KR101292375B1 - 톡소플라빈 검출용 바이오센스 균주 및 이를 이용한 톡소플라빈 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이오센서로서의 용도를 가지는 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P에 관한 것이다. 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P는 톡소플라빈을 생산할 수 있는 세균에 toxA 유전자 절편과 lacZ 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 도입을 통해 제조된 형질전환체로서, 세균의 기존 toxA 유전자가 넉아웃(Knock-Out)되어 더 이상 톡소플라빈을 생성하지 못하며 lacZ 유전자가 도입되어 외부에서 톡소플라빈이 유입되게 되면 lacZ가 함께 발현되어 베타갈락토시다아제(β-galactosidase)의 활성을 가진다. 따라서 상기와 같은 효과를 갖는 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주는 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)과 혼합하여 사용하는 경우, X-gal의 분해로 인해 파란색으로 가시화되어 톡소플라빈을 생산하는 세균에 감염된 식물조직으로부터 톡소플라빈의 유무 및 정량을 신속하고 간편하게 분석할 수 있으므로, 톡소플라빈 검출 바이오센서로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

톡소플라빈 검출용 바이오센스 균주 및 이를 이용한 톡소플라빈 검출방법{Biosensor Strain for Detecting Toxoflavin and Method for Detection of Toxoflavin Using Thereof}
본 발명은 톡소플라빈을 신속하게 검출할 수 있는 톡소플라빈 검출용 바이오센스 균주 및 이를 이용한 톡소플라빈 검출방법에 관한 것이다.
인체와 동식물에 유해한 물질인 톡소플라빈은 Burkholderia gladioli 및 Burkholderia glumae 등을 포함하는 다양한 세균에 의해 생산되는 독소로서, IUPAC name은 1,6-Dimethylpyrimido[5,4-e][1,2,4]triazine-5,7(1H,6H)-dione이며, 분자식은 C7H7N5O2이고, 분자량은 193.16로 알려져 있다.
한편 벼알마름병은 벌크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)라는 그람음성세균에 의해 일어나는 벼 병으로서 최근 우리나라와 일본, 동남아시아를 비롯해 미국 벼 재배 지역에서 중요시되는 병으로 기후변화에 아주 민감한 병이다. 벼알마름병은 온도와 습도가 높은 개화기에 발생하여 수확량을 34% 정도 줄이는 것으로 보고되어 있다. 벌크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)는 벼알마름병과 밭작물의 세균성 시들름병을 일으키는 병원성의 필수요소인 톡소플라빈(toxoflavin)과 류마이신(reumycin) 그리고 퍼베눌린(fervenulin)을 분비하고 이중 톡소플라빈(toxoflavin)이 가장 중요한 병원성 요소라는 것이 보고되어 있다.
따라서 톡소플라빈을 생산하는 세균과 동일세균에 감염된 식물조직으로부터 톡소플라빈을 조기에 간편하고 효율적으로 스크리닝할 수 있는 방법의 필요성이 독성오염여부 판단을 위해 요구되고 있으나, 이와 관련된 연구가 전무한 실정이다.
이에 본 발명자들은 toxA 유전자 절편과 lacZ 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 도입을 통해 제조된 형질전환체가 톡소플라빈 유무를 검출할 수 있는 바이오센서로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 톡소플라빈 유무를 신속하고 간편하게 검출할 수 있는 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이러한 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이러한 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 이용하여 간편하고 효율적으로 톡소플라빈을 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 toxA 유전자 절편과 lacZ 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 toxA 유전자 절편은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 개열지도 1로 표시되는 pCOK71 벡터일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 균주는 톡소플라빈을 생산할 수 없는 균주로서, 외부에서 톡소플라빈이 유입되면 베타갈락토시다아제(β-galactosidase) 활성을 가지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 toxA 유전자 절편을 증폭하는 단계; (b) 상기 (a) 단계를 통해 증폭된 toxA 유전자 절편을 lacZ 유전자를 포함하는 플라스미드에 클로닝하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 제조된 벡터를 균주에 도입하는 단계를 포함하는 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 toxA 유전자 절편은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 상기 바이오센서 균주를 톡소플라빈에 노출시키고, 베타갈락토시다아제(β-galactosidase)의 활성 값을 측정하는 단계를 포함하는 톡소플라빈 검출방법을 제공한다.
