KR101889417B1 - 벼 줄무늬잎마름병 저항성 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

벼 줄무늬잎마름병 저항성 분자마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 상기 분자마커를 검출하는, 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별용 조성물, 벼 품종 선별용 키트 및 상기 분자마커를 검출하는 단계를 포함하는 벼 품종 선별 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 다형성 분자마커 Sid2는 Stv-b 유전자를 포함하는 벼 줄무늬잎마름병(RSVD) 저항성 품종의 판별에 사용될 수 있으므로, RSVD 저항성 품종의 다양화를 위한 중간모본의 육성 및 품종개발에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

벼 줄무늬잎마름병 저항성 분자마커 및 이의 용도 {Molecular marker for rice stripe virus disease resistance and uses thereof}
본 발명은 벼 줄무늬잎마름병 저항성 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 상기 분자마커를 검출하는, 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별용 조성물, 벼 품종 선별용 키트 및 상기 분자마커를 검출하는 단계를 포함하는 벼 품종 선별 방법에 관한 것이다.
벼줄무늬잎마름병(Rice stripe virus disease; RSVD)은 벼줄무늬바이러스 (Rice stripe virus; RSV)에 의해 발생되며, 그 증상은 잎이 완전히 펴지지 않고 비틀린 채로 말리거나 실처럼 늘어지는 특징을 나타내며, 이삭은 기형으로 되어 충실한 종자를 형성하지 못하게 한다. 주로 매개충인 애멸구에 의하여 전염되며, 성충이 보독충이면 그 유충도 바이러스를 가지고 태어나는 경란전염(transvarial passage)을 한다. 벼의 생육기에 따라 모판 말기인 7엽기까지 감염이 되며, 9엽기까지는 50% 정도가 고사된다. 그러나, 상술한 애멸구의 감염은 벼 품종에 따라 차이를 보이는데, 예로 추청벼, 일품벼, 농안벼, 봉광벼 등 감수성 품종에서는 발병률이 상대적으로 높은 반면, 주남벼, 화성벼, 대안벼 등 저항성 품종에서는 낮은 발병률을 보이거나 발병이 되지 않는다.
RSV의 매개충인 애멸구(Laodelphax striatellus Fallen; small brown planthopper)는 한국, 일본, 중국 등의 동아시아의 온대지역에서 가장 많은 피해를 야기하며(Chung, 1974; Toriyama, 1995), 특히 자포니카 벼에 대하여 치명적으로 작용한다고 알려져 있다(Falk and Tsai, 1998). 우리나라의 경우, 1964년과 1965년 경북과 전북 남부지방에서 애멸구에 의한 RSVD이 발생하여 수확량의 약 40% 가량이 피해를 입었다고 한다(Chung et al., 1971). 이후 2000년까지는 병 저항성인 다수계 품종의 재배면적 확대로 RSVD의 발생은 거의 없었다(Kim, 2002). 그러나, 2000년 말부터 지구 온난화 현상으로 인한 바이러스 매개충의 월동조건이 호전되고 애멸구의 서식조건이 양호해져 바이러스병의 발병 위험은 점점 증가되고 있으며, 중국에서 비래(flying) 애멸구가 대량으로 국내에 유입되어, 서해안 지역을 중심으로 매년 심각한 피해를 입고 있다.
이에 대한 방제 대책으로서, 화학적 방제법과 경종적 방제법이 사용될 수 있다. 다만, 살충제를 사용하는 화학적 방제법은 한정된 지역에만 살포되어 큰 효과를 나타낼 수 없으며, 애멸구의 천적도 함께 사멸됨과 동시에, 약제 저항성을 가진 해충이 나타날 수 있는 문제점이 있다(Tanaka et al., 2000). 반면에, 경종적 방제법(cultural control)은 논둑 잡초 및 중간 기주 제거, 이양시기를 조절함으로써 병을 회피할 수 있으나, 경제적 및 시간적 부담이 큰 것이 단점이었다. 이에 따라, 가장 경제적이고 친환경적인 방법으로서, RSV 저항성 품종을 개발하여 육성하는 것이 새롭게 주목받고 있다. 그러나 저항성 품종을 육성하고자 할 때 전통적인 육종 방법은 유용 유전자원도입을 위해서 대량의 유전자원 또는 계통을 생물검정을 통해 저항성 여부를 판단하여야 하므로 저항성 품종을 개발하기까지는 오랜 시간과 노력이 동반되어야 한다. 또한 저항성 검정에 있어서 온도, 광량, 습도, 식물체의 생육정도 등 각종 검정조건에 따라 해충에 저항성의 정도가 달라 저항성 품종을 선발하는 데 어려움이 있어 가장 효율적인 검정방법인 분자표지방법이 매우 필요한 실정이다.
