CN114717301B - 一种鉴别大口黑鲈遗传性别的分子标记及其引物对 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别大口黑鲈遗传性别的分子标记及其引物对。其分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示,其存在于大口黑鲈遗传性别X染色体上，在Y染色体上缺失。引物对的序列如SEQ ID NO:2和3所示。应用该引物对可以简便、快速、稳定地鉴别出大口黑鲈各个群体中不同个体的遗传性别，包括大口黑鲈的胚胎、幼体和成体。正确率达到100％。

Description

一种鉴别大口黑鲈遗传性别的分子标记及其引物对
技术领域
本发明涉及鱼类基因组领域，尤其涉及一种鉴别大口黑鲈遗传性别的分子标记及其引物对。
背景技术
性别决定是两性生殖生物确定性别发育方向的生物过程，是生命繁衍的关键环节，直接关系着物种的发生、续存、适应与进化。因而，性别决定机制一直是生命科学研究的热点。鱼类在脊椎动物进化系统中，处于承前启后的关键位置，又因其分布范围广，物种数量丰富，在性别决定机制上也多种多样，所以是研究性别决定机制的重要对象。许多鱼类在生长速率上存在性别差异，因此，针对这些鱼类物种开发可以准确鉴定其遗传性别的分子标记，进行这些鱼类的单性育种与遗传学研究，对于提高鱼产量、增加水产养殖收益以及促进相关的研究有着重要的意义。
大口黑鲈(Micropterus salmoides)隶属鲈形目，太阳鱼科，黑鲈属，具有显著的雌雄生长二态性，因其具有适应性强、生长快、生长周期短的特点，经过30多年的养殖历程，已成为我国重要的淡水养殖品种之一。养殖产业中有培育全雄或全雌苗种的需求，全雄苗种个体体型好，有价格优势，且有更好的越冬性能，适合我国大部分地区的越冬养殖模式；而全雌苗种长速快，寿命较长，体型较大，开发其单性育种与单性养殖技术具有重要的产业意义。单性苗种还能有效防止种苗企业的优质种质外流。培育单性苗种需要获得伪雌、伪雄或超雄鱼作为亲本，而这四类鱼都无法通过表型来判断，需要准确的分子标记来鉴定。
大口黑鲈在性腺发育成熟之前，其雌鱼和雄鱼却很难从外部形态上加以区分，胚胎和幼体阶段雌雄鱼形态上完全没有区别；不存在异形性染色体，也无法从细胞学角度鉴定其遗传性别；因此，开发一种可以鉴别其遗传性别的分子标记用于大口黑鲈性别控制育种具有极大的生产应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供能区分大口黑鲈遗传性别的分子标记，有助于快速、简便、准确鉴别大口黑鲈个体的遗传性别，为开展大口黑鲈的性别控制育种工作、发展单性养殖建立基础。本发明还提供了检测该分子标记的引物对。
为实现上述目的，本发明提供一种鉴别大口黑鲈遗传性别的分子标记，其特征在于，其分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示,所述分子标记存在于大口黑鲈遗传性别X染色体上，在Y染色体上缺失。
本发明还提供一种鉴别大口黑鲈遗传性别的分子标记的引物对，其特征在于，引物对的序列如SEQ ID NO:2和3所示。
本发明还提供一种采用所述引物对检测所述分子标记的方法，其特征在于，通过引物对对待测DNA进行PCR扩增。
本发明还提供一种鉴别大口黑鲈遗传性别的方法，其特征在于，采用引物对进行PCR检测，当采用SEQ ID NO:2和3引物对时，PCR扩增片段有两条大小不同的特异条带345bp和314bp，则判断待测大口黑鲈的遗传性别为雄性；PCR扩增片段只有一条特异条带345bp，则判断待测大口黑鲈的遗传性别为雌性。
进一步，所述PCR检测的反应体系为，以反应总体积为10μl计算，5μl 2×Pro TaqMaster Mix，1μl 30ng/μl模板DNA，0.4μl 10μM正反向引物，最后加ddH2O补齐；
进一步，所述PCR检测的扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸30s，30～35个循环后接着72℃延伸5min。
本发明通过对200尾雌性和雄性大口黑鲈基因组DNA的序列进行比较分析，找到雌鱼与雄鱼之间存在稳定差异的DNA区段，该区段长度为0.19Mb(百万碱基对)，利用该区段的雌雄差异设计了1对特异引物并进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，从而开发出1个可以准确鉴定大口黑鲈遗传性别的分子标记。通过在不同的群体进行应用验证，证明所开发的分子标记稳定性好，鉴定准确性高。此前，有研究人员报道过2个插入缺失分子标记可以用于鉴定大口黑鲈的遗传性别分子标记(Aquaculture,2021，https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2021.737220)。但经过我们对多个群体的验证，其准确率分别只有87％和86％，无法实现遗传性别的准确鉴定。申请人开发的1个分子标记，可以方便且准确地鉴定出大口黑鲈的胚胎、幼体及成鱼的遗传性别，为大口黑鲈单性别苗种的培育提供了必要的分子工具，同时也为进行性别决定机制研究奠定了基础。
本发明的差异化序列即分子标记序列为SEQ ID NO:1，所示序列位于图1中。具体的，SEQ ID NO:1位于图1中的546bp-577bp处。
GTCAAATCCTGCCTGCAGCCCTTTGCCGGGT SEQ ID NO:1。