본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P는 톡소플라빈을 생산할 수 있는 세균에 toxA 유전자 절편과 lacZ 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 도입을 통해 제조된 형질전환체로서, 세균의 기존 toxA 유전자가 넉아웃(Knock-Out)되어 더 이상 톡소플라빈을 생성하지 못하며 lacZ 유전자가 도입되어 외부에서 톡소플라빈이 유입되게 되면 lacZ가 함께 발현되어 베타갈락토시다아제(β-galactosidase)의 활성을 가진다.
따라서 상기와 같은 효과를 갖는 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주는 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)과 혼합하여 사용하는 경우, X-gal의 분해로 인해 파란색으로 가시화되어 톡소플라빈을 생산하는 세균에 감염된 식물조직으로부터 톡소플라빈의 유무 및 정량을 신속하고 간편하게 분석할 수 있으므로, 톡소플라빈 검출 바이오센서로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 재조합 벡터인 pCOK71 plasmid map을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주의 제작 과정을 간략하게 나타낸 모식도이다(P: 프로모터, KmR: 카나마이신 저항성 유전자).
도 3은 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주의 작용 기작을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주의 톡소플라빈에 대한 특이적인 반응도를 베타갈락토시다아제 활성(β-galactosidase activity)측정을 통해 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 이용하여 독소 생성 세균의 톡소플라빈 생성 유무를 교차배양 실험을 통해 검정한 것이다(BGR1: Burkholderia glumae, PA13: Pantoea ananatis).
도 6은 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 이용하여 독소 생성 세균의 톡소플라빈 생성 유무를 평판도말 실험을 통해 검정한 것이다(BGR1: Burkholderia glumae, PA13: Pantoea ananatis, BSR3: Burkholderia gladioli).
도 7은 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 이용하여 독소 생성 세균의 톡소플라빈 생성 유무를 박층크로마토그래피(thin layer chromatography) 실험을 통해 검정한 것이다(S1: 톡소플라빈, 1: Pantoea ananatis 클로로포름 추출물, 2: Burkholderia glumae 클로로포름 추출물).
도 8은 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 이용한 톡소플라빈 정량분석을 위해, 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주에 농도별 톡소플라빈을 적용한 후 베타갈락토시다아제 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 바이오센서로서의 용도를 가지는 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서 '바이오센서(Biosensor)'라 함은 효소나 항체 등 생물체의 기능물질 또는 미생물 등 생물체가 특정 물질과 예민하게 반응하는 생물 감지 기능을 이용하여 시료에 함유되어 있는 화학물질을 선택적으로 검출하거나 계측할 수 있는 센서를 의미한다.
바이오센서는 감지 기능을 하는 검지 소자의 종류에 따라 효소센서, 항체센서, 미생물센서 등으로 분류되며, 이 중 살아있는 미생물을 검지 소자로서 막 등에 고정 및 장치하여 사용하는 미생물센서는, 알코올 발효나 글루탐산 발효 등 발효공업의 공정 관리, 수질 오염의 지표인 BOD(생물학적 산소요구량)의 측정 등에 이용되고 있다.
최근에는 특정 미생물 세포를 바이오센서의 구성요소로서 이용하는 미생물 바이오센서를 이용하는 기술이 연구되고 있다. 미생물 바이오센서는 실시간 분석, 조작의 간편성, 휴대가능성, 민감성 및 특이성이 우수하므로 널리 관심의 대상이 되고 있으며, 일반적으로 흡착(adsorption), 포획(entrapment), 공유결합(covalent bond), 가교결합(cross-linking) 또는 상기 방법의 조합이 생체물질의 고정에 이용되는데, 살아있는 세포를 이용할 경우 포획이나 흡착 방법이 유용하다.
따라서 본 발명에서는 톡소플라빈을 검출하는데 있어서 상기와 같은 특징을 가진 미생물, 구체적으로는 toxA 유전자 절편과 리포터 유전자로서 lacZ 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 toxA 유전자 절편은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 이에 한정되지 않으나, 상기 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 벡터는 toxA 유전자 절편을 lacZ 유전자를 포함하는 플라스미드에 삽입하는 과정을 통해 제조될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 통해 얻은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 toxA 유전자 절편을 lacZ 유전자를 포함하는 플라스미드에 삽입을 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서‘프라이머’라 함은 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 lacZ 유전자를 포함하는 플라스미드는, 숙주 내에서 복제 기점을 갖지 않는 자살 벡터(suicide vector)로서 lacZ 유전자를 포함하고 있는 것이면 그 종류를 특별히 제한하는 것은 아니나, 바람직하게는 pVIK112를 사용할 수 있다.
