KR102173230B1

KR102173230B1 - 톡소플라빈 분해 유전자를 이용한 병저항성작물, 식물형질전환용 벡터 및 그 이용 방법

Info

Publication number: KR102173230B1
Application number: KR1020180060091A
Authority: KR
Inventors: 김진우; 최옥희; 김민철; 전현진
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2018-05-28
Publication date: 2020-11-03
Also published as: WO2019231177A1; KR20190135088A

Abstract

본 발명은 톡소플라빈 분해 유전자를 이용한 병저항성작물, 식물형질전환용 벡터 및 그 이용 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 톡소플라빈을 분해하는 유전자를 식물체에 도입하여 벼알마름병과 밭작물시들음병에 대한 저항성 작물을 개발하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 톡소플라빈 분해 유전자를 포함하는 벡터는 톡소플라빈 저항성을 가지는 식물체 제작에 활용될 수 있으며, 본 발명의 벡터를 이용하여 형질전환된 식물체는 질병을 야기하는 톡소플라빈 저항성을 가지고 있기 때문에, 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)에 의한 벼알마름병과 밭작물시들음병의 저항성을 증진시키기 위해 활용될 수 있다.

Description

톡소플라빈 분해 유전자를 이용한 병저항성작물, 식물형질전환용 벡터 및 그 이용 방법{Method of toxoflavin-degrading gene for disease-resistance crops and plant transformation vectors}

본 발명은 톡소플라빈 분해 유전자를 이용한 병저항성작물, 식물형질전환용 벡터 및 그 이용 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 톡소플라빈을 분해하는 유전자를 식물체에 도입하여 벼알마름병과 밭작물시들음병에 대한 저항성 작물을 개발하는 것에 관한 것이다.

일반적으로 벼알마름병과 밭작물시들음병은 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)에 의해 일어나는 벼 병으로서, 대한민국, 일본 동남아시아를 비롯해서 벼 재배 지역에서 중요시되는 병으로 기후변화에 매우 민감한 병이다.

버크홀데리아 글루메는 벼알마름병과 밭작물시들음병을 일으키는 병원성 성분인 톡소플라빈을 분비하는 것으로 보고되고 있다. 이러한 버크홀데리아 글루메의 톡소플라빈을 분해하는 유전자 및 이 저항성이 있는 식물체에 대하여 다양한 개발이 이루어지고 있다.

따라서 본 발명자들은 놀랍게도 톡소플라빈(toxoflavin) 분해 유전자를 이용하여 버트홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)에 의한 벼알마름병과 밭작물시들음 병에 대한 저항성 작물을 개발하던 중, 톡소플라빈 분해능이 우수한 세균인 스핑고모나스 어드헤시바(Sphingomonas adhaesiva)와 애그로박테리움 에스피(Agrobacterium sp.)를 분리하였고, 변이체 선발을 통해 톡소플라빈 분해 유전자를 분리하였다. 또한, 이 톡소플라빈 분해 유전자를 과발현 시킨 StdA 단백질을 통해, pH8.0과 30℃에서 가장 높은 톡소플라빈 분해능을 검정하였으며, StdA 유전자로 형질전환된 작물 톡소플라빈 저항성을 나타내고, toxoflavin-stdA를 이용한 형질전환용 벡터에도 활용 가능성을 검정하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 톡소플라빈 분해 유전자 StdA를 이용한 병저항성 작물을 포함하는 식물형질전환용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 톡소플라빈 분해 유전자 StdA를 이용하여 형질전환 식물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 톡소플라빈 분해 유전자 StdA를 이용하여 형질전환된 식물을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일 실시예는 서열번호 1 로 표시되는 염기서열을 포함하는, 식물형질전환 벡터를 제공한다.

여기서, 상기 서열번호 1은 스핑고모나스 어드헤시바(Sphingomonas adhaesiva) 또는 애그로박테리움 에스피(Agrobacterium sp.)로부터 유래된 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 서열번호 1은 톡소플라빈 분해 단백질 StdA을 암호화한 것이다.

또한, 상기 벡터는 StdA 단백질 과발현용 인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 서열번호 1의 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 StdA 단백질을 암호화하는 것이다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따르면 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벡터로 형질전환되고, 식물체 내에서 톡소플라빈 저항성을 가지는 형질전환 식물을 제공한다.

여기서 상기 형질전환 식물은 벼 또는 애기장대 인 것을 특징으로 한다.

