병인 뿌리혹병은 다른 뿌리혹병의 증상이 유사하여 육안으로 구분하기 어렵다. 특히, 뿌리혹선충의 진단법은 현재 전무하고 뿌리혹병의 진단은 주로 분리배양법, PCR 검정법, 혈청학적 방법을 통해 이루어지는데, 감염부위에서 뿌리혹병균의 밀도가 매우 낮아 이러한 방법으로는 한계가 있다. 게다가 뿌리혹병은 흔히 뿌리혹선충병 증상과 오진될 수 있고, 전문가들도 진단에 어려움을 겪고 있어 적절한 치료 및 방제 방법 선택에 한계가 발생되고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
대한민국 등록특허 제10-1876273호
대한민국 공개특허 제10-2015-0056922호
본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 뿌리혹선충병과 뿌리혹병 증상을 진단하기 위하여 바이오센서를 개발하였으며, 이를 통한 뿌리혹선충병과 뿌리혹병을 구별하여 진단함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 뿌리혹병을 구별 및 진단할 수 있는 뿌리혹병 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 뿌리혹병을 구별 및 진단할 수 있는 뿌리혹병 검출용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 뿌리혹병을 구별 및 진단할 수 있는 뿌리혹병 검출 방법을 제공하는 것이다.
이상에서의 본 발명에서 해결하고자 하는 다양한 과제들은 이에 한정하는 것이 아니라, 후술할 실시예 및 청구범위에 기재된 사항을 통하여 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 분명하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위해 본 발명의 일실시예에 따르면 서열번호 1로 표시되는 noxB 염기서열 또는 서열번호 2로 표시되는 ooxB 염기서열을 포함하는 뿌리혹병 검출용 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 noxB는 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트로부터 제조되는 것이고, 상기 ooxB는 서열번호 5와 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트로부터 제조되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 검출용 조성물을 포함하는 뿌리혹병 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 noxB 염기서열 또는 ooxB 염기서열로 돌연변이된 뿌리혹병 검출용 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 검출용 조성물이 담긴 배양기에 식물 뿌리혹 조직을 올려두고 배양하는 단계 및 상기 배양기에 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside(X-gal)을 첨가하는 단계를 포함하는 뿌리혹병 검출방법을 제공한다.
또한, 상기 검출 방법은 색상이 변화하는 경우 뿌리혹병균에 의한 뿌리혹병 으로 진단되는 것을 특징으로 한다.
전술한 바와 같은 본 발명에 따르면, 뿌리혹선충과 뿌리혹병을 구별하여 쉽고 간단하게 진단할 수 있다.
이상에서의 본 발명에 따른 효과는 상기에 한정되는 것은 아니며, 기타 본 발명의 효과들은 후술할 실시예 및 청구범위에 기재된 사항을 통하여 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 분명하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 뿌리혹병-뿌리혹선충 진단 바이오센서 제작 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 뿌리혹병-뿌리혹선충 진단용 바이오센서 적용 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 뿌리혹병-뿌리혹선충 진단용 바이오센서의 합성 오핀(Opine)에 대한 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 뿌리혹병-뿌리혹선충 진단용 바이오센서의 식물 오핀(Opine)에 대한 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 뿌리혹병-뿌리혹선충 진단용 바이오센서의 TLC 검정에 따른 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 뿌리혹병-뿌리혹선충 진단용 바이오센서의 β-Galactosidase 활성검정을 통한 오핀 정량화 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명은 오핀 바이오센서 및 이를 이용한 뿌리혹병과 뿌리혹선충병 진단방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 구별하여 진단하기 어려운 뿌리혹선충병과 뿌리혹병을 쉽게 구별하여 진단할 수 있도록 하는 오핀 바이오센서 및 이를 이용한 뿌리혹병과 뿌리혹선충병 진단방법을 제시한다.
본 발명의 생물검정방법은 뿌리혹병균에 감염된 식물조직으로부터 뿌리혹병과 뿌리선혹충병을 구별하여 진단할 수 있다.