본 발명에서 ‘자살 벡터’라 함은 숙주 내에서 복제 기점을 갖지 않아 숙주 내에서 복제될 수 없는 벡터로서, 자살벡터 내에 도입된 특정 유전자를 숙주 세포로 삽입되면, 특정 유전자가 숙주세포 내로 전이(transposition)된 후에는 소실되는 벡터를 의미한다.
본 발명의 일실시예에서는 PCR을 통해 증폭한 toxA 유전자 절편을 lacZ 유전자를 포함하고 있는 pVIK112 벡터에 제한효소인 EcoRI과 KpnI 사이트를 도입하여 재조합 벡터인 pCOK71을 제조하였고, 이의 자세한 개열지도는 도 1에 나타내었다. 이렇게 제조된 본 발명의 재조합 벡터는 이후 바이오센서로 사용할 수 있는 균주에 도입하여 toxA 유전자 절편과 lacZ 유전자를 균주 내의 염색체로 transcriptional fusion을 통해 전이(transposition)를 유발하여, 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 제조할 수 있게 된다.
이때, 본 발명의 재조합 벡터를 도입할 수 있는 균주는 tox 오페론(toxABCDE)을 가지고 있어 톡소플라빈을 생산할 수 있는 균주이면 그 종류를 특별히 제한하는 것은 아니나, 바람직하게는 벌크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)를 사용할 수 있다.
따라서 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주는 toxA 유전자 절편과 lacZ 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 균주로서, 본 발명에 따른 재조합 벡터의 도입으로 상기 균주 내의 염색체 DNA(toxA)에 접합시키는 과정을 통해 제조될 수 있으며(도 2 참조), 본 발명의 재조합 벡터가 도입된 균주는 더 이상 톡소플라빈을 생성하지 못하게 된다.
그러나 외부에서 톡소플라빈이 유입되는 경우에는 톡소플라빈과 ToxR 단백질(Tox 조절 단백질)이 만나 톡소플라빈 생합성 유전자 군인 toxABCDE의 발현을 증가시킨다. 한편 다른 발현 조절단백질인 ToxJ가 있어야 toxABCDE의 발현을 증가시킬 수 있다. 이때, toxA에 삽입된 lacZ가 함께 발현되어 베타갈락토시다아제(β-galactosidase)가 활성을 가지게 되며, 베타갈락토시다아제는 기질인 X-gal을 분해하여 파란색의 분해산물을 생산하게 된다(도 3 참조).
그러므로 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주는 검출대상 시료에 톡소플라본이 있는 경우, 베타갈락토시다아제의 활성에 의한 X-gal 분해로 파란색의 가시화를 통해 톡소플라빈의 유무를 검출할 수 있다.
본 발명의 하기 실시예에서는, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 180bp의 toxA 유전자 절편을 자살 벡터인 pVIK112 내로 도입하여 재조합 벡터 pCOK71을 제조하였으며, 본 벡터를 벌크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae) BGR1 균주에 도입한 후 돌연변이 유발과정을 통하여 toxA 유전자가 넉아웃(Knock-Out)됨과 더불어 lacZ 유전자가 도입된 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 제조하였다. 이렇게 제조된 본 발명의 균주는 2011.12.12일자로 농업생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KACC91692P를 부여받았으며, 이하 본 발명에서는 “벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P”로 명명하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 방법에 의해 제작된 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P가 바이오센서로서 톡소플라빈에만 반응하는지를 살펴보기 위하여, 톡소플라빈 및 톡소플라빈 유도체들과의 반응여부를 베타갈락토시다아제 활성(β-galactosidase activity) 측정을 통해 평가한 결과, 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주는 톡소플라빈에서만 특이적으로 민감하게 반응하는 것으로 나타났다(도 4 참조).
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P를 이용하여 독소 생성 세균을 검정한 결과, 톡소플라빈을 생성하는 균주 주변에서는 생성된 톡소플라빈에 의해 본 발명의 균주가 반응하여 파란색으로 나타났으나, 톡소플라빈을 생성하지 못하는 균주 주변에서는 아무런 반응도 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 5 내지 도 7 참조).