또한, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벡터로 형질전환되고, 식물체 내에서 톡소플라빈 저항성을 가지는 형질전환 식물 종자를 제공한다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따르면 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 형질전환 식물 제조 방법을 제공한다.

전술한 바와 같은 본 발명에 따르면, 본 발명의 StdA 유전자를 포함하는 벡터는 톡소플라빈 저항성을 가지는 식물체 제작에 활용될 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 이용하여 형질전환된 식물체는 질병을 야기하는 톡소플라빈 저항성을 가지고 있기 때문에, 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)에 의한 벼알마름병과 밭작물시들음병의 저항성을 증진시키기 위해 활용될 수 있다.

이상에서의 본 발명에 따른 효과는 상기에 한정되는 것은 아니며, 기타 본 발명의 효과들은 후술할 실시예 및 청구범위에 기재된 사항을 통하여 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 분명하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 야생형 스핑고모나스 어드헤시바 SG14와 애그로박테리움 에스피 및 stdA 유전자 돌연변이체를 LB한천 플레이트 또는 AB broth 배지 + 톡소플라빈 40 μg / ml에서의 생존능을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 StdA 염기 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 StdA 아미노산 서열과 다른 톡소플라빈 저항성을 갖는 산화효소들을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 StdA와 이전에 보고된 다른 톡소플라빈 저항성 산화효소들과의 상동트리를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 StdA-His 단백질의 정제를 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 StdA-His의 최적 활성 조건을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 톡소플라빈 분해 활성 비교결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 StdA에서 단일 아미노산 치환된 돌연변이들의 톡소플라빈 분해 활성 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 벡터 제작, 형질전환 벼 및 애기장대의 톡소플라빈 저항성 확인 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.

이에 본 발명자들은 톡소플라빈(toxoflavin) 분해 유전자를 이용하여 버트홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)에 의한 벼알마름병과 밭작물시들음 병에 대한 저항성 작물을 개발하던 중, 톡소플라빈 분해능이 우수한 세균인 스핑고모나스 어드헤시바(Sphingomonas adhaesiva)와 애그로박테리움 에스피(Agrobacterium sp.)를 분리하였고, 변이체 선발을 통해 톡소플라빈 분해 유전자를 분리하였다. 또한, 이 톡소플라빈 분해 유전자를 과발현 시킨 StdA 단백질을 통해, pH8.0과 30℃에서 가장 높은 톡소플라빈 분해능을 검정하였으며, StdA 유전자로 형질전환된 작물 톡소플라빈 저항성을 나타내고, 다른 톡소플라빈 분해능을 가진 유전자를 대체하여 toxoflavin-stdA를 이용한 형질전환용 벡터에 활용할 수 있음을 확인하였다.

구체적으로 본 발명의 일 실시예는 서열번호 1 로 표시되는 염기서열을 포함하는, 식물형질전환 벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용하는 용어 “벡터”는 식물에서 유전자 침묵을 유도하거나, 유전자의 발현을 유도하기 위한 뉴클레오티드 단편을 식물로 운반하기 위한 역할을 수행하는 것으로, 본 발명의 벡터는 스핑고모나스 어드헤시바(Sphingomonas adhaesiva) 또는 애그로박테리움 에스피(Agrobacterium sp.)로부터 유래된 서열번호 1의 염기서열을 포함한다.

또한, 본 발명의 벡터는 톡소플라빈 분해 단백질 StdA를 생산하는 서열번호 1의 염기서열을 포함한다.

여기서 본 발명의 벡터는 발현시킬 톡소플라빈 분해 단백질 StdA을 코딩하는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열이 클로닝될 수 있는 하나 이상의 제한효소 인식 뉴클레오티드 서열인 다중클로닝자리(multiple cloning site, MCS)이 포함된다. 상기 제한효소로는 Eag I, EcoR I, EcoR Ⅱ, BamH Ⅰ, Bgl Ⅱ, BstB Ⅰ, Hind Ⅲ, Taq Ⅰ, Not Ⅰ, Hinf Ⅰ, Sau3A, Pac I, Pov Ⅱ, Sma I, Hae Ⅲ, Hga I, Alu I, EcoR V, EcoP15 I, Kpn I, Pst I, Sac I, Sal I, Sca I, Spe I, Sph I, Stu I, Xba I, Xho I 중에 적어도 하나 이상을 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 Kpn I 및 BamH Ⅰ인 것이 바람직하다.

