CN113897439A - 一种大黄鱼遗传性别相关的分子标记、鉴定引物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大黄鱼遗传性别相关的分子标记、鉴定引物及其用途。该分子标记为当Dmrt1基因完整ORF全长为915bp时，第5外显子上第84位核苷酸发生了C/A的变异，第87位核苷酸发生了G/A的变异；当Dmrt1基因第5外显子首位有3个碱基的插入，即完整ORF全长为918bp时，第5外显子上第87位核苷酸发生了C/A的变异，第90位核苷酸发生了G/A的变异。该分子标记可快速、稳定地鉴别出不同生长阶段、及不同地区群体的大黄鱼个体的遗传性别。定位于基因编码区域的性别标记的开发，利于大黄鱼性别决定机制等科学研究的开展，同时能鉴定各种表型性别大黄鱼的遗传性别，辅助大黄鱼单性养殖，提高养殖效益。
Description
技术领域
本发明涉及水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，尤其涉及一种大黄鱼遗传性别相关的分子标记、鉴定引物及其用途。
背景技术
性别的形成和遗传一直是遗传学和生物学的重要议题，探索性别决定的发生有助于我们对生命活动规律等问题的认知，以及人为控制经济动物性别提供依据。脊椎动物大多数表现为雌雄异体，性别二态性差异显著，这些差异导致了生命更加复杂和精彩。鱼类在脊椎动物进化中处于承前启后的地位，其种类繁杂多样，性别决定方式各不相同。大多数经济鱼类物种的性别与个体生长等重要经济性状及经济价值密切相关，因而开发经济鱼类的单性育种与养殖技术在鱼类养殖产业上具有重大经济价值。但是，对于许多经济鱼类来说，尽管在性成熟个体中存在显著的性别二态性，但是在性腺尚未发育成熟的仔稚鱼及幼鱼阶段，其性别往往难以通过外形进行区分；还有一些鱼类存在天然的性逆转现象，或者可通过人为控制环境因素改变其生理性别，但性别逆转前后没有形态上的差异，无法通过外部形态识别其遗传性别。这些问题的存在给开展单性育种、养殖及鱼类性别决定相关基础研究带来很大的困扰。因此，针对经济鱼类物种开发可以准确鉴定其遗传性别的分子标记，对于进行经济鱼类性别决定的遗传学研究，单性育种与养殖，增加经济鱼类养殖收益等方面都有着重要的意义。
大黄鱼(Larimichthys crocea)属鲈形目(Perciformes)，石首鱼科(Sciaenidae)黄鱼属(Larimichthys)，是我国传统四大海产之首，为当前养殖量最大的海水鱼。其具有明显的雌雄生长二态性，雌鱼生长速度显著快于雄鱼，但在性腺充分发育之前，大黄鱼的性别很难从外部形态上加以区分，即使是性腺发育成熟的个体，外观上常常也难以准确判别雌雄；人工诱导性反转培育出来的伪雄鱼、伪雌鱼，更是难以从外观上与真雄鱼、真雌鱼加以区分；这给大黄鱼的单性育种及养殖技术的开发带来了很大困难。因此，开发可以鉴别其遗传性别的分子标记，不仅在大黄鱼性别控制育种方面具有极大的生产应用价值，而且在大黄鱼的性别决定机制的基础研究方面也有重要意义。
迄今为止，本申请人已开发出两种可以识别与鉴定(鉴别)大黄鱼遗传性别的分子标记，但都处于非编码区域，其中专利ZL201710576189.2所描述的分子标记，在实际应用中存在着个别个体可能不会出现预期扩增条带的问题，使其遗传性别难以确定。开发新的分子标记，与之前开发的分子标记配合使用，有利于对待检个体遗传性别的进一步确认。
发明内容
大黄鱼具有显著的性别二态性，其雌性个体生长速度显著大于雄性个体，养殖全雌个体可以获得更高产量；达到性成熟年龄后，雄性个体体形与体色通常优于雌鱼，可获得较高售价，而且2龄以上个体养殖的死亡率低于雌鱼，有利于养成价格更高的超大规格商品鱼。这使得大黄鱼全雌与全雄苗种都有市场需求。为满足大黄鱼养殖业的需求，提高该物种的水产养殖收益，本发明提供位于编码区的分子标记，还提供一种快速识别与鉴定大黄鱼遗传性别的分子标记方法，与之前开发的分子标记配合使用，有助于更加准确地鉴定各种表型性别大黄鱼的遗传性别(例如，可以鉴别XX♀与XY♀、XX♂与XY♂、以及鉴别XY♂与YY♂)，为顺利开展大黄鱼的性别控制育种工作、发展单性养殖建立基础。定位于基因编码区域的性别标记的开发，还有利于大黄鱼性别决定机制等相关的基础科学研究的开展。