对差异性序列即分子标记序列进行鉴定，其鉴定序列如下：
MF-share(雌雄共享)引物3可区分SEQ ID NO:1序列：
MFS3-F:5'GAGGACAGCCAGTAGAAAC 3' SEQ ID NO:2；
MFS3-R:5'GAAAGGACAGTGCACAGAG 3' SEQ ID NO:3。
用所述引物序列在遗传上雄性大口黑鲈基因组中扩增出两条分别约345bp和314bp的DNA条带，在遗传上雌性大口黑鲈基因组中只能扩增出一条约345bp的DNA条带，若是遗传上超雄鱼则应扩增出一条约314bp的DNA条带。正确率达到100％。
本发明的有益效果是：可以简便、快速、稳定地鉴别出大口黑鲈各个群体中不同个体的遗传性别，包括大口黑鲈的胚胎、幼体和成体。将该DNA分子标记应用于生产实践可以有效地识别与鉴定各种发育阶段大口黑鲈的遗传性别，有助于大口黑鲈正常雄鱼、正常雌鱼、伪雄鱼(生理性雄鱼)、伪雌鱼(生理性雌鱼)、超雄鱼(染色体为YY)的识别，从而为顺利开发出大口黑鲈的单性育种技术，包括单性育种中所需要的伪雄鱼、伪雌鱼或超雄鱼等的培育技术以及个体选择、交配模式等。这将进一步提高养殖效益，增加大口黑鲈养殖的经济收益。本发明开发的分子标记也将有益于大口黑鲈性别决定机制等相关的科学研究的开展。
附图说明
图1为雌雄大口黑鲈鱼在基因结构中存在的稳定差异区域序列比对分析图，其中方框内为设计的特异引物位点。
图2为应用MFS-3引物对漳州群体的大口黑鲈个体进行遗传性别鉴定结果图。其中N作为阴性对照，M表示DNA分子量标准DL500。
图3是应用MFS-3引物对莆田群体的大口黑鲈个体进行遗传性别鉴定结果图。其中N作为阴性对照，M表示DNA分子量标准DL500。
图4是应用MFS-3引物对南昌群体的大口黑鲈个体进行遗传性别鉴定结果图。其中N作为阴性对照，M表示DNA分子量标准DL500。
图5是应用MFS-3引物对佛山群体的大口黑鲈个体进行遗传性别鉴定结果图。其中N作为阴性对照，M表示DNA分子量标准DL500。
图6是应用MFS-3引物对厦门群体的大口黑鲈个体进行遗传性别鉴定结果图。其中N作为阴性对照，M表示DNA分子量标准DL500。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：不同群体来源的大口黑鲈的性别鉴定
剪取待测大口黑鲈的部分鳍条，放入95％的酒精溶液中，-20℃保存用于提取基因组DNA鉴定其遗传性别。性别鉴定结果由扩增条带大小来判定；判定结果的准确与否通过解剖后进行组织学观察确认。实验中所使用样品的性别已通过解剖及组织学观察判定确认其性别；
模板大口黑鲈的来源：漳州群体共16个样本，莆田群体共16个样本，厦门群体共15个样本，南昌群体共14个样本；佛山群体共14个样本。所使用大口黑鲈个体都为12月龄成体鱼。
利用市售的DNA提取试剂盒提取基因组DNA，所得的基因组DNA统一稀释到30ng/μl作为模板备用；
使用引物MFS3-F/R进行PCR扩增：
(1)PCR反应体系：反应总体积为10μl，具体反应体系为：5μl 2×Pro Taq MasterMix，1μl 30ng/μl模板DNA，0.4μl 10μM正反向引物，最后加ddH2O补齐。
(2)PCR扩增条件(MFS3-F/R的退火温度为55℃)：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸30s，30～35个循环后接着72℃延伸5min。
将上述所得PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测及结果分析：
3)选用MF-share引物3(MFS3-F/R)(即SEQ ID NO:2和3)进行扩增的PCR产物，电泳检测可采用3％的琼脂糖凝胶，电压130V，电流130A，跑胶时间60min。该引物组合能够在所有遗传上为雄性个体的基因组DNA中扩增出两个特异条带，一个约345bp，一个约314bp，而在所有遗传上为雌性个体的基因组DNA中只可以扩增出一个约345bp的特异条带。
结果如图2-6所示。图2-图6展示出了应用MFS3引物对五个群体的大口黑鲈个体进行遗传性别鉴定的结果，由图可知，在所有待检测的大口黑鲈雄性个体中都扩增出两条大小不同的特异条带(一个约345bp，一个约314bp)，而待测的雌性个体只扩增出一条特异条带(约345bp)。
上述结果均与实际一致。说明本发明的一对引物能准确的鉴定不同群体来源的大口黑鲈的遗传性别，准确率为100％。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学
<120> 一种鉴别大口黑鲈遗传性别的分子标记及其引物对
<130> JMDXL-22002-CNI
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 大口黑鲈（Micropterus salmoides）
<400> 1
gtcaaatcct gcctgcagcc ctttgccggg t 31
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaggacagcc agtagaaac 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaaaggacag tgcacagag 19