이와 관련하여, 국내 및 일본에서 재배되고 있는 대부분의 RSVD 저항성 품종은 Stv-bi 유전자를 가지고 있으며, 미국 자포니카 벼품종인 '제니스(Zenith)'도 Stv-a 및 Stv-b 유전자를 보유하여 RSVD 저항성을 나타낸다고 알려져 있음에 따라(Maeda et al., 2004, Breed Sci. 54, 19-26.), 6번 염색체에 위치하는 'Stv-a', 11번 염색체에 위치하는 'Stv-b' 및 이의 복대립 유전자형인 'Stv-bi' 등의 RSVD 저항성 유전자(Hayano-Saito et al., 2000, Theor. Appl. Genet. 101, 59-63.; Washio et al., 1968, Jpn. J. Breed. 18, 167-172)가 RSVD에 대한 저항성 분자마커의 개발에 사용되고 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 RSVD 저항성 벼 품종의 육성에 사용될 분자마커를 개발하기 위하여, 미국 자포니카 품종의 '제니스'의 형질을 RSVD에 감수성인 자포니카 품종의 '일품'에 도입한 벼 집단을 이용하여 Stv-b 유전자의 QTL을 탐색하였고, 그 결과 11번 염색체에 QTL이 존재하며, 이에 포함된 다형성 마커를 RSVD 저항성 여부 판별에 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는, 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는, 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태로서, 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는, 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "벼줄무늬잎마름병"(Rice stripe virus disease; RSVD)은 벼의 잎이 비틀린 채로 말리거나 실처럼 늘어지는 특징을 나타내는 병을 의미한다. 애멸구를 매개충으로 하여 벼줄무늬바이러스(Rice stripe virus, RSV)에 감염됨으로써 병이 진행되는데, 벼의 생육기에 따라 모판 말기인 7엽기까지 감염이 되며, 9엽기까지는 50% 정도가 고사된다.
본 발명의 용어, "벼줄무늬잎마름병 저항성"은 RSV에 감염되어도 건강한 표현형을 나타내는, RSV 또는 RSVD에 내성을 갖는 것을 의미한다. 벼 품종에 따라 RSVD에 대한 저항성 또는 감수성의 정도가 다르며, 구체적인 예로, 추청, 일품, 농안, 봉광 등은 RSVD 감수성 품종; 주남, 화성, 대안, 제니스 등은 RSVD 저항성 품종으로 구분된다. 일반적으로, 상술한 RSVD 저항성 품종은 RSVD 저항성 유전자인 Stv-a, Stv-b 또는 Stv-bi 유전자를 보유하고 있음이 알려져 있다.
본 발명의 조성물은 Stv-b 유전자를 포함하는 RSVD 저항성 품종을 선별하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "Stv-b 유전자"는 RSVD 저항성을 부여하는 유전자를 의미하며, 벼(Oryza sativa)의 11번 염색체에 위치하고 있다고 알려져 있다.
또한, 상기 조성물은 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 상기 프라이머 쌍은 Sid2 마커의 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 단편을 검출하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "Sid 마커"는 Stripe virus Insertion-deletion marker로서, RSVD의 감수성/저항성과 관련된 DNA 상에서 염기가 삽입 또는 결실됨으로써, 염기 서열에 나타나는 다형성(polymorphisms)을 의미한다. 본 명세서에서, 상기 "Sid 마커"는 "Sid 다형성 마커"와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 Sid 마커는 RSVD 저항성과 관련한 양적형질 유전자좌의 위치를 확인하는데 사용될 수 있으며, 또한 RSVD의 저항성 판별에 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 Sid 마커는 Sid2 마커일 수 있다. 본 발명자들은, 본 발명에 사용한 Sid1 내지 Sid124로 구성된 124개의 Sid 마커 중에서, Sid2 마커만이 RSVD 저항성 품종의 판별용 분자마커로 사용될 수 있음을 확인하였다(도 7 내지 9).
본 발명의 용어, "양적형질 유전자좌(quantitative trait loci; QTL)"는 표현형의 변이(양적 형질)와 관련된 DNA 영역을 의미하며, 또한 유전적으로 분명한 교배 집단에서 다양한 표현형을 나타내는 유전자가 존재하는 염색체상의 위치를 의미할 수도 있다. QTL을 통해 형질에 관여하는 염색체의 특정부분을 확인함으로써, 양적형질 유전자좌와 환경과의 상호작용, 그리고 양적형질 유전자좌와 유전적인 배경과의 상호작용 등 주요 농업형질의 유전적 배경에 대한 전반적이고 직접적인 정보를 얻을 수 있다.