本发明的目的在于提供一种大黄鱼遗传性别相关的分子标记，其特征在于，当Dmrt1基因完整ORF全长为915bp时(如SEQ ID NO:5或6所示)，第5外显子上第84位核苷酸发生了C/A的变异，第87位核苷酸发生了G/A的变异；当Dmrt1基因第5外显子首位有3个碱基的插入，即完整ORF全长为918bp时(如图1，以及SEQ ID NO:5或6所示)，第87位核苷酸发生了C/A的变异，第90位核苷酸发生了G/A的变异。
进一步，当Dmrt1基因第5外显子上第84位或第87位核苷酸为C即基因型为C/C，同时第87位或第90位核苷酸为G即基因型为G/G的个体，为遗传雌性即性染色体组型是XX的大黄鱼；Dmrt1基因第5外显子上第84位或第87位核苷酸同时存在C和A即基因型为A/C，且第87位或第90位核苷酸同时存在G和A即基因型为A/G，为遗传雄性即性染色体组型是XY的大黄鱼；Dmrt1基因第5外显子上第84位或第87位核苷酸只存在A即基因型为A/A，同时第87位或第90位核苷酸只存在A即基因型为A/A，为超雄性即性染色体组型是YY的大黄鱼。
本发明还提供一种用于大黄鱼遗传性别鉴定的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种用于大黄鱼遗传性别鉴定的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括所述引物对。
本发明还提供一种用所述试剂盒或所述引物对进行大黄鱼遗传性别鉴定的方法，其特征在于，使用所述引物对或试剂盒中的引物对，对待检测大黄鱼进行所述分子标记的检测，以确定大黄鱼的遗传性别。
进一步，利用所述引物对或试剂盒中的引物对，对待测大黄鱼基因组DNA进行PCR扩增；
检测扩增片段的数量和长度，以及，
基于所述扩展片段的数量和长度，确定所述待测大黄鱼的性染色体组型及遗传性别。
当扩增结果在100bp～250bp区域内只有一条202bp的条带、没有249bp的条带时，所述待测个体为遗传性别是雌性即性染色体组型是XX的大黄鱼；而扩增结果在100bp～250bp区域内有两条带，且片段长度分别为202bp和249bp时，所述待测个体为遗传性别是雄性即性染色体组型是XY的大黄鱼；若扩增结果在100bp～250bp区域内只有一条长度为249bp的条带时，所述待测个体为遗传性别是超雄性即性染色体组型是YY的大黄鱼。
进一步，所述PCR扩增的体系为：当反应总体积为10μL时，具体反应体系为5μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，上下游引物(共4条)各1μL，30ng/μL的DNA模板1μL。
进一步，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；最后72℃延伸5min。
本发明还提供所述分子标记，引物对或试剂盒，在大黄鱼育种中的用途。
本发明还提供一种大黄鱼辅助育种方法，其特征在于，所述方法包括：通过所述方法来检测所述分子标记，以确定待测大黄鱼的遗传性别。
本发明的申请人比较了不同群体诸多大黄鱼个体Dmrt1基因第5外显子序列(见图1，图2)，发现：部分个体Dmrt1基因第5外显子首位存在3个碱基(CAG)的插入，当Dmrt1基因ORF全长为915bp(即没有CAG的插入)时，第5外显子第84位和第87位核苷酸存在变异；当Dmrt1基因ORF全长为918bp(即有CAG的插入)时，即为第5外显子第87位和第90位核苷酸存在变异，这两个碱基的变异可开发为大黄鱼性别相关的分子标记。所述分子标记核苷酸变异为：在遗传雌性个体(性染色体组型是XX)中，Dmrt1基因第5外显子上第84位(或第87位)核苷酸显示为C(即基因型为C/C)，第87位(或第90位)核苷酸显示为G(即基因型为G/G)；在遗传雄性个体(性染色体组型是XY)中，Dmrt1基因第5外显子上第84位(或第87位)核苷酸同时存在C和A(即基因型为A/C)，第87位(或第90位)核苷酸同时存在G和A(即基因型为G/G)；在超雄性个体(性染色体组型是YY)中，Dmrt1基因第5外显子上第84位(或第87位)核苷酸显示为A，同时第87位(或第90位)核苷酸显示为A(即该两个位点基因型均为A/A)。
以下4种序列中：Lc代表大黄鱼，X代表X染色体，Y代表Y染色体，915和918表示ORF长度。