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P를 이용한 톡소플라빈 정량분석을 실시한 결과, 톡소플라빈의 첨가량이 증가함에 따라 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주의 베타갈락토시다아제 활성(β-galactosidase activity)도 증대되는 것으로 나타났다(도 8 참조).
상기와 같은 실험 결과들은 본 발명의 균주가 톡소플라빈 검출 바이오센서로서의 유용하게 사용될 수 있음을 증명하는 것이다.
본 발명은 또한, (a) 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 toxA 유전자 절편을 증폭하는 단계; (b) 상기 (a) 단계를 통해 증폭된 toxA 유전자 절편을 lacZ 유전자를 포함하는 플라스미드에 클로닝하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 제조된 벡터를 균주에 도입하는 단계를 포함하는 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서 toxA 유전자 절편의 증폭은 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 PCR 기법을 통해 증폭될 수 있다.
PCR은 DNA의 원하는 부분의 복사본(copy)의 수를 기하급수적으로 증폭시킬 수 있는 분자생물학적 방법으로, DNA의 어느 부분이든지 그 서열(sequence)만 알면 PCR을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 1980년대 중반 K. Mullis에 의해서 처음 고안된 후, 유전자를 연구 및 분석하는 분자유전학을 포함한 많은 생물학 관련 연구에서 활용되었으며 현재에도 널리 이용되고 있는 실험 기법으로서 DNA 중합효소(polymerase)에 의한 DNA 복제를 그 특징으로 한다. DNA 중합효소는 외가닥(single strand) DNA를 주형(template)으로 해서 상보적인(complementary) DNA를 합성할 수 있는데, 이러한 외가닥 DNA는 두가닥(double strand) DNA를 끓임(boiling)으로써 간단하게 얻을 수 있다. 이 과정을 DNA 변성(denaturation)이라 한다. DNA 중합효소가 DNA 합성을 시작하기 위해서는 시작 부위(start site)가 두 가닥 DNA 형태로 되어 있어야 한다. 따라서 PCR에서는 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단(terminus)에 주형 DNA와 상보적으로 결합(annealing)할 수 있는 작은 DNA 조각(fragment)을 함께 넣어 주어야 하며 이것이 특정 DNA 서열의 양 끝에 결합하여 특정 DNA의 양 끝이 두 가닥 DNA 형태가 된다. 이럴 경우에만 DNA 중합효소에 의한 DNA 합성이 개시될 수 있다. 증폭시킬 DNA 서열의 양 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각을 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머 또는 줄여서 프라이머라 한다. 일단 프라이머가 주형 DNA에 결합한 후에는 DNA 중합효소의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 신장(extension)된다.
따라서 본 발병의 상기 (b) 단계의 toxA 유전자 절편은 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 PCR 기법을 통해 증폭한 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서 lacZ 유전자를 포함하는 플라스미드는 숙주 내에서 복제 기점을 갖지 않는 자살 벡터(suicide vector)로 lacZ 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 (c) 단계에서 상기 (b) 단계에서 제조된 벡터가 도입되는 숙주 미생물은 tox 오페론(toxABCDE)을 가지고 있어 톡소플라빈을 생산할 수 있는 균주이면 그 종류를 특별히 제한하는 것은 아니나, 바람직하게는 벌크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 바이오센서 균주를 톡소플라빈에 노출시키고, 베타갈락토시다아제(β-galactosidase)의 활성 값을 측정하는 단계를 포함하는 톡소플라빈 검출방법을 제공할 수 있다.
상기 검출대상 시료는 톡소플라빈을 생산하는 세균(Burkholderia glumae , Burkholderia gladioli 등)에 감염된 식물조직일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
재조합 벡터 제조
하기 표 1의 프라이머 세트를 이용하여 toxA 유전자 (GenBank Accession No. AY641455) 일부를 PCR을 이용하여 증폭하여 180bp의 절편을 확보한 후, 제한효소(EcoRI/KpnΙ)를 이용하여 상기 증폭된 절편을 pVIK112 벡터에 클로닝하여 재조합 벡터 pCOK71를 제작하였다(도 1 참조). PCR방법은 10ng의 Burkholderia glumae BGR1균주의 genomic DNA를 사용하였고 표 1에 제시한 10μM 농도의 각 프라이머 1μl를 사용하였다. 98℃에서 2분간 전처리한 후 98℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 30 cycle을 수행한 뒤 72℃에서 4분간 처리하였다. PCR로 증폭된 산물은 클로닝벡터에 클로닝하였고 염기서열분석을 통해 에러가 없는 것으로 검정하였다. PCR로 증폭된 toxA 유전자 일부의 180bp에 해당하는 염기서열은 서열번호 1로 표시하였다.
