CN109055575A - 一种用于大黄鱼群体鉴定的snp分子标记 - Google Patents

一种用于大黄鱼群体鉴定的snp分子标记 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记，利用Sequenom MassARRAY SNP分型技术进行分析，包括如下步骤：DNA模板的制备；SNP位点的获得及其扩增引物的合成；PCR扩增反应；利用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP；延伸反应；脱盐树脂纯化延伸产物；将去盐产物导入Assay中，样本表格输入，建板，点样、扫描，MassARRAY分析，质量控制及并输出结果。本发明具有设计灵活、准确性高、技术重现性好、性价比高的优势，可同时对数十个SNP位点进行数百至数千份样本检测，极大地减少了大黄鱼种质资源及群体遗传评判的纷繁复杂性。

Description

一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，尤其是涉及一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记。
技术背景
大黄鱼种群划分较为复杂，数十年来，对大黄鱼种群的划分一直争议不断。另外，由于过度捕捞及生境破坏，大黄鱼野生资源逐渐枯竭，然而，在大黄鱼成功繁育的同时，人工增殖放流、南北接力养殖及网箱逃逸等现象，加之或研究方法或取样差异，导致如今大黄鱼地理种群及种质资源的归属更加复杂，争议很大。鱼类的种群分化对于鱼类种质资源保护及管理意义重大，只有深入了解大黄鱼种群的遗传背景及资源状况，才能更好地保护大黄鱼及做好大黄鱼育种。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)，是指同一位点不同等位基因之间个别核苷酸的差异，数量多，分布广泛，低突变率，具有遗传稳定性，易与基因分型，被认为是应用前景最好的分子标记之一。SNP比较适合于群体间的基因分型及疾病与复杂性状遗传相关等方面的研究，例如，遗传标记、疾病基因的定位、克隆和鉴定、疾病的易感性、个性化医疗及基因多态与疾病相关性分析。DNA的碱基虽然只有A、T、C、G这4种，但SNP是一种二态的分子标记，一般只有两种碱基间的变异，也就是二等位基因。由于SNP的二态性，非此即彼，在生物基因组范围内检测SNPs，一般只需+/-的分析，因此，这一特点非常有助于SNPs基因分型。作为第三代分子标记，单核苷酸多态性(SNPs)是非常理想的构建遗传图谱和辅助育种的优势分子标记，单核苷酸多态性是基因组中最常见的变异形式，在基因组中的分布频率很高，并往往和特定的性状关联。本发明在大黄鱼基因组数据的基础上，成功开发相关SNP标记，分析不同种群大黄鱼的遗传背景，并找到不同群体的特有SNP标记，为进一步的大黄鱼遗传多样性分析、种群鉴定、关联分析和分子标记辅助选择等方面提供了基础资料，一定程度上将减少大黄鱼传统分子标记所走的曲折路径，对于加快大黄鱼的优良品种开发有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有设计灵活、准确性高、技术重现性好、性价比高的优势，可同时对数十个SNP位点进行数百至数千份样本检测，极大地减少了大黄鱼种质资源及群体遗传评判的纷繁复杂性的用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记，SNP分子标记利用Sequenom MassARRAYSNP分型技术进行分析。单核苷酸多态性是基因组中最常见的变异形式，在基因组中的分布频率很高，在品种鉴定、遗传多样性分析、关联分析、构建高密度遗传连锁图谱和分子标记辅助选择均表现出了良好的应用前景，本发明利用Sequenom MassARRAY SNP分型技术进行分析，MassARRAY分子量阵列技术通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质谱相结合，实现基因的分型检测，基于平台的Iplex技术可设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，改变传统单基因检测价格昂贵，耗时长，操作繁琐等劣势，操作程序简单，分型结果具有质谱的高准确性和敏感性，将减少大黄鱼传统分子标记所走的曲折路径，对于加快大黄鱼的优良品种开发有重要意义。
作为优选，SNP分子标记包括如下步骤：
1)DNA模板的制备；
2)SNP位点的获得及其扩增引物的合成；
3)PCR扩增反应：以待测样本DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，获得目标位点的PCR产物；
4)SAP反应：利用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP；
5)延伸反应：利用各组相对应的单碱基延伸引物对消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
6)去盐：脱盐树脂纯化延伸产物；
7)MassARRAY分析：将去盐产物导入Assay中，样本表格输入，建板，点样、扫描，MassARRAY分析，质量控制及并输出结果。
本发明SNP分子标记在大黄鱼基因组数据的基础上，成功开发了43个SNP标记，分析了不同种群大黄鱼的遗传背景，并找到了不同群体的特有SNP标记，具有设计灵活、准确性高、技术重现性好、性价比高的优势，可同时对数十个SNP位点进行数百至数千份样本检测，极大地减少了大黄鱼种质资源及群体遗传评判的纷繁复杂性，向真正意义上的大黄鱼分子标记育种迈进。
进一步优选，SNP位点的获得及其扩增引物的合成的具体步骤为：通过二代测序仪器Illumina/Solexa测序得到大黄鱼全基因组草图，利用GATK软件tisy，从大黄鱼基因组草图中提取全基因组SNP，再利用Quality SNP软件在默认参数下分析scaffold获得大量候选SNP位点，随选取250个候选SNP位点，并从中挑选出60条，确定SNP位点后，以SNP位点为中心截取300bp长度的基因序列，设计扩增引物和延伸引物。