본 발명의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고, 주형의 복제를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 이용되는 염기서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
따라서, 상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열과 높은 상동성을 갖는 염기서열, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90% 이상의 높은 상동성을 갖는 염기서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 일 실시예에서는, RSVD 저항성 품종인 '제니스(Zenith)'와 감수성 품종인 '일품'이 교배된 집단을 대상으로, 공지된 1168개의 SSR 마커 및 11개의 Indel 마커; 및 124개의 Sid 마커를 사용하여 RSVD 저항성과 관련한 유전자 지도를 작성하고, 이의 QTL를 분석한 결과, 11번 염색체에 RSVD 저항성 QTL(qRSV11Z)이 존재함을 확인하였다(도 4 내지 6). 또한, qSTV11Z 내 포함된 RSVD 저항성 유전자(Stv-b)와 이의 복대립 유전자(Stv-bi)를 Sid2 다형성 마커가 용이하게 구분할 수 있음을 확인하였다(도 7). 아울러, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍을 이용하여 제니스/일품 교배 집단의 Sid2 마커를 검출한 결과, RSVD 저항성 품종인 제니스와 동일한 유전형을 나타낸 집단들은 RSV 감염 시에도 모두 건강한 표현형을 나타냄을 확인하여(도 8), Sid2 마커는 Stv-b 유전자를 포함하는 RSVD 저항성 품종의 판별용 분자마커로 사용될 수 있음을 확인하였다.
이는, 본 발명의 조성물은 상기 Sid2 마커를 검출할 수 있는 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍을 포함하므로, Stv-b 유전자를 포함하는 RSVD 저항성 품종의 선별에 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
다른 하나의 양태로서, 상기 조성물을 포함하는, 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별 키트를 제공한다.
이때, 상기 "벼 줄무늬잎마름병 저항성"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는, 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍; 제한효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 또한 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로서 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응완충액을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 키트는 Sid2 마커의 전사부위를 탐지하기 위한 RT-PCR의 필수 요소를 포함할 수 있다. 상기 요소의 구체적인 예로, Sid2 마커에 특이적인 각각의 프라이머 쌍, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), DNA 중합효소, 역전사효소, DNase 억제제, RNase 억제제, 반응완충액, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, (a) 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별 방법을 제공한다.
이때, 상기 용어 "프라이머" 및 "벼 줄무늬 잎마름병 저항성"의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 상기 표적 서열은 Sid2 마커의 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 단편일 수 있으며, 상기 증폭 산물은 Sid2 마커의 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 단편의 증폭 산물일 수 있다.
또한, 상기 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종은 Stv-b 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "시료"는 벼 줄무늬 잎마름병에 감염될 수 있는 벼의 조직을 말하며, 뿌리, 잎, 줄기 또는 화기(꽃), 이삭을 포함하는 식물체의 조직에서 유래한 모든 기관 및 세포, 캘러스, 식물 조직의 선발, 배양 및 식물체의 재분화를 위해 형질전환된 조직을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 단계 (a)는, 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계로서, 사용될 수 있는 시료의 예는 상기에서 설명한 바와 같다. 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 당업자에 의해 용이하게 변형시켜 사용할 수 있다.
상기 단계 (b)는, 단계 (a)에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, sid2 마커의 올리고뉴클레오티드 또는 그의 단편에 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행함으로써, 표적 서열을 증폭하는 단계이다. 핵산 서열의 증폭 방법은 당업계에 공지된 방법을 당업자에 의해 용이하게 변형시켜 사용할 수 있다. 구체적인 예로, 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system) 또는 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 방법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 증폭된 핵산 서열은 검출 가능한 표지물질을 추가로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 효소, 리간드, 발색물, 미소입자, 방사성 동위원소, 형광, 인광 물질로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 (c)는, 단계 (b)의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, Stv-b 유전자를 포함하는 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종을 선별하는 단계이다. 상기 증폭 산물을 검출하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 당업자에 의해 용이하게 변형시켜 사용할 수 있다. 구체적인 예로, 자동 전기영동장치(칩 및 모세관 방식포함), 아크릴아마이드 겔, 고속액체크로마토그래피(HPLC), 또는 아가로스 겔 전기영동 등의 전기영동 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 검출 방법은 상기 단계 (c)의 증폭 산물을 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가로 포함될 수 있는 상기 단계는 Stv-b 유전자를 포함하는 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종을 선별하는 단계로서, 당업계에 공지된 방법을 통해 RSVD 저항성 또는 감수성 품종과 증폭 산물의 크기를 비교하거나, 또는 증폭 산물의 서열을 비교함으로써 수행될 수 있다.
구체적으로, 증폭 산물의 크기를 비교하여 수행될 수 있으며, 상기 증폭 산물의 크기가 RSVD 감수성 벼 품종에 비하여 더 큰 경우, RSVD 저항성 벼 품종인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍을 이용하여 제니스/일품 교배 집단의 Sid2 마커를 검출한 결과, RSVD 감수성 품종보다 더 큰 증폭 산물의 크기를 나타낸 집단들은 RSV 감염 시에도 모두 건강한 표현형을 나타냄을 확인하였다(도 8 및 9).
이는, 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 Sid2 마커의 서열을 증폭하는 경우, Stv-b 유전자를 포함하는 RSVD 저항성 품종을 간편히 선별할 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명에 따른 다형성 분자마커 Sid2는 Stv-b 유전자를 포함하는 벼 줄무늬잎마름병(RSVD) 저항성 품종의 판별에 사용될 수 있으므로, RSVD 저항성 품종의 다양화를 위한 중간모본의 육성 및 품종개발에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 일품(Ilpum)/제니스(Zenith) 교배 품종에 대하여 Indel8(위)및 Indel9(아래)의 다형성 분자마커를 검출한 결과를 보여주는 이미지이다.