본 발명의 벡터는 톡소플라빈 분해 단백질 StdA의 정제를 용이하게 하기 위해 다른 서열과 추가적으로 융합될 수 있으며, 또 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119 등), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5 등), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50 등) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드가 있고, 식물 바이러스 벡터가 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수 있다. 그러나 당업자라면 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다. 본 발명에서는 pET21b나 pCAMBIA1300PT와, 35S CaMV 프로모터를 이용하여 과발현용으로 활용될 수 있다.

본 발명에서 서열번호 1의 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 StdA 단백질을 암호화하는 것으로, 서열번호 1을 포함하는 벡터를 식물에 도입하여 형질전환시킨후 이를 발현시켜 서열번호 2로 표시되는 StdA 단백질을 생산할 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벡터로 형질전환되고, 식물체 내에서 톡소플라빈 저항성을 가지는 형질전환 식물을 제공한다.

본 발명에 따른 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수 중에서 선택되는 식량작물류이거나, 이개장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근 중에서 선택되는 최소작물, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채 중에서 선택되는 특용작물일 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 애기장대, 담배, 벼 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 벼이다.

또한, 본 발명의 일실시예에 따르면 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 벡터로 형질전환되고, 식물체 내에서 톡소플라빈 저항성을 가지는 형질전환 식물 종자를 제공한다. 본 발명의 식물 종자는 배추, 애기장대, 보리, 옥수수, 완두, 기장, 해바라기 또는 밀 중에 선택되는 하나 일 수 있으며, 바람직하게는 애기장대일 수 있다.

또한, 본 발명의 일실시예에 따르면 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 형질전환 식물 제조 방법을 제공한다. 상기 벡터를 포함하는 식물 또는 식물체를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 배양은 식물 또는 식물 종자를 적당히 인공적으로 조절환 환경조건에서 생육시키는 것을 의미하며, 상기 식물 또는 식물 종자는 통상의 배지에서 생육가능하다. 배지는 특정 식물을 배양하기 위한 영양물질을 포함하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화 하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.

<실시예 1> 톡소플라빈 분해활성 세균 분리 및 동정

톡소플라빈 분해활성 세균을 분리하기 위해, 건전한 볍씨종자로부터 세균을 분리하였고, 일반적으로 사용하는 AB 영양최소배지(AB minimal medium)(Chilton et al., 1974, Proc Natl Acad Sci USA 71: 3672-3676)에 톡소플라빈 40 μg/ml을 첨가한 후, 분리한 세균을 28°C에서 배양하였다. 2일간 배양후 톡소플라빈이 첨가된 배지에서 자라는 세균의 콜로니는 얻었다.

톡소플라빈 저항성 세균의 동정을 위해, 일반적으로 세균의 분자 동정에 사용하는 프라이머를 이용하여 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열은 NCBI BLAST분석에서 SG14균주는 스핑고모나스 어드헤시바(Sphingomonas adhaesiva)와 99% 상동성을 보였다. MALDI-TOF 분석을 통한 세균 동정(Seng et al., 2009, Clin Infect Dis 49: 543-551)에서도 데이터베이스 스코어가 2.2에 해당되며 species-level에 해당하는 높은 상동성을 보였다. 따라서 SG14 세균을 스핑고모나스 어드헤시바 SG14(Sphingomonas adhaesiva SG14)로 동정하였다. AL14-1균주는 애그로박테리움 에스피(Agrobacterium sp.)와 99% 상동성을 보였고 MALDI-TOF 분석을 통한 세균 동정에서는 데이터베이스 스코어 1.6에 해당되었다. 따라서 AL14-1 세균을 애그로박테리움 에스피(Agrobacterium sp. AL14-1)로 동정하였다.

<실시예 2> 스핑고모나스 어드헤시바( Sphingomonas adhaesiva )와 애그로박테리움 에스피( Agrobacterium sp.)로부터 톡소플라빈 분해 유전자 분리 및 동정

상기 실시예 1에서 동정한 스핑고모나스 어드헤시바(Sphingomonas adhaesiva SG14)와 애그로박테리움 에스피(Agrobacterium sp. AL14-1)로부터 톡소플라빈 분해 유전자를 분리하기 위해, Mariner transposon을 이용하여 분해 활성이 없어진 변이체를 유도하였다. 변이체 선발에 사용한 transposon을 이용한 변이체 유도는 일반적으로 사용하는 방법에 따랐다(Rubin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96: 1645-1650).

변이체 유도 후 톡소플라빈이 40 μg/ml 첨가된 배지에서 자라지 못하는 변이체를 선발하였다(도 1).