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ATGAGCAAGGACAAGCCGAACAAGCAGATGCTGGAGCCCACCAGACCTCTGTCCCGGTCCAAAGGCCAGAACCCCCCCAGGATGCCTAAGTGCTCCCGCTGTAGAAACCATGGCTATGTCTCACCTCTGAAGGGACACAAGCGCTTCTGCAATTGGAGAGAATGCCAGTGTCTCAAATGTAAACTGATAACTGAGAGGCAGAGAGTGATGGCAGCCCAGGTCGCCCTGAGACGGGAGCAGGCTCAGGAAGAGGAGCTTGGGATTTGCAGTCCAGTGACTCTGCCCGGCCCTGATGTGATGGTGAAGAATCGAAGCAGAGGAGACTGCTTGTACTCTATGGAGGGACGATCCTCACCACCTTCCACTGGCTCCCCTTCTTCTCTTGCTCCAGGAAGTCGCTCAGCGTCGTCCTCCAGCTCATCAGCAAGTGCCCGGGCTCCTCCTGAGGGACCGTCGGATGTGCTGCTTGACCCATACTACAACTTTTACCAGTCCTCATGTTACCCCACCTACTACAGCAATCTTTATGACTACCAGCAATATCAGAAAATGCCCCACGGTGACAGCCGCCTGCCGAGCCACAACATATCCTCTAAGTATGGCATGCATTCCTACTACCCAGCAGCCACCTATTTGACTCAGGGCATGGGCTCCACCACCTGTGTGCCACCGCTCTTCAGTCTGGACGTCAACAATAATGACAACAACAGCAACAACAACAACAGCAACAGCAACTGCTCTGAGACCCTGGCACCCTCAGGCTTCCCATCCAGCAGCAGCACCACTGGTCACAGCTCCACCATGACCTGCATGTCCATCAGCTCCCTGGTTAACTCTGATGTCCACGCTGAGTGTGAGGCCACCAGCGAGACGCCATACACCGTCAACTCCATCACTGATAGTGATGCCACCAATTAA。SEQ ID NO:7。
>Lc_Y_dmrt1_918
ATGAGCAAGGACAAGCCGAACAAGCAGATGCTGGAGCCCACCAGACCTCTGTCCCGGTCCAAAGGCCAGAACCCCCCCAGGATGCCTAAGTGCTCCCGCTGTAGAAACCATGGCTATGTCTCACCTCTGAAGGGACACAAGCGCTTCTGCAATTGGAGAGAATGCCAGTGTCTCAAATGTAAACTGATAACTGAGAGGCAGAGAGTGATGGCAGCCCAGGTCGCCCTGAGACGGGAGCAGGCTCAGGAAGAGGAGCTTGGGATTTGCAGTCCAGTGACTCTGCCCGGCCCTGATGTGATGGTGAAGAATCGAAGCAGAGGAGACTGCTTGTACTCTATGGAGGGACGATCCTCACCACCTTCCACTGGCTCCCCTTCTTCTCTTGCTCCAGGAAGTCGCTCAGCGTCGTCCTCCAGCTCATCAGCAAGTGCCCGGGCTCCTCCTGAGGGACCGTCGGATGTGCTGCTTGACCCATACTACAACTTTTACCAGTCCTCATGTTACCCCACCTACTACAGCAATCTTTATGACTACCAGCAATATCAGAAAATGCCCCACGGTGACAGCCGCCTGCCGAGCCACAACATATCCTCTAAGTATGGCATGCATTCCTACTACCCAGCAGCCACCTATTTGACTCAGGGCATGGGCTCCACCACCTGTGTGCCACCGCTCTTCAGTCTGGACGTCAACAATAATGACAACAACAGCAACAACAACAACAGCAACAGCAACTGCTCTGAGACCCTGGCACCCTCAGGCTTCCCATCCAGCAGCAGCACCACTGGTCACAGCTCCACCATGACCTGCATGTCCATCAGCTCCCTGGTTAACTCTGATGTCAACACTGAGTGTGAGGCCACCAGCGAGACGCCATACACCGTCAACTCCATCACTGATAGTGATGCCACCAATTAA。SEQ ID NO:8。