도 2는 일품, 제니스 또는 일품/제니스 교배 품종(F1)의 벼 줄무늬잎마름병(Rice stripe virus disease; RSVD) 저항성을 보여주는 이미지 및 그래프이다.
도 3은 일품, 제니스 또는 일품/제니스 교배 품종(F2:3)의 RSVD 저항성 생물검정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 일품/제니스 교배 품종에 대하여, 검출된 175개의 분자마커(169개의 SSR 마커 및 6개의 Indel 마커)를 보여주는 유전자 지도이다.
도 5는 일품/제니스 교배 품종의 6번 및 11번 염색체에서 분석한 QTL(Quantitative trait locus)을 보여주는 도표이다.
도 6은 일품, 제니스 또는 일품/제니스 교배 품종(643537-16, 643540-16, 6435824, 643520-10, 643520-8, 643520-6)의 염색체 내 qRSV11Z의 위치를 보여주는 이미지이다. 흰색 막대는 일품 및 흑색 막대는 제니스 품종에서 이입된 염색체를 나타낸다.
도 7은 일품, 제니스 및 신광(Shingwang) 품종에 대하여, 6개의 Sid 마커를 탐지한 결과를 보여주는 이미지이다.
도 8은 일품, 제니스 또는 일품/제니스 교배 품종(537-17, 540-16, 582-4, 582-10, 520-8, 520-6)에 대하여, Sid2 마커를 탐지한 결과를 보여주는 이미지이다.
도 9는 일품, 제니스 또는 일품/제니스 교배 품종(537-17, 540-16, 582-4, 582-10, 520-8, 520-6)의 RSVD 저항성을 보여주는 이미지이다.
이하, 본 발명의 실시예에 의하여 더욱 자세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것을 아니다.
실시예 1. 벼 줄무늬잎마름병(Rice stripe virus disease; RSVD) 저항성 생물검정을 위한 식물 재료
미국 자포니카형 품종이면서 Stv-b 유전자를 보유하여 벼 줄무늬잎마름병(Rice stripe virus disease; RSVD) 저항성 품종으로 알려진 '제니스(Zenith)'의 형질을 자포니카형 품종이면서 벼 줄무늬잎마름병 감수성 품종으로 알려진 '일품'에 도입하였다. 이후, 상기 집단으로부터 F2 종자를 전개하여 F2 세대 180 계통을 본 발명에 따른 RSVD 저항성 유전자 지도 작성에 이용하였다.
실시예 2. RSVD 저항성 생물검정 방법
실시예 2-1. RSVD 보독충 확인 방법
RSVD의 매개충으로서, '추청'을 식이품종으로 사육된 1~5령충의 애멸구 중에서 벼 줄무늬 잎마름병 바이러스(rice stripe virus; RSV)의 보독이 가능한 2~3령충의 애멸구를 RSVD 생물검정에 이용하였다. 이후, 상기 애멸구의 보독율을 확인하기 위하여, 국내에 시판중인 DAS-ELISA 키트(Amgdia, Inc., Elkhart, IN; Kisan Biotech Co., Seoul, KR)를 사용하여 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 검사를 메뉴얼에 따라 수행하였다.
구체적으로, RSV의 보독이 아직 확인되지 않은 애멸구를 얼린 후, e-튜브에 각각 1마리의 애멸구를 넣고 추출 버퍼를 100 ㎕씩 분주하여 분쇄하였다. 이후, 애멸구 사체를 제외한 추출 버퍼를 0.5 ㎖, 및 코팅버퍼로 희석한 1X Capture 항체 100 ㎕를 PCR 튜브에 각각 넣어준 다음 37℃에서 4시간 배양하였고, 1X PBST 버퍼로 5회 세척 후 10분간 건조하였다. 시료를 마쇄하여 추출버퍼와 1:10의 비율로 혼합하였고, 4℃에서 24시간 배양한 뒤 건조된 PCR 튜브에 추출액 100 ㎕를 분주하고 다시 37℃에서 4시간 배양 후 동일한 방법으로 3회 세척하고 건조하였다. 건조된 PCR 튜브에 DEPC water 20 ㎕를 첨가하여 70℃에서 15분간 열처리하고 얼음에 넣어 이후의 Immuno capture 과정을 수행함으로써 애멸구의 RSV 보독 여부를 확인하였다.