뿌리혹병은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 의해 발병되는 혹조직으로부터 오핀(Opine)이 생산되고, 뿌리혹선충병의 혹조직에서는 오핀(Opine)이 생산되지 않는다. 본 발명에서의 바이오센서는 식물조직이 만들어낸 오핀(Opine)을 인식하여 구분할 수 있다. 외부로부터 유입된 노팔린(nopaline)은 전사조절 단백질 NocR와 결합한다. NocR/nopaline 결합체는 noxB-lacZY 전사를 활성화시켜 베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase) 발현을 유도한다. 베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase)는 기질인 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside(X-gal)을 분해하고 여기에서 나온 산물이 파란색을 띄게 한다.
외부로부터 유입된 옥토핀(Octopine)은 전사조절 단백질 OccR과 결합한다. OccR/Octopine 결합체는 ooxB-lacZY 전사를 활성화시켜 베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase) 발현을 유도한다. 베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase)는 기질인 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside(X-gal)을 분해하고 여기에서 나온 산물이 파란색을 띄게 한다.
또한, 본 발명의 일실시예에서 뿌리혹병 검출방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명의 바이오센서를 혼합한 배양기에 뿌리혹 조직 일부를 올려두고 28℃에서 6~12시간 배양한 후 베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase) 활성을 검정하는 것으로, 본 발명의 검출용 조성물이 담긴 배양기에 식물 뿌리혹 조직을 올려두고 배양하는 단계 및 상기 배양기에 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside(X-gal)을 첨가하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명에 따르면 뿌리혹병균에 의해 형성된 혹에서만 베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase) 활성 반응이 나타나 파란색을 띄고, 이를 통해 뿌리혹병균으로 발병된 뿌리혹병을 진단할 수 있다. 파란색으로 변하면 양성반응으로 뿌리혹병균으로 진단하고 파란색으로 변하지 않으면 음성반응으로 뿌리혹선충병으로 진단할 수 있다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
실시예 1. 뿌리혹병-뿌리혹선충병 진단용 바이오센서 제작
lacZY transcriptional fusion을 통한 뿌리혹병-선충 진단바이오센서 균주를 제작하였다.
두 가지 프라이머 NoxBE(5'-GAATTCGCAATTGGATACGGGTTA-3', 서열번호 3)와 NoxBK(5'-GGTACCGCGATAGTCAGGATGAAT-3', 서열번호 4)를 이용하여 noxB(nopaline oxidase) 유전자의 일부를 PCR을 이용하여 증폭하여 318 bp(서열번호 1)의 절편을 확보하였다. 두 가지 제한효소로, EcoRI과 KpnI를 이용하여 절편을 vector pVIK112에 클로닝하여 pBY34 plasmid를 제작하였다. pBY34를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) C58 균주에 돌연변이(Kalogeraki 등 1997, Gene 188:69-75)시켜 뿌리혹병-뿌리혹선충병 진단 바이오센서 균주 C58 noxB-lacZY를 제작하였다(도 1A).
lacZY transcriptional fusion을 통한 뿌리혹병-선충 진단바이오센서 균주를 제작하였다.
두 가지 프라이머 OoxBE(5'-GAATTCCAGCAAGACGGAGCATTT-3', 서열번호 5)와 OoxBK(5'-GGTACCGCGTGACAGGATAGAAAA-3', 서열번호 6)를 이용하여 ooxB(Octopine oxidase) 유전자의 일부를 PCR을 수행하여 증폭시켜 345 bp(서열번호 2)의 절편을 확보하였다. 두 가지 제한효소로, EcoRI과 KpnI를 이용하여 절편을 vector pVIK112에 클로닝하여 pBY36 플라스미드를 제작하였다. pBY36를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 15955 균주에 돌연변이(Kalogeraki 등 1997, Gene 188:69-75)시켜 뿌리혹병-뿌리혹선충병 진단 바이오센서 균주 15955 ooxB-lacZY를 제작하였다(도 1B).
본 실시예에서 제작한 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) NS19 (C58 noxB-lacZY) 균주 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) OS19 (15955 ooxB-lacZY)균주를 각각 한국농업미생물자원센터 (Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2019년 5월 21일자로 기탁하였다.