本发明所述引物对序列如下所示：
a.X-specific(X染色体特异)引物：
Lc_marker_XF:5’-TCCCTGGTTAACTCTGATGTCCACG-3’ SEQ ID NO:1；
Lc_marker_R:5’-AGTGCCCTCTGGACAGAAACA-3’ SEQ ID NO:2；
b.Y-specific(Y染色体特异)引物：
Lc_marker_F:5’-ACTGTTTCAGAAAGTAACCGCAG-3’ SEQ ID NO:3；
Lc_marker_YR:5’-CTGGTGGCCTCACACTCAGTGTT-3’ SEQ ID NO:4
本发明通过对雌性和雄性大黄鱼基因组DNA的Dmrt1基因CDS序列进行比较分析，找到2个遗传雌性和遗传雄性个体之间存在稳定碱基变异，利用这两个雌雄差异的SNP设计特异引物进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳等方法检测扩增结果，从而开发出一个可以准确快速识别与鉴定大黄鱼遗传性别的分子标记，图9示出了大黄鱼性别特异分子标记开发的思路图解。通过在不同的个体中进行应用验证，证明所开发的分子标记稳定性好，鉴别准确性高，可以方便且准确地鉴别出大黄鱼幼体及成鱼的性染色体组型以及遗传性别，在大黄鱼性别决定及性别控制相关的基础理论研究和育种生产实践上都有重要的应用价值。
本发明的有益效果是：可以简便、快速、稳定地鉴别出大黄鱼不同个体的性染色体组型和遗传性别，与本申请人之前开发的分子标记配合使用，有利于对待检个体遗传性别的进一步确认。有助于大黄鱼正常雄鱼、正常雌鱼、伪雄鱼(生理性雄鱼)、伪雌鱼(生理性雌鱼)以及超雄鱼的识别，有助于大黄鱼单性育种技术的开发，包括单性育种中所需要的伪雄鱼、伪雌鱼或超雄鱼、超雌鱼等的培育技术以及个体鉴别，根据市场需求培育所需单性群体，进一步提高养殖效益，增加养殖收益。
本发明开发的分子标记也将有益于大黄鱼性别决定及性别控制等相关的基础研究的开展。
附图说明
图1是遗传雌性(性染色体组型XX)和遗传雄性(性染色体组型XY)大黄鱼Dmrt1基因ORF序列全长比对结果图，图中与第1条序列相同碱基用·表示，-表示碱基缺失。第1个方框标示出915bp与918bp两种不同长度Dmrt1基因ORF差异的位置(第5外显子起始处)，第2个方框示出X染色体与Y染色体上的序列差异，其也是本发明所述分子标记所在位置。
图2示出了10尾遗传雌性(性染色体组型XX)个体在Dmrt1基因第5外显子区域重测序reads比较结果图。
图3示出了8尾遗传雄性(性染色体组型XY)个体在Dmrt1基因第5外显子区域重测序reads比较结果图。
图4示出了一个优选实施例中遗传雌性(性染色体组型XX)和遗传雄性(性染色体组型XY)样品Dmrt1基因第5外显子测序结果及测序峰图比对结果图。
图5是实施例1雌雄基因组DNA混合模板的验证实验的结果图。A显示X-specific和Y-specific引物对能分别特异性扩增X染色体和Y染色体上的特异片段，B示出对X-specific和Y-specific引物对扩增出的产物进行桑格测序结果的部分峰图。
图6示出了实施例2不同性别个体的验证实验的结果图。
图7示出了实施例3宁德群体样本检测的验证实验的结果图。
图8是实施例4宁波群体样本检测的验证实验的结果图。
图9为实施例5温州群体样本检测的验证实验的结果图。
图10示出了大黄鱼性别特异分子标记开发的思路图解。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一、大黄鱼性别特异分子标记
Dmrt1作为大黄鱼的性别决定候选基因，其在大黄鱼雄性性成熟个体性腺中特异高表达，而在雌性性成熟个体性腺中几乎不表达。对早期性别分化不同时期的大黄鱼性腺转录组测序结果分析显示，在性别分化早期，Dmrt1在精巢中的表达量均显著高于卵巢。而且本发明人之前找到的两个性别标记分别位于Dmrt1基因的第4内含子和其上游5kb内，这些证据足以说明Dmrt1在大黄鱼性别决定过程中扮演着至关重要的角色。由于本实验室之前找到的性别分子标记均位于非编码区，其中专利ZL201710576189.2所描述的分子标记，在实际应用中存在着个别个体可能不会出现预期扩增条带的问题，使其遗传性别难以确定。因此开发新的分子标记，与之前开发的分子标记配合使用，有利于对待检个体遗传性别的进一步确认。发明人考虑比较大黄鱼Dmrt1基因的编码区域开展更准确更快速的大黄鱼性别特异分子标记的挖掘。