실시예 2-2. RSV 감염 방법
가로 60cm, 세로 30cm의 유묘상자에 수도용 상토를 채운 후 품종 당 20립의 발아된 종자를 파종하였고, 검정계통 18열 마다 감수성 품종인 '일품'과 저항성 품종인 '제니스'를 대비품종으로 파종하였다. 파종 후 약 2주간 벼를 생육시킨 이후, 상기 실시예 2-1을 통해 확인한 RSV에 보독된 2-3령충의 애멸구(약 33%의 바이러스 보독율) 유충을 식물체 당 4~5마리의 밀도로 5일간 접종하였고, 바이러스 검정 온실에 이앙하였다. 애멸구 접종 시 매일 3회 이상 애멸구를 분산시켜 균일하게 유지하였으며, 약 30일 후에 벼의 RSVD 저항성 반응을 조사하였다.
실시예 2-3. RSVD 저항성 평가 방법
상기 실시예 2-2을 통해 RSVD에 감염시킨 벼의 RSVD에 대한 저항성 또는 감수성 여부를 판단하기 위하여, 기존의 공지된 방법(Wu et al., 2011, Theoretical and applied genetics, 122(5), 915-923.; Kwon et al., 2012, Theoretical and Applied Genetics, 125(5), 1033-1046.)을 이용하였다.
구체적으로, 감염 이후 약 30일 후에 품종별로 전체 식물체에 대한 건전주(healthy plants)의 비율을 조사한 후 계통 또는 품종의 RSVD 저항성을 확인하였다. RSVD 저항성 평가 시, 잎에 녹색 또는 흰색의 강한 줄무늬를 보이거나 생육이 정지한 개체는 비건전 식물체(unhealthy plants), 약한 줄무늬를 보이나 정상적인 생육을 보이는 개체는 건전 식물체로 분류하였다. 이때, 비교품종으로서 '신광' 및 '일품', 또는 '제니스' 및 '일품'을 각각 15품종, 18계통 마다 이앙하여 상대적인 RSVD 저항성 정도의 기준으로 이용하였다.
실시예 3. RSVD 양적형질 유전자 좌(Quantitative trait locus; QTL ) 분석 방법
실시예 3-1. DNA 추출 및 증폭 방법
게놈(genome) DNA는 파종 1달 된 벼의 잎에서 CTAB 방법(Murray and Thompson, 1980)을 이용하여 추출하였다.
구체적으로, 3mm 텅스텐 구슬 3개를 넣은 2㎖ e-튜브(Axygen, MC200)에 각 계통의 잎(2㎖ e-튜브에 0.5㎖ 까지)을 잘라 넣은 다음 액체 질소로 약 1분간 급속히 냉각시켰고, 연녹색으로 변할 때까지 두 차례 반복하여 마쇄하였다. 이후, 500 ㎕ CTAB 버퍼(2% CTAB; 0.1M pH 8.0 Tris, 1.4M NaCl, 1% PVP)를 넣어 혼합한 뒤, 65℃ 항온수조에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 500 ㎕ PCI 용액(페놀:클로로포름:이소아밀알코올=25:24:1)을 첨가하여 약 3분간 교반한 다음, 13000 rpm 에서 10분간 원심분리하여 상등액(450 ㎕)을 1.5㎖ e-튜브(Axygen, MC200)로 옮겨 담았다. 그 후, 750 ㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 약 1분간 혼합하였고, 20℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 13000 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상등액을 버리고 70%의 냉각된 에탄올로 펠렛을 세정한 후 건조시켰다. 건조된 펠렛을 30 ㎕의 ddH2O에 녹이고 나노드롭(Nanodrop Co.)을 이용하여 추출한 DNA의 농도를 분석하였다. 이후의 실험에는 DNA의 농도를 20 ng/㎕로 조절하여 사용하였다.
25ng의 상기 주형 DNA, 각 프라이머 10 pmol, 10X e-Taq 반응 버퍼(25 mM MgCl2 혼합), 10mM dNTP Mix, 0.02 U의 Solg™ e-Taq DNA 중합효소(SolGent Co. Ltd., South Korea) 및 물을 첨가한 최종 부피 25 ㎕의 반응액을 PCR 분석에 사용하였다. PCR 증폭은 Veriti 96-Well Thermal Cycler(Applied Biosystems, Life Technologies, Grand Island, NY, USA)를 사용하였다. 초기 변성은 94℃에서 2분간, 다음 변성은 94℃에서 20초, 어닐링(annealing)은 57℃에서 40초, 그리고 DNA합성은 72℃에서 30초간 총 35회를 수행한 후, 마지막으로 72℃에서 7분간 합성하였다. 증폭된 PCR 산물은 EtBr이 첨가된 3% 아가로스 겔(agarose gel)을 이용하여 200V에서 1시간 동안 전기영동하였고, UV를 이용하여 다형성을 확인하였다.
실시예 3-2. 유전자 지도 작성 및 QTL 분석 방법
국립 식량과학원 남부작물부에서 보유하고 있는 1168개의 SSR(simple sequence repeat) 마커와 기존에 공지된 11개의 Indel(Insertion-deletion) 마커(Kwon et al., 2012, Theoretical and Applied Genetics, 125(5), 1033-1046.)를 사용하여 RSVD 저항성 관련 유전자 지도를 작성하였고, QTL 분석을 수행하였다.