1) Agrobacterium tumefaciens NS19 (C58 noxB-lacZY) (KACC 81094BP)
2) Agrobacterium tumefaciens OS19 (15955 ooxB-lacZY) (KACC 81095BP)
실시예 2. 뿌리혹병-뿌리혹선충 진단용 바이오센서 적용
진단을 위해 사용된 산딸기뿌리혹과 애호박뿌리혹 증상은 육안으로 구분하기 어렵다.
각각 노팔린(nopaline) 바이오센서(C58 noxB-lacZY)와 옥토핀(Octopine) 바이오센서(15955 ooxB-lacZY)를 ABX-gal(Agrobacterium mannitol media + X-gal; Kim 등 2012, PloS One 8, e56682)배양기 속에 넣고 굳힌 다음, 진단을 위한 혹조직 일부를 치상하고, 12시간 배양하였다.
산딸기뿌리혹 조직은 노팔린(nopaline) 기반 바이오센서에서 청색을 나타내지만 옥토핀(Octopine) 기반 바이오센서에서는 아무런 반응도 나타나지 않았다. 따라서, 산딸기뿌리혹은 옥토핀(Octopine)을 기반으로 하는 A. tumefaciens에 의한 뿌리혹병으로 진단하였다(도 2A).
유사한 방법으로 애호박뿌리혹 조직도 검정하였는데, 애호박뿌리혹 조직은 어떠한 바이오센서에도 반응을 보이지 않았고(도 2B), 양성 대조군에서만 청색을 형성하였다. 따라서, 애호박뿌리혹은 뿌리혹선충에 의해 발생한 뿌리혹선충병으로 최종 진단하였다. 현미경 검정을 통한 애호박뿌리혹의 조직 검사를 실시한 결과, 뿌리혹선충이 검경 되었다.
실시예 3. 합성 오핀(Opine)에 대한 바이오센서의 반응
바이오센서가 제대로 작동하는지 알아보기 위해 합성 오핀(Opine)을 사용하였다. 각각 노팔린(nopaline) 바이오센서(C58 noxB-lacZY)와 옥토핀(Octopine) 바이오센서(15955 ooxB-lacZY)를 ABX-gal(Agrobacterium mannitol media + X-gal; Kim 등 2012, PloS One 8, e56682)배양기 속에 넣고 굳힌 다음, 합성 노팔린(nopaline)과 옥토핀(Octopine) 10 μM가 각각 함유된 페이퍼디스크를 준비한 배양기에 올려 두었다. 12시간 배양 후 노팔린(nopaline) 바이오센서(C58 noxB-lacZY)는 노팔린(nopaline)에서, 그리고 옥토핀(Octopine) 바이오센서(15955 ooxB-lacZY)는 옥토핀(Octopine)에서만 반응을 보이고 파란색으로 변색된 것을 확인하였다(도 3). 이러한 결과는, 바이오센서가 오핀(Opine)에 반응하여 제대로 작동한다는 것을 의미한다.
실시예 4. 식물 오핀(Opine)에 대한 바이오센서의 반응
바이오센서가 식물유래 오핀(Opine)에 반영하여 오핀(Opine)의 존재 유무를 센싱하는지 알아보기 위해 식물 오핀(Opine)을 사용하였다. 식물 오핀(Opine)은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) C58 균주와 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 15955 균주를 각각 토마토줄기와 감자에 인공접종한 후 혹형성을 유도하는 일반적인 방법에 따랐다(Kim 등 2012, PloS One 8, e56682). 노팔린(nopaline) 바이오센서(C58 noxB-lacZY)와 옥토핀(Octopine) 바이오센서(15955 ooxB-lacZY)를 ABX-gal 배양기 속에 넣고 굳힌 다음, 식물유래 혹조직을 준비한 배양기에 올려 두었다. 12시간 배양 후 노팔린(nopaline) 바이오센서(C58 noxB-lacZY)는 노팔린(nopaline) 기반 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) C58균주가 만든 혹조직에서만 X-gal을 분해하여 파란색으로 변하였고, 옥토핀(Octopine) 바이오센서(15955 ooxB-lacZY)는 옥토핀(Octopine) 기반 A. tumefaciens 15955 균주가 만든 혹조직에서만 반응을 보이고 파란색으로 변색된 것을 확인하였다(도 4). 이러한 결과는, 바이오센서가 식물 오핀(Opine)에 반응하여 제대로 작동한다는 것을 의미한다.