도 1은 본 발명의 야생형 스핑고모나스 어드헤시바 SG14 및 stdA 유전자 돌연변이체, 애그로박테리움 에스피(Agrobacterium sp. AL14-1) 및 stdA 유전자 돌연변이체를 LB한천 플레이트 또는 AB broth 배지 + 톡소플라빈 40 μg / ml에서의 생존능을 확인한 결과이다. Bacterial cells을 24 시간 동안 성장시킨 결과, stdA 유전자가 톡소플라빈 분해효소를 암호화하는 주요 유전자임을 보여주었다.

톡소플라빈 분해 활성이 없어진 변이체로부터 transposon이 삽입된 부위를 포함하여 주변 유전자 염기서열을 분석하였고, 하나의 ORF가 분해 활성을 갖고 있다는 것을 확인하였다. 462 bp크기의 톡소플라빈 분해활성을 갖는 유전자를 stdA로 명명하였고, 그 유전자 염기 서열과 154개의 아미노산 서열을 도 2에 표시하였다(도 2).

<실시예 3> StdA 효소 상동성 분석

상기 실시예 2의 StdA 단백질을 DNAMAN(Lynnon Co., Quebec, Canada) 프로그램을 이용하여 아미노산 상동성 분석을 하였다. StdA 단백질은 Pseudomonas protegens Pf-5에서 분리한 톡소플라빈 저항성 단백질인 ToxM, Paenibacillus polymyxa JH2의 톡소플라빈 분해 효소 TflA, Exiguobacterium sibiricum의 dioxygenase/glyoxalase, Bacillus halodurans의 CatE, Geobacillus genomosp. 3의 HpaD, Sphingopyxis macrogoltabida의 ThnC, 그리고 Paraburkholderia xenovorans의 BphC와 상동성을 보였고(도 3), DNAMAN 프로그램을 이용하여, 상동성 트리를 완성하였다(도 4).

<실시예 4> StdA 단백질 과발현 및 분리정제

StdA 단백질의 과발현은 일반적으로 대장균에서 사용하는 단백질 과발현 방법을 따랐다(Koh et al., 2011, Plant Biotech J 9: 348-358). 2개의 프라이머 StdAN(5′-GGCCATATGATCCGGTCGTCCGAAACA-3′)과 StdAXo(5′-GGCCTCGAGTGTTATAGACGACACTTCGAG-3′)를 이용하여 stdA 유전자를 증폭하였고, PCR 산물을 pET21b(Novagen)에 클로닝하여 플라스미드 pCOK393을 완성하였다. 그리고 대장균 BL21(DE3)에 옮겨 1 mM IPTG로 과발현하였다. 과발현된 단백질은 Ni-NTA Spin Column(QIAGEN, Valencia, CA, USA)을 이용하여 분리 정제하였다. Ni-NTA Spin Column을 통해 분리한 단백질은 acrylamide 단백질 전기영동으로 확인하였다(도 5). 분리한 단백질은 50 mM sodium phosphate buffer(pH8.0)에서 투석하였고 단백질의 정량은 일반적으로 사용하는 Bradford 방법에 따랐다(Bradford, 1976, Anal Biochem 72: 248-254).

<실시예 5> StdA 단백질의 톡소플라빈 분해활성 검정

StdA-His의 톡소플라빈 분해활성 검정은 Koh등이 사용한 방법을 따랐다(Koh et al., 2011, Plant Biotech J 9: 348-358). pH 범위는 4.5에서 10까지 검정하였고 온도 범위은 15도에서 50도까지 실시하였다. StdA-His(3 μM) 효소활성은, 5 mM DTT, 100 μM toxoflavin을 첨가한 50 mM sodium phosphate buffer(pH 8.0)에서 실시하였고 28°C에서 10분간 처리하였다. 효소활성의 종료는 400 μl 클로로포름을 첨가하여 종료하였다. 클로로포름 추출층을 분리하여 건조하였고 10 μl 메탄올을 첨가하여 남아있는 톡소플라빈을 녹여 silica gel 60 TLC plate(Merck, Kenilworth, NJ, USA)에 전개하였고(클로로포름:메탄올=95:5=v:v), 톡소플라빈 잔량을 UV 254 nm 또는 365 nm에서 확인하였다(Kim et al., 2004, Mol Microbiol 54: 921-934; Koh et al., 2011, Plant Biotech J 9: 348-358). StdA-His 효소활성은 pH 8.0과 28°C에서 가장 높았고 specific activity와 KM 값은 각각 0.329 μmol/min/mg과 64.98 μM이었다(도 6). 특히, extradiol dioxygenase의 경우는 금속이온 의존성인 것에 비해 StdA는 톡소플라빈 분해활성을 나타내는데 금속이온을 필요로 하지 않고, 유사 효소들처럼 DTT를 필요로 하였다(도 7).