유전자 지도 작성에는 F2:3 집단의 180 계통을 사용하였으며, QTL 분석에는 MAPMAKER/EXP ver.3.0의 Kosambi 기능을 사용하여 센티모건(centi morgan; cM) 단위로 계산하였다. 이후, MAPMAKER/EXP ver.3.0에 의해 계산된 각각의 다형성 마커간의 거리를 WinQTLcart version 2.5(WinQTL cartographer software) 프로그램의 CIM(composite interval mapping)을 사용하여 분석하였다.
또한, Gramene(http://www.gramene.org), Rice Genome Annotation Project Rice Genome Browser - Release 7(http://rice-.plantbiology.msu.-edu/), Gramene-database(http://www.gramene.org) 및 BGI-RIS( http://rice.genomics.org.cn) 등의 데이터베이스에서 유전자 이입 영역의 염기서열 정보를 얻었다.
이후, 상기 저항성 영역에 존재하는 다형성 분자마커를 탐지하기 위한 프라이머는 PRIMER3 software(http://web.bioneer.co.kr/cgi-bin/-primer-/- primer3.cgi)을 이용하여 제작하였다.
실험예 1. RSVD 저항성 유전자 도입 품종의 육성
RSVD 저항성을 판별하기 위한 분자마커를 개발하기 위하여, 상기 실시예 1에 언급된 바와 같이, RSVD 감수성 품종에 RSVD 저항성 유전자가 도입된 신품종을 이용하였다.
구체적으로, RSVD 저항성 유전자인 Stv-a와 Stv-b를 보유하고 있는 미국 자포니카 RSVD 저항성 품종인 '제니스(Zenith)'를 부본으로 하고, 자포니카 RSVD 감수성 품종인 '일품'을 모본으로 하여 F1을 육성하였다. 육성된 F1의 교배유무를 확인하기 위해 공지된 RSVD 저항성 다형성 마커(Indel8 및 Indel9)의 보유 여부를 분석하였다.
그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 일품/제니스 F1은 유전형이 헤테로(hetero)로 나타나 교배가 잘 이루어졌음을 확인하였다.
또한, 상기 일품/제니스 F1의 RSVD 저항성 생물검정을 상기 실시예 2에 따라 수행하였다.
그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 전체 식물체에 대한 건전주의 비율이 RSVD 감수성 품종인 일품은 14.3%, RSVD 저항성 품종인 제니스는 71.3%로 나타났으며, 이들의 교배 품종인 일품/제니스 F1은 57.1%로 나타남을 확인하였다. 구체적으로, 일품은 성장이 저하되고 잎이 연녹색을 나타내거나 황색으로 변함과 동시에 황색의 줄무늬가 나타났으며, 황색 또는 흰색 반점을 나타내기도 하였다. 반면 저항성 품종인 제니스는 성장이 저하되지 않고 정상적으로 성장하였으며, 잎이 연녹색을 나타내긴 하였으나, 시간이 지남에 따라 진한 녹색으로 변하였고, 일품과 제니스가 교배된 F1의 경우, 성장은 제니스에 비해 저조하였지만 병징은 제니스와 비슷하게 나타남을 확인하였다.
아울러, 도 3에서 볼 수 있듯이, 일품/제니스 F2:3 집단도 건전주의 비율이 약 55%임을 확인하였다.
이에 따라, 교배 품종인 일품/제니스는 RSVD에 대하여 저항성을 가지고 있음을 알 수 있었으며, 제니스가 보유하고 있는 RSVD 저항성 유전자 중 Stv-b가 일품으로 도입되었음을 알 수 있었다.
실험예 2. RSVD의 QTL 분석 결과
실험예 2-1. 다형성 마커의 탐지 결과
제니스와 일품 각 품종에서 RSVD 저항성에 대하여, 다형성을 나타내는 다형성 마커를 상기 실시예 3에 따라 탐지하였다.
구체적으로, 공지된 1168개의 SSR 마커 및 11개의 Indel 마커를 사용하였다.
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 벼의 12개 염색체에서 총 175개의 다형성 마커(169개의 SSR 마커 및 6개의 Indel 마커)를 탐지하였고, 특히 6번과 11번 염색체에 비교적 많은 마커가 존재함을 확인하였다.
염색체 적용한
마커의 수(A)		 Markers allelic to zenith
탐지된 마커의 수(B) 탐지된 마커의 비율(%) (B/A)
1 123 17 13.82
2 135 19 14.07
3 62 8 12.90
4 75 11 14.67
5 124 16 12.90
6 145 22 15.17
7 66 13 19.70
8 80 16 20.00
9 50 7 14.00
10 60 9 15.00
11 182 31 17.03
12 66 6 9.09
합계 1168 175 14.98
실험예 2-2. 유전자 지도 작성 및 QTL 분석
상기 실험예 2-1을 통해 선발한 마커들을 MAPMAKER 프로그램을 이용하여 유전자 지도 작성에 사용하였다. 그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 작성된 염색체 지도의 전체 길이는 3,350.84 cM이며, 다형성 마커간의 평균거리는 19.14 cM임을 확인하였다.