为此，发明人对已知性别的雌雄大黄鱼个体Dmrt1基因的CDS区域进行测序并比较，发现，部分大黄鱼个体Dmrt1基因第五外显子首位存在3个碱基(CAG)的插入，当Dmrt1基因ORF全长为915bp(即没有CAG的插入)时，第五外显子上第84位存在C→A的变异，同时第87位存在G→A的变异；当Dmrt1基因ORF全长为918bp(即存在CAG的插入)时，第五外显子上第87位存在C→A的变异，同时第90位存在G→A的变异(图1)。第5外显子起始处即915bp或918bp序列的758bp处。图1是遗传雌性(性染色体组型XX)和遗传雄性(性染色体组型XY)大黄鱼Dmrt1基因ORF序列全长比对结果图。其中第1个方框标示出915bp与918bp两种不同长度Dmrt1基因ORF差异的位置(第5外显子起始处，也即915bp或918bp的758bp开始处)，第2个方框示出X染色体与Y染色体上的序列差异(第5外显子上第84位和第87位两个碱基变异)，其也是本发明所述分子标记所在位置。
为检验这两个变异的可靠性，发明人分析了已知性别的389尾大黄鱼重测序数据的Dmrt1第五外显子区域的reads，结果显示，这两个碱基的变异存在明显的雌雄二态性：当Dmrt1基因ORF全长为915bp(即没有CAG的插入)时，所有遗传雌性(性染色体组型XX)个体的Dmrt1基因第5外显子的第84～87位碱基序列表现为CACG，所有遗传雄性(性染色体组型XY)个体的Dmrt1基因第5外显子的第84～87位碱基序列同时存在CACG和AACA，或有且仅有AACA；当Dmrt1基因ORF全长为918bp(即有CAG的插入)时，所有遗传雌性个体(性染色体组型XX)的Dmrt1基因第5外显子的第87～90位碱基序列表现为CACG，所有遗传雄性(性染色体组型XY)个体的Dmrt1基因第5外显子的第87～90位碱基序列同时存在CACG和AACA，或有且仅有AACA(图2和图3)。图2示出了10尾遗传雌性(性染色体组型XX)个体，图3示出了8尾遗传雄性(性染色体组型XY)个体在Dmrt1基因第5外显子区域重测序reads比较结果图。其中，方框内标出了变异碱基。从图中能看出，遗传雌性个体均只存在CACG(其负链为CGTG)类型的reads，遗传雄性个体则同时包括CACG(负链CGTG)和AACA(负链TGTT)两种类型的reads。
因为大黄鱼是雄性异配型二倍体生物，雌性为XX，雄性为XY，超雄鱼为YY，且X和Y染色体上都存在Dmrt1基因，因此推测X染色体上Lc_Dmrt1X的第五外显子第84～87位(或第87～90位)碱基序列表现为CACG，而Y染色体上Lc_Dmrt1Y的第五外显子第84～87位(或第87～90位)碱基序列表现为AACA。根据这两个变异位点设计等位基因特异性PCR引物分别扩增X和Y染色体上的Dmrt1第5外显子，根据扩增产物的长度不同来区分X和Y染色体，从而区分遗传性别，思路图见图10。
图4示出了一个优选实施例中遗传雌性(性染色体组型XX)和遗传雄性(性染色体组型XY)样品Dmrt1基因第5外显子测序结果及测序峰图比对结果。结果显示，遗传雌性个体Dmrt1基因第5外显子第84位(或第87位)处碱基显示为C，第87位(或第90位)处碱基显示为G；而遗传雄性个体Dmrt1基因第5外显子第84位(或第87位)处碱基同时存在C和A，第87位(或第90位)处碱基同时存在G和A，且两个碱基的峰接近1:1。
二、大黄鱼遗传性别的识别与鉴定
准备待测大黄鱼，其中包括16尾41日龄，24尾120日龄，48尾性成熟宁德群体样本，20尾10月龄宁波群体样本以及24尾性成熟温州群体样本。剪取部分鳍条，放入无水乙醇中，-20℃保存用于基因组DNA的提取。性别鉴定结果由扩增条带数量及大小来判定，判定结果的准确性通过后期解剖后进行组织学观察确认。
利用市售的DNA提取试剂盒提取基因组DNA，所得的基因组DNA统一稀释到30ng/μL作为模板备用；
发明人设计如下两对引物：
a.X-specific(X染色体特异)引物
Lc_marker_XF:5’-TCCCTGGTTAACTCTGATGTCCACG-3’ SEQ ID NO:1；