Claims (6)

1.一种鉴别大口黑鲈遗传性别的分子标记，其特征在于，其分子标记的序列如SEQ IDNO:1所示,所述分子标记存在于大口黑鲈遗传性别X染色体上，在Y染色体上缺失。
2.一种鉴别大口黑鲈遗传性别的分子标记的引物对，其特征在于，引物对的序列如SEQID NO:2和3所示。
3.一种采用权利要求2所述引物对检测权利要求1分子标记的方法，其特征在于，通过权利要求2的引物对对待测DNA进行PCR扩增。
4.一种鉴别大口黑鲈遗传性别的方法，其特征在于，采用权利要求2的引物对进行PCR检测，当采用SEQ ID NO:2和3引物对时，PCR扩增片段有两条大小不同的特异条带345bp和314bp，则判断待测大口黑鲈的遗传性别为雄性；PCR扩增片段只有一条特异条带345bp，则判断待测大口黑鲈的遗传性别为雌性。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述PCR检测的反应体系为，以反应总体积为10μl计算，5μl 2×Pro Taq Master Mix，1μl 30ng/μl模板DNA，0.4μl 10μM正反向引物，最后加ddH2O补齐。
6.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述PCR检测的扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火15s，72℃延伸30s，30～35个循环后接着72℃延伸5min。
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Mapping sex-determination region and screening DNA markers for genetic sex identification in largemouth bass (Micropterus salmoides);He qiwei等;《Aquaculture》;第559卷;738450 *

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