또한, 12개의 염색체에 대하여, WinQTLChart 프로그램을 이용하여 QTL 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, Stv-a 유전자가 존재하는 6번 염색체에서는 RSV 저항성과 관련된 QTL이 존재하지 않으나, Stv-b 유전자가 존재하는 11번 염색체에서는 RSVD 저항성 QTL(LOD 9.7 전체 표현형 변이율 28.0%)을 발견하였다. 상기 QTL을 qRSV11Z로 명명하였으며, 이의 결과를 하기 표 2에 정리하였다.
QTL Chromosome Position Maker interval LOD PVE (%) Add Dom
qSTV11 Z 11 123.3 RM1355 - RM6680 9.7 28 -16.82 8.64
실험예 2-3. 정밀 유전자 지도 작성 및 QTL 분석
상기 실험예 2-2를 통해 발견한, Stv-b 유전자가 존재하는 qRSV11Z을 이용하여 신규의 RSV 저항성 분자마커를 규명하고자, 먼저 상기 qRSV11Z의 더욱 정밀한 위치를 확인하였다.
구체적으로, 6계통 헤테로 라인의 659 집단을 대상으로, 기존 1168개의 SSR 마커와 11개의 Indel 마커 이외에 124개의 Sid(Stripe virus Insertion-deletion) 마커를 추가로 사용하여 정밀 유전자 지도를 작성하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, qRSV11Z는 Sid2(17.90 Mbp)와 InDel8 (18.419 Mbp) 사이의 영역에 위치함을 확인하였고, 그 길이는 약 520-kb임을 확인하였다. 이때, 상기 영역에 존재하는 다형성 마커를 검출하기 위한 프라이머의 서열은 하기 표 3에 나열하였다.
Primer ID Forward primer (5'-3') Reverse primer (5'-3')
Sid2 CGTGGACACAATATTCCCCA
(서열번호 1)		 GCATCTCTTCCCCCAAAAGA
(서열번호 2)
Sid61 TCATCCTCGATCTCCACCTC
(서열번호 3)		 GGGGTCCGTCAAATCATCTA
(서열번호 4)
Sid75 GGGGTVVGTGAAATCATCTA
(서열번호 5)		 CACTGTTTCCTCCCACTGGT
(서열번호 6)
Sid79 CAAGTGTAGGCGTGTGTGTG
(서열번호 7)		 CGCAAGGTGCTACAACAAAA
(서열번호 8)
Sid113 TGGTCCACACGTGCATATCT
(서열번호 9)		 TGATGTAGTAGACTCCACGT
(서열번호 10)
Sid115 ATTGCAACGAACACAACAGC
(서열번호 11)		 CACTGCAGAAAAGGACACGA
(서열번호 12)
Indel4 CTCAAGCTCGACAAGGTCTG
(서열번호 13)		 CCTCCGTCGTCTGCCTTTTT
(서열번호 14)
RM21 ACAGTATTCCGTAGGCACGG
(서열번호 15)		 GCTCCATGAGGGTGGTAGAG
(서열번호 16)
RM26771 TCAGATCCCAACTAGCACCTATCC
(서열번호 17)		 AAGACGATGCATGTCAACAAGG
(서열번호 18)
RM26774 AAGCTTGTCTAGATCCACCATTGC
(서열번호 19)		 TGCTTCTTTACATACCACGTCAGG
(서열번호 20)
RM26791 CTAGGAGCGTTTGTAGGTGTGC
(서열번호 21)		 TGATAAACCAGTCCAACAGAGC
(서열번호 22)
RM26776 GTACCAGCGTGGACACAATATTCC
(서열번호 23)		 GAGATGTCATGGTATGGCTTTCC
(서열번호 24)
특히, 상기 영역 내에서도 17.9~18.24Mb 구간에 위치한 3개의 Sid 마커(Sid2, Sid113, Sid115) 및 18.29~18.32Mb 구간에 위치한 3개의 Sid 마커(Sid61, Sid75, Sid79)가 넓은 범위에 비해 다형성을 나타냄을 확인하였다.
실험예 3. 신규의 RSV 저항성 다형성 분자마커 규명
상기 실험예 2-3을 통해 발견한 6개의 Sid 마커 중에서도, Stv-b 유전자에 의해 RSV 저항성을 나타내는 벼 품종을 판별할 수 있는 다형성 마커를 선발하고자 하였다.
구체적으로, 감수성 품종인 '일품', 저항성 품종으로서 Stv-b 유전자를 포함하고 있는 '제니스', 및 저항성 품종으로서 Stv-b의 복대립 유전자인 Stv-bi 유전자를 포함하고 있는 '신광'에 대하여 상기 6개의 sid 마커를 탐지하였다.