프라이머 서열 비고 서열번호
ToxAE 5'-GAATTCCACGTGCGCGACGTG-3' 밑줄은 제한효소 EcoRI 인식 부위를 나타냄 2
ToxAK 5'-GGTACCAAAATCCGGGTCGACGGTATA-3' 밑줄은 제한효소 KpnI 인식 부위를 나타냄 3
< 실시예 2>
본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 제조
상기 실시예 1에서 제조된 재조합 벡터 pCOK71을 Burkholderia glumae BGR1에 도입하고 mutagenesis를 통해 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 COK71 (BGR1 toxA::lacZ)를 제조하였다(도 2 참조).
E. coli S17-1(pCOK71)과 B. glumae BGR1을 각각 배양한 후 16시간 교배(mating)하였다. 그 후 리팜피신과 가나마이신을 각각 100μg/ml, 50μg/ml 씩 첨가한 LB한천배지에 도말하여 37℃에서 48시간동안 배양하였다. 두 가지 항생제에 모두 저항성을 보이는 균총을 선발하여 톡소플라빈 바이오센서 균주 COK71 (toxA::lacZ)을 개발하였고 PCR과 Southern hybridization을 통해 변이체를 확인하였다.
이렇게 제조된 본 발명의 균주는 2011.12.12일자로 농업생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KACC91692P를 부여받았으며, 이를 본 발명에서는 “벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P”로 명명하였다.
본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P는 Burkholderia glumae BGR1 균주 자체 내에 있는 톡소플라빈 생합성 유전자인 toxA에 상기 실시예 1에서 제조된 재조합 벡터(lacZ를 가진 pCOK71)을 삽입하여 만든 변이체로 더 이상 톡소플라빈을 생성하지 못하는 특성을 갖게 되며, 외부에서 톡소플라빈을 넣어주게 되면 톡소플라빈과 ToxR 단백질이 만나서 톡소플라빈 생합성 유전자군인 toxABCDE의 발현을 높이게 되는데, 이때 변이체인 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주는 toxA 유전자에 삽입된 lacZ가 함께 발현되어 β-galactosidase 활성을 가지게 된다(도 3참조).
따라서 톡소플라빈을 함유한 시료(예: 톡소플라빈에 감염된 조직)에 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)와 함께 적용하는 경우 본 발명의 균주에 의해 생성된 β-galactosidase가 X-gal을 분해함으로써 가시적으로 파란색을 띄는 균총의 형성을 통해 시료 내의 톡소플라빈 검출이 가능하게 된다.
< 실험예 1>
본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주의 바이오센서로서 민감도 측 정
본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P가 바이오센서로서 톡소플라빈에만 반응하는지를 살펴보기 위하여, 톡소플라빈 및 톡소플라빈 유도체들과의 반응여부를 베타갈락토시다아제 활성(β-galactosidase activity) 측정을 통해 평가하였다(하기 표 2 참조).
베타갈락토시다아제 활성(β-galactosidase activity)은 0.3mM o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)를 가수분해하는 정도를 측정하여 효소의 활성도로 나타내었다. 자세하게는 0.3mM o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)와 50mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)를 포함한 반응액에 베타갈락토시다아제 효소가 포함된 시료를 첨가하여 상온에서 70분간 반응시킨 후 반응액의 0.6배 부피의 1M Na2CO3 용액을 첨가하여 반응을 정지시키고 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성도는 1분 동안 1μmole의 para-nitrophenol을 유리시키는 효소 양을 1 unit으로 정의하였다.
그 결과, 도 4에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P는 톡소플라빈에서만 특이적으로 민감하게 반응이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주와 반응시킨 물질
순번 반응물질
1 methanol(대조군)
2 Toxoflavin
3 Reumycin
4 3-methyltoxoflavin
5 3-phenyltoxoflavin
6 3-methyl 4,8-dihydrotoxoflavin
7 6,9-dimethyl-8-oxo-6,9-dihydro-6-azapurine
8 1-methyl-1,2,4-triazine-5,6(1H,4H)-dione
< 실험예 2>
본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 이용한 독소 생성 세균의 검정방법
<2-1> 교차배양 검정방법
본 실험에서는 X-gal(40μg/ml)이 포함된 LB한천배지에 톡소플라빈 생성 유무를 확인하기 위하여, 톡소플라빈을 생성하는 병원균(Burkholderia glumae BGR1) 및 톡소플라빈을 생성하지 못하는 병원균(Pantoea ananatis PA13)을 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P와 교차배양하였다.