Lc_marker_R:5’-AGTGCCCTCTGGACAGAAACA-3’ SEQ ID NO:2；
b.Y-specific(Y染色体特异)引物
Lc_marker_F:5’-ACTGTTTCAGAAAGTAACCGCAG-3’ SEQ ID NO:3；
Lc_marker_YR:5’-CTGGTGGCCTCACACTCAGTGTT-3’ SEQ ID NO:4。
将上述4条引物同时放入PCR反应体系进行PCR扩增。
PCR反应体系为10μL，包括：5μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，浓度均为10μM的4条引物各1μL，30ng/μL的DNA模板1μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；最后72℃延伸5min。
通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，通过扩增条带数量及大小(分子量)，判断待测个体的遗传性别。电泳检测可采用2％的琼脂糖凝胶，电压125V，电流125A，时间45min。该引物组合能够在所有性染色体组型包含X染色体的个体基因组DNA中扩增出一条长约202bp的特异条带，在所有性染色体组型包含Y染色体的个体基因组DNA中扩增出一条长约249bp的特异条带。
采用以上方法，对不同样本进行以下实施例的检测验证。
实施例1：雌雄基因组DNA混合模板的验证实验
结果见图5。
图5的A示出了应用X-specific和Y-specific引物对分别扩增雌雄大黄鱼基因组DNA混合模板，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳的结果。从图中可以看出，X-specific引物对能够特异性扩增出X染色体特异条带，Y-specific引物对能够特异性扩增出Y染色体特异条带。其中，M表示DNA分子量标准DL2000。
图5的B示出了应用X-specific和Y-specific引物对分别扩增雌雄基因组DNA混合模板，扩增产物的桑格测序结果(仅示出X-specific和Y-specific引物结合位置的片段)。结果显示其序列结构与对应的X或Y染色体上Dmrt1基因第5外显子的DNA片段相一致。
实施例2：不同性别个体的验证实验
结果见图6。
图6示出了应用X染色体和Y染色体特异引物对通过PCR检测大黄鱼X染色体BAC文库，Y染色体BAC文库，遗传雌性个体，遗传雄性个体和伪雄鱼个体的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图，其中遗传雌性个体、遗传雄性个体、伪雄鱼个体使用的模板为已通过组织学和本实验室之前的性别标记确定生理性别和遗传性别的个体。图中BAC-X表示X染色体的BAC文库，BAC-Y表示Y染色体的BAC文库，♀和♂表示已确定遗传性别和生理性别的雌雄个体，Pm表示已确定遗传性别和生理性别的伪雄鱼个体。由图6可以看出，所有待检测的样品中，含有X染色体的样本均能扩增出一条长202bp的条带，而包含Y染色体的样本均能扩增出一条长249bp的条带。
实施例3：四组宁德养殖群体样本检测的验证实验
结果见图7。
第一组：图7的A示出了应用X-specific和Y-specific引物对通过PCR检测大黄鱼宁德养殖群体中8尾41日龄雌性和8尾41日龄雄性个体的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。其中，M表示DNA分子量标准DL2000。由图7的A可以看出，所有待检测的大黄鱼个体中，在100bp～250bp区域内，遗传雌性个体均只扩增出一条202bp的条带，而遗传雄性个体均能扩增出两条带，长度分别为202bp和249bp。
第二组：图7的B示出了应用X-specific和Y-specific引物对通过PCR检测大黄鱼宁德养殖群体中12尾120日龄雌性个体和12尾120日龄雄性个体的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。其中，M表示DNA分子量标准DL2000。由图7的B可以看出，所有待检测的大黄鱼个体中，在100bp～250bp区域内，遗传雌性个体均只扩增出一条202bp的条带，而遗传雄性个体均能扩增出两条带，长度分别为202bp和249bp。