그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, 6개의 sid 마커 중에서도 Sid2 증폭 산물을 이용하는 경우에 제니스와 일품 또는 신광을 구분할 수 있음을 확인하였다. 제니스의 Sid2 증폭 산물은 약 650bp, 일품 및 신광의 Sid2 증폭 산물은 약 250bp의 크기를 나타내어 제니스와 일품 또는 신광이 뚜렷하게 구분되었으나, 나머지 5개의 sid 마커(sid113, sid15, sid61, sid75 및 sid79)의 증폭 산물로는 제니스와 다른 품종을 구분할 수 없음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, Sid2는 qSTV11Z 내 포함된 저항성 유전자인 Stv-b를 포함하고 있는 벼 품종과 상기 Stv-b의 복대립 유전자인 Stv-bi를 포함하고 있는 벼 품종을 용이하게 구분할 수 있으므로, Stv-b 유전자를 포함하는 RSVD 저항성 품종의 판별용 분자마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 4. 신규의 RSVD 저항성 다형성 분자마커의 검증
상기 실험예 3을 통해 발견한 Sid2 마커가 Stv-b 유전자를 포함하는 RSVD 저항성 품종의 판별에 사용될 수 있는지 검증하였다.
구체적으로, Sid2 마커의 탐지 대상으로서 유전형별 각 1계통씩 6계통을 선발하였고, 이에 대하여 Sid2 마커를 탐지하였다. 이때, 일품과 제니스를 각각 RSVD 감수성과 저항성 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이, 6계통 모두에서 Sid2 마커의 증폭 산물의 크기는 약 650bp로서 RSVD 저항성 품종인 제니스와 동일한 크기를 나타냄을 확인하였다. 또한, 이는 RSVD 감수성 품종인 일품의 경우(약 250bp)보다 더 큰 것을 확인하였다.
아울러, 상기 6계통에 대하여 상기 실시예 2에 따라 RSVD 저항성 생물검정을 수행한 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, 모두 제니스와 동일한 건강한 표현형을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, Sid2는 Stv-b 유전자를 포함하는 RSVD 저항성 품종의 판별용 분자마커로 사용될 수 있으며, 이에 따라 RSVD 저항성 유전자, 특히 Stv-b 유전자를 이용한 RSVD 저항성 중간모본의 육성 및 품종개발에 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Molecular marker for rice stripe virus disease resistance and uses thereof <130> KPA161682-KR <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sid2 Forward primer <400> 1 cgtggacaca atattcccca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sid2 Reverse primer <400> 2 gcatctcttc ccccaaaaga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sid61 Forward primer <400> 3 tcatcctcga tctccacctc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sid61 Reverse primer <400> 4 ggggtccgtc aaatcatcta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sid75 Forward primer <400> 5 ggggtvvgtg aaatcatcta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sid75 Reverse primer <400> 6 cactgtttcc tcccactggt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sid79 Forward primer <400> 7 caagtgtagg cgtgtgtgtg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sid79 Reverse primer <400> 8 cgcaaggtgc tacaacaaaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sid113 Forward primer <400> 9 tggtccacac gtgcatatct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sid113 Reverse primer <400> 10 tgatgtagta gactccacgt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sid115 Forward primer <400> 11 attgcaacga acacaacagc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sid115 Reverse primer <400> 12 cactgcagaa aaggacacga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Indel4 Forward primer <400> 13 ctcaagctcg acaaggtctg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Indel4 Reverse primer <400> 14 cctccgtcgt ctgccttttt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM21 Forward primer <400> 15 acagtattcc gtaggcacgg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM21 Reverse primer <400> 16 gctccatgag ggtggtagag 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM26771 Forward primer <400> 17 tcagatccca actagcacct atcc 24 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM26771 Reverse primer <400> 18 aagacgatgc atgtcaacaa gg 22 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM26774 Forward primer <400> 19 aagcttgtct agatccacca ttgc 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM26774 Reverse primer <400> 20 tgcttcttta cataccacgt cagg 24 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM26791 Forward primer <400> 21 ctaggagcgt ttgtaggtgt gc 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM26791 Reverse primer <400> 22 tgataaacca gtccaacaga gc 22 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM26776 Forward primer <400> 23 gtaccagcgt ggacacaata ttcc 24 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM26776 Reverse primer <400> 24 gagatgtcat ggtatggctt tcc 23

Claims (10)

  1. 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는, 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 Stv-b 유전자를 포함하는 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종을 선별하는 것인, 조성물.
  3. 제1항의 조성물을 포함하는, 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍; 제한효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함하는 것인, 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응완충액을 포함하는 것인, 키트.
  6. (a) 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종 선별 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 시료는 벼의 뿌리 조직, 잎 조직, 줄기 조직, 꽃 조직 또는 이삭 조직으로부터 유래한 것인, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종은 Stv-b 유전자를 포함하는 것인, 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)의 증폭 산물의 크기를 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 증폭 산물의 크기가 벼 줄무늬잎마름병 감수성 벼 품종에 비하여 더 큰 경우, 벼 줄무늬잎마름병 저항성 벼 품종으로 판단하는 것인, 방법.
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