실시예 5. TLC 검정에 따른 바이오센서의 반응
오핀(Opine) 검정을 위해 종이전기영동을 실시하였다. 이 방법은 현재 사용되지 않거나 쉽게 사용할 수 없다. 시료(1-5 μl)를 역상 TLC(Merck)에 치상하고 전개용매는 클로로포름/아세트산/물(2.8/3.5/0.7)을 사용하였다. 전개 후, 용매를 증발시키고, 건조된 플레이트에 본 발명에서 개발한 2개 바이오센서와 X-gal을 함유하는 ABX-gal 배지를 부어 실온에서 굳혔다. TLC는 28도에서 배양하였다. 합성 노팔린(N)과 식물 노팔린(1)의 Rf수치는 0.35이었고 합성 옥토핀(O)과 식물 옥토핀(2)의 Rf 수치는 0.4였다. 이로써, TLC검정을 통한 오핀(Opine) 분석이 가능함을 알 수 있었다(도 5).
실시예 6. 베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase) 활성검정을 통한 오핀(Opine) 정량화
베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase) 활성검정은 일반적으로 사용되는 방법에 따랐다(Miller, 1972; Cold Spring Harbor Laboratory Press). 베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase) 효소활성을 측정함으로써 오핀(Opine) 기반 바이오센서의 감도를 평가했다. 선형선량 반응은 합성 노팔린(nopaline)과 옥토핀(Octopine)을 사용하여 계산되었다. 노팔린(nopaline) 기반 바이오센서(C58 noxB-lacZY)의 결과는 0-100 및 100-500 nM의 범위에서 양호한 선형관계를 나타내었고, 낮은 농도범위 (0-100 nM)의 경우가 큰 기울기를 보였다(도 6). 옥토핀(Octopine) 기반의 바이오센서 (15955 ooxB-lacZY)는 옥토핀(Octopine)에 민감도가 강하였다(도 6). 옥토핀(Octopine) 기반 바이오센서의 결과는 C58 noxB-lacZY가 나타내는 동일한 패턴을 따르는 기울기와 함께 0-50 및 50-200 nM의 범위에서 우수한 선형관계를 나타냈다. 옥토핀(Octopine) 기반의 바이오센서는 옥토핀(Octopine) 검출에 탁월한 감도를 보였으며 노팔린(nopaline) 기반의 바이오센서보다 다소 민감하였다(도 6).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 농업생명공학연구원
수탁번호 : KACC81094BP
수탁일자 : 20190521
Figure PCTKR2020002504-appb-I000001
기탁기관명 : 농업생명공학연구원
수탁번호 : KACC81095BP
수탁일자 : 20190521
Figure PCTKR2020002504-appb-I000002

Claims (7)

  1. 서열번호 1로 표시되는 noxB 염기서열 또는 서열번호 2로 표시되는 ooxB 염기서열을 포함하는, 뿌리혹병 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 noxB는 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트로부터 제조되는 것이고,
    상기 ooxB는 서열번호 5와 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트로부터 제조되는 것인, 뿌리혹병 검출용 조성물.
  3. 제1항의 검출용 조성물을 포함하는, 뿌리혹병 검출용 키트.
  4. 제1항의 noxB 염기서열로 돌연변이된 뿌리혹병 검출용 아그로박테리움 투메파시엔스 NS19 (Agrobacterium tumefaciens NS19) 균주 (기탁번호 KACC 81094BP).
  5. 제1항의 ooxB 염기서열로 돌연변이된 뿌리혹병 검출용 아그로박테리움 투메파시엔스 OS19 (Agrobacterium tumefaciens OS19) 균주 (기탁번호 KACC 81095BP).
  6. 제1항의 검출용 조성물이 담긴 배양기에 식물 뿌리혹 조직을 올려두고 배양하는 단계 및 상기 배양기에 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal)을 첨가하는 단계를 포함하는, 뿌리혹병 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 검출 방법은 색상이 파란색으로 변화하는 경우에 뿌리혹병균에 의한 뿌리혹병으로 진단되는 것을 특징으로 하는 뿌리혹병 검출 방법.
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