第三组：图7的C示出了应用X-specific和Y-specific引物对通过PCR检测大黄鱼宁德养殖群体中12尾性成熟雌性个体和12尾性成熟雄性个体的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。其中，M表示DNA分子量标准DL2000。由图7的C可以看出，所有待检测的大黄鱼个体中，在100bp～250bp区域内，遗传雌性个体均只扩增出一条202bp的条带，而遗传雄性个体均能扩增出两条带，长度分别为202bp和249bp。
第四组：图7的D示出了应用X-specific和Y-specific引物对通过PCR检测大黄鱼宁德养殖群体中12尾性成熟雌性个体和12尾性成熟雄性个体的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。其中，M表示DNA分子量标准DL2000。由图7的D可以看出，所有待检测的大黄鱼个体中，在100bp～250bp区域内，遗传雌性个体均只扩增出一条202bp的条带，而遗传雄性个体均能扩增出两条带，长度分别为202bp和249bp。
实施例4：宁波群体样本检测的验证实验
结果见图8。
图8示出了应用X-specific和Y-specific引物对通过PCR检测大黄鱼宁波群体中20尾10月龄个体的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图。其中，M表示DNA分子量标准DL2000。由图8可以看出，所有待检测的宁波群体大黄鱼个体中，在100bp～250bp区域内，遗传雌性个体均只扩增出一条202bp的条带，而遗传雄性个体均能扩增出两条带，长度分别为202bp和249bp。
实施例5：温州群体样本检测的验证实验
结果见图9。
图9示出了应用X-specific和Y-specific引物对通过PCR检测大黄鱼温州群体中24尾个体(所使用模版均已通过解剖和组织学确定雌雄性别的个体)的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图。其中，M表示DNA分子量标准DL2000。由图9可以看出，所有待检测的宁波群体大黄鱼个体中，在100bp～250bp区域内，遗传雌性个体均只扩增出一条202bp的条带，而遗传雄性个体均能扩增出两条带，长度分别为202bp和249bp。
可以看出，应用本发明的两对引物鉴别出的大黄鱼的遗传性别与实际情况完全一致。也就是说，采用本发明的引物均能准确的鉴别出大黄鱼的遗传性别，同时证明Dmrt1基因上第5外显子上的两个碱基的变异是大黄鱼遗传性别的分子标记。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学
<120> 一种大黄鱼遗传性别相关的分子标记、鉴定引物及其用途
<130> JMDXL-21026-CNI
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tccctggtta actctgatgt ccacg 25
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agtgccctct ggacagaaac a 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
actgtttcag aaagtaaccg cag 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctggtggcct cacactcagt gtt 23
<210> 5
<211> 915
<212> DNA
<213> 大黄鱼
<400> 5
atgagcaagg acaagccgaa caagcagatg ctggagccca ccagacctct gtcccggtcc 60
aaaggccaga acccccccag gatgcctaag tgctcccgct gtagaaacca tggctatgtc 120
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gctcaggaag aggagcttgg gatttgcagt ccagtgactc tgcccggccc tgatgtgatg 300