그 결과 도 5에서 나타난 바와 같이, 톡소플라빈을 생성하는 Burkholderia glumae BGR1 주변에서는 생성된 톡소플라빈에 의해 본 발명의 균주가 반응하여 파란색으로 나타났으나, 톡소플라빈을 생성하지 못하는 Pantoea ananatis PA13 주변에서는 아무런 반응도 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
<2-2> 평판도말 검정방법
본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P를 X-gal(40μg/ml)이 포함된 LB한천배지에 평판도말 한 후 톡소플라빈을 생성유무를 확인하고자 세균의 현탁액 5μl를 떨어뜨린 후 37℃에서 16시간 배양하였다.
그 결과 도 6에서 나타난 바와 같이, 톡소플라빈을 생성하는 Burkholderia glumae BGR1과 Burkholderia gladioli BSR3 주변에서는 생성된 톡소플라빈에 의해 본 발명의 균주가 반응하여 파란색으로 나타났으나, 톡소플라빈을 생성하지 못하는 Pantoea ananatis PA13 주변에서는 아무런 반응도 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
<2-3> TLC 검정방법
톡소플라빈 생성 유무를 확인하고자 하는 세균의 클로로포름 추출물을 실리카겔이 도포된 박층크로마토그래피(thin layer chromatography: TLC)에 치상 한 후 클로로포름과 메탄올이 95 : 5 비율로 혼합된 용매에 TLC를 전개시켰다. 이렇게 전개된 TLC를 상온에 15분간 건조 후 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P를 40μg/ml의 X-gal을 넣어준 LB한천배지에 혼합하여 준비된 TLC에 부어 굳게 하고 37℃에서 16시간 배양하였다.
그 결과 도 7에서 나타난 바와 같이, 톡소플라빈을 생성하는 세균의 TLC전개에서는 파란색으로의 변화가 있는 반면, 톡소플라빈을 생성하지 못하는 세균의 TLC 전개에서는 아무런 반응이 없는 것을 확인할 수 있었다(S1: 톡소플라빈 (20μM), 1: Pantoea ananatis 클로로포름 추출물, 2: Burkholderia glumae 클로로포름 추출물).
< 실험예 3>
본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 이용한 톡소플라빈 정량 분석
본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P를 이용하여 톡소플라빈 유무를 확인할 수 있음은 상기 실험예 2를 통해 확인하였으므로, 본 실험에서는 또한 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주를 이용하여 톡소플라빈 양의 정량분석을 실시하였다.
정량분석은 베타갈락토시다아제 에세이(β-galactosidase assay)를 통해 본 발명의 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주에서 톡소플라빈의 첨가량에 따른 베타갈락토시다아제 활성(β-galactosidase activity)을 조사하는 방식으로 진행하였다.
그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, 베타갈락토시다아제 활성에 따른 톡소플라빈의 양을 정량할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
농업생명공학연구원 KACC91692P 20111212
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. toxA 유전자 절편과 lacZ 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 toxA 유전자 절편은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 개열지도 1로 표시되는 pCOK71 벡터인 것을 특징으로 하는 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터로 형질 전환된 균주는 톡소플라빈을 생산할 수 없는 균주로서, 외부에서 톡소플라빈이 유입되면 베타갈락토시다아제(β-galactosidase) 활성을 가지게 되는 것을 특징으로 하는 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주 벌크홀데리아 글루메 COK71(Burkholderia glumae COK71) KACC91692P.
  5. (a) 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 toxA 유전자 절편을 증폭하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계를 통해 증폭된 toxA 유전자 절편을 lacZ 유전자를 포함하는 플라스미드에 클로닝하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 제조된 벡터를 균주에 도입하는 단계를 포함하는 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 toxA 유전자 절편은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 톡소플라빈 검출용 바이오센서 균주의 제조방법.
  7. 제1항의 바이오센서 균주를 톡소플라빈에 노출시키고, 베타갈락토시다아제(β-galactosidase)의 활성 값을 측정하는 단계를 포함하는 톡소플라빈 검출방법.
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