<실시예 6> StdA 단백질의 톡소플라빈 분해 활성을 갖는 주요 아미노산 잔기(residue) 분석

StdA 단백질의 톡소플라빈 분해 활성을 나타내는 주요 아미노산 residue 분석은 Kim 등이 사용한 error-prone PCR을 이용하였다(Kim et al., 2009, J Bacteriol 191: 4870-4878). stdA 유전자 염기치환을 위해, 단백질 과발현에 사용한 플라스미드 pCOK393를 주형으로 하였고, 2개의 프라이머로 T7 promoter(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')와 T7 terminator(5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')를 사용하였다. error-prone PCR 산물은 pGEM-T Easy(Promega, 클로닝 벡터)에 클로닝하였다. Transformant들을 톡소플라빈 40 μg/ml을 첨가한 LB 배지에 도말하였고 톡소플라빈에 감수성 콜로니를 선발하였다. 염기치환에 의한 유전자 변이부위는 DNA 염기서열 분석으로 확인하였다. 염기치환에 의한 StdA 단백질 missense 변이체들의 아미노산 잔기를 도 8에 표시하였다. 7개의 아미노산 잔기(F27, L34, R40, A53, L63, P113, 그리고 L128)가 톡소플라빈 분해활성에 중요한 잔기임을 확인하였다.

<실시예 7> 형질전환용 클로닝 벡터제작, 톡소플라빈 저항성 벼 및 톡소플라빈/StdA 마커 개발

StdA 유전자 코딩 부위를 2개의 프라이머, StdAKn(5′-GGCGGTACCATGATCCGGTCGTCCGAAACA-3′)와 StdABm(5′-GGCGGATCCTCATGTTATAGACGACACTTC-3′)를 이용하여 증폭하였고, DNA 염기서열 분석으로 검정하였다. 제한효소 KpnI/BamHI fragment를 pCAMBIA1300PT(multi)에 클로닝하여 플라스미드 pBS43를 완성하였다(도 9a). 플라스미드 pBS43를 Agrobacterium tumefaciens GV3101균주에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 형질전환하였다.

벼 형질전환에 동진벼 품종을 사용하였고, 동진벼 형질전환은 일반적으로 사용하는 벼 형질전환 방법에 따라 수행하였다(Koh et al., 2011, Plant Biotech J 9: 348-358). 동진벼와 T₁-transgenic 동진벼 잎 디스크를 톡소플라빈을 첨가한 멸균수에 넣고 빛을 조사하면서 시간 경과에 따른 변화를 확인하였다. 동진벼 잎은 톡소플라빈 10-20 μg/ml에서 고사되는 것을 확인하였지만, stdA 유전자 형질전환된 T₁-transgenic 동진벼 잎은 톡소플라빈에 저항성을 보였다(도 9b).

애기장대(Col-0) 형질전환은 일반적으로 사용하는 애기장대 화기감염법에 따랐다(Zhang et al., 2006, Nat Protoc 1: 641-646). 플라스미드 pBS43(pCAMBIA 1300PT::stdA)를 가진 A. tumefaciens GV3101 균주 현탁액에 애기장대 꽃을 담그는 방법이다. 형질전환 Transgenic T₁종자를 수확하였고 톡소플라빈 저항성 검정을 위해, 식물조직배양이 흔히 사용하는 0.5× MS 배지 (Murashige and Skoog, 1962, Physiol Plant 15: 473-497)에 StdA 형질전환 Transgenic T₁종자를 펼쳐 종자발아를 유도하였다. 빛을 조사하면서 7일후 애기장대의 발아와 발근 유무로 톡소플라빈 저항성을 확인하였다.

무처리구(1% sucrose)에서 애기장대 종자의 발아와 발근이 양호하였다. Hygromycin(25 μg/ml) 처리구에서 비형질전환 종자들도 어느 정도 발아가 진행되었고 발근은 양호하지 못하였지만, 형질전환된 종자의 경우는 발아 및 발근이 양호하였다. 톡소플라빈(10 μg/ml) 처리구에서 비형질전환된 종자들은 발아조차하지 못하였고 형질전환된 종자들은 발아하여 점차 성장하였다(도 9c).Toxoflavin/stdA과 Hyg/hpt 마크를 사용하여 애기장대 형질전환율을 확인하였고, 이때 사용한 애기장대 T₁종자의 개수는 각각 2,910개와 2,718개였으며 형질전환 효율은 각각 0.6%와 0.8%로 나타났다.