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Claims (10)
1.一种大黄鱼遗传性别相关的分子标记，其特征在于，当Dmrt1基因完整ORF全长为915bp时，第5外显子上第84位核苷酸发生了C/A的变异，第87位核苷酸发生了G/A的变异；当Dmrt1基因第5外显子首位有3个碱基的插入，即完整ORF全长为918bp时，第87位核苷酸发生了C/A的变异，第90位核苷酸发生了G/A的变异。
2.如权利要求1所述分子标记，其特征在于，当Dmrt1基因第5外显子上第84位或第87位核苷酸为C即基因型为C/C，同时第87位或第90位核苷酸为G即基因型为G/G的个体，为遗传雌性即性染色体组型是XX的大黄鱼；Dmrt1基因第5外显子上第84位或第87位核苷酸同时存在C和A即基因型为A/C，且第87位或第90位核苷酸同时存在G和A即基因型为A/G，为遗传雄性即性染色体组型是XY的大黄鱼；Dmrt1基因第5外显子上第84位或第87位核苷酸只存在A即基因型为A/A，同时第87位或第90位核苷酸只存在A即基因型为A/A，为超雄性即性染色体组型是YY的大黄鱼。
3.一种用于大黄鱼遗传性别鉴定的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
4.一种用于大黄鱼遗传性别鉴定的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述引物对。
5.一种用权利要求4所述试剂盒或权利要求3所述引物对进行大黄鱼遗传性别鉴定的方法，其特征在于，使用权利要求3所述引物对或权利要求4试剂盒中的引物对，对待检测大黄鱼进行所述分子标记的检测，以确定大黄鱼的遗传性别。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，利用权利要求3所述引物对或权利要求4试剂盒中的引物对，对待测大黄鱼基因组DNA进行PCR扩增；
检测扩增片段的数量和长度，以及，
基于所述扩展片段的数量和长度，确定所述待测大黄鱼的性染色体组型及遗传性别；
当扩增结果在100bp～250bp区域内只有一条202bp的条带、没有249bp的条带时，所述待测个体为遗传性别是雌性即性染色体组型是XX的大黄鱼；而扩增结果在100bp～250bp区域内有两条带，且片段长度分别为202bp和249bp时，所述待测个体为遗传性别是雄性即性染色体组型是XY的大黄鱼；若扩增结果在100bp～250bp区域内只有一条长度为249bp的条带时，所述待测个体为遗传性别是超雄性即性染色体组型是YY的大黄鱼。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：当反应总体积为10μL时，具体反应体系为5μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，上下游引物各1μL，30ng/μL 的DNA模板1μL，加ddH2O补齐至10μL。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃总延伸5min。
9.权利要求1或2所述分子标记，权利要求3所述引物对或权利要求4试剂盒，在大黄鱼育种中的用途。
10.一种大黄鱼辅助育种方法，其特征在于，所述方法包括：通过权利要求5-8任一项所述方法来检测权利要求1或2所述分子标记，以确定待测大黄鱼的遗传性别。
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-
2021
- 2021-10-26 CN CN202111244273.7A patent/CN113897439B/zh active Active
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| 高玉雪: "大黄鱼性别决定候选基因Dmrt1功能的初步研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑, no. 09, pages 052 - 19 * |
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