상기한 결과를 토대로, 본 발명의 StdA 유전자를 포함하는 벡터는 톡소플라빈 저항성을 가지는 식물체 제작에 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 이용하여 형질전환된 식물체는 질병을 야기하는 톡소플라빈 저항성을 가지고 있기 때문에, 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)에 의한 벼알마름병과 밭작물시들음병의 저항성을 증진시키기 위해 활용될 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 톡소플라빈 분해 유전자를 이용한 병저항성작물, 식물형질전환용 벡터 및 그 이용 방법은 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Method of toxoflavin-degrading gene for disease-resistance crops and plant transformation vectors <130> PN1803-110 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S. adhaesiva SG14, Agrobacterium sp. AL14-1 -stdA <400> 1 atgatccggt cgtccgaaac agatctagga ttgtcccacg tagcgctggt cgtgcgcgat 60 ctcgataaga gcatcgcctt ctatcaggag tttgccgatc ttcaggtaat tcatcgccga 120 actgcgggcg gtgatatcga agaggtcgcg tggatggcgg atggctcgcg cccgttcgcg 180 cttgtcctcg ttgcatctac gaatttgaat gatacgccac tcggaccatt cggtcacata 240 ggcattgcgt gtgccaagcc gggagatgtc tcgcgccgtg cggccgaagc tgagcgccgc 300 ggcatcctgc ggtctgcccc gcgcaatgat gggccgccgg tcggcctctg gacgtatatc 360 tctgacccgg atggcaacac gcttgaattg tcgttcgggc aggaaatagc attcagtatc 420 ggcagtggcg acgatgctct cgaagtgtcg tctataacat ga 462 <210> 2 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S. adhaesiva SG14, Agrobacterium sp. AL14-1 -stdA <400> 2 Met Ile Arg Ser Ser Glu Thr Asp Leu Gly Leu Ser His Val Ala Leu 1 5 10 15 Val Val Arg Asp Leu Asp Lys Ser Ile Ala Phe Tyr Gln Glu Phe Ala 20 25 30 Asp Leu Gln Val Ile His Arg Arg Thr Ala Gly Gly Asp Ile Glu Glu 35 40 45 Val Ala Trp Met Ala Asp Gly Ser Arg Pro Phe Ala Leu Val Leu Val 50 55 60 Ala Ser Thr Asn Leu Asn Asp Thr Pro Leu Gly Pro Phe Gly His Ile 65 70 75 80 Gly Ile Ala Cys Ala Lys Pro Gly Asp Val Ser Arg Arg Ala Ala Glu 85 90 95 Ala Glu Arg Arg Gly Ile Leu Arg Ser Ala Pro Arg Asn Asp Gly Pro 100 105 110 Pro Val Gly Leu Trp Thr Tyr Ile Ser Asp Pro Asp Gly Asn Thr Leu 115 120 125 Glu Leu Ser Phe Gly Gln Glu Ile Ala Phe Ser Ile Gly Ser Gly Asp 130 135 140 Asp Ala Leu Glu Val Ser Ser Ile Thr 145 150

Claims

서열번호 1 로 표시되는 염기서열을 포함하는, 식물 형질전환용 벡터.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1은 스핑고모나스 어드헤시바(Sphingomonas adhaesiva) 또는 애그로박테리움 에스피(Agrobacterium sp.)로부터 유래된 것인, 벡터.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1은 톡소플라빈 분해 단백질 StdA를 생산하는 것인, 벡터.
제1항에 있어서,
상기 벡터는 StdA 단백질 과발현용 인 것을 특징으로 하는, 벡터.
제1항에 있어서,
상기 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 StdA 단백질을 암호화하는 것인, 벡터.
제1항 내지 5항 중에 어느 한 항의 벡터로 형질전환되고, 식물체 내에서 톡소플라빈 저항성을 가지는, 형질전환 식물.
제6항에 있어서,
상기 형질전환 식물은 벼 또는 애기장대 인 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물.
1항 내지 5항 중에 어느 한 항의 벡터로 형질전환되고, 식물체 내에서 톡소플라빈 저항성을 가지는, 형질전환 식물 종자.
서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 형질전환 식물 제조 방법.