进一步优选，PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul 20uM上游引物、1ul 20uM下游引物、8ul 2.5mM dNTP、5ul 10×buffer、0.5ul5U/ul Taq酶、2.5ng DNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul。
进一步优选，PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸50s，扩增45个循环；72℃总延伸3min。
进一步优选，SAP反应步骤中虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的用量比为100:3.4-4.2。该虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的合理比例能够发挥增益作用，不仅能与虾碱性磷酸酶反应底物中的有机磷或者水解生成的磷酸根络合，避免磷的存在而影响虾碱性磷酸酶的活性，而且还可以与虾碱性磷酸酶中的活性部位结合而提高虾碱性磷酸酶的活性和动力学转化，进而加快虾碱性磷酸酶消化PCR反应体系中剩余的dNTP，使得SNP分子标记准确性高、技术重现性好。
进一步优选，SAP反应步骤中SAP反应程序为37℃孵育30min，85℃灭活5min。
进一步优选，延伸反应的条件为：94℃、30s；94℃、5s，52℃、5s、40个循环，80℃、5s、5个循环；72℃保持5min。
进一步优选，去盐的具体步骤为：将树脂平铺到树脂板中；加16ul水到延伸产物的对应孔内；将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触；离心使树脂沉入孔底部。向单碱基延伸的产物中加入脱盐树脂，对延伸产物进行脱盐纯化，能有效避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰，提高SNP分子标记的准确性。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明SNP分子标记在大黄鱼基因组数据的基础上，成功开发了43个SNP标记，分析了不同种群大黄鱼的遗传背景，并找到了不同群体的特有SNP标记，具有设计灵活、准确性高、技术重现性好、性价比高的优势，可同时对数十个SNP位点进行数百至数千份样本检测，极大地减少了大黄鱼种质资源及群体遗传评判的纷繁复杂性，向真正意义上的大黄鱼分子标记育种迈进；本发明SAP反应能提高虾碱性磷酸酶的活性和动力学转化，进而加快虾碱性磷酸酶消化PCR反应体系中剩余的dNTP，使得SNP分子标记准确性高、技术重现性好。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记，SNP分子标记利用Sequenom MassARRAYSNP分型技术进行分析。单核苷酸多态性是基因组中最常见的变异形式，在基因组中的分布频率很高，在品种鉴定、遗传多样性分析、关联分析、构建高密度遗传连锁图谱和分子标记辅助选择均表现出了良好的应用前景，本发明利用Sequenom MassARRAY SNP分型技术进行分析，MassARRAY分子量阵列技术通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质谱相结合，实现基因的分型检测，基于平台的Iplex技术可设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，改变传统单基因检测价格昂贵，耗时长，操作繁琐等劣势，操作程序简单，分型结果具有质谱的高准确性和敏感性，将减少大黄鱼传统分子标记所走的曲折路径，对于加快大黄鱼的优良品种开发有重要意义。
上述SNP分子标记包括如下步骤：
1)DNA模板的制备
a.取冰冻组织300mg，用小剪刀剪至肌肉组织呈粉末状，并转入2ml的Eppendorf管中，放入电热鼓风干燥箱，50℃干燥10min使组织中酒精完全挥发；
b.将EP管取出，加入550ul组织裂解液(EDTA:SDS＝10:1比例预先配好)，然后分别加入30ul蛋白酶K和5ulRNA酶，震荡3min后，转入恒温水浴锅中，55℃裂解5h，期间每隔30min颠倒混匀一次；
c.取出EP管，转至超净工作台，冷却至室温，加入500ul平衡酚(4℃预冷)，缓慢颠倒10min，使组织液与平衡酚充分混匀；
d.将EP管转入离心机中，12000rpm常温离心10min，转上层水相于新的EP管中；
e.向EP管中加入4℃预冷的酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液500ul，缓慢颠倒混匀10min后，12000rpm常温离心10min，并转上层水相于新EP管中；
f.向EP管中加入氯仿:异戊醇＝24:1的混合液500ul，缓慢颠倒混匀10min后，12000rpm常温离心10min；
g.转上层水相于新的EP管中，加入50ul的Na Ac(浓度＝3mol/L，pH＝5.2)，同时加入1000ul于超低温冰箱预冷(-20℃)的无水乙醇，彻底颠倒混匀10min，然后放置在超低温冰箱(-20℃)沉淀1-2h；
h.此时已经可以观察到DNA絮状沉淀，于10000rpm离心15min，弃去上清液；
i.向EP管中加入1000ul浓度为70％的冷乙醇(4℃)，并于10000rpm离心20min，使DNA沉淀在EP管底部，倒掉上清液，于室温敞口放置直至可见的乙醇挥发殆尽；
j.向EP管中加入100ul TE缓冲液，放入超低温冰箱(-20℃)保存，静置一天以上方可使用，使DNA完全溶解；
2)SNP位点的获得及其扩增引物的合成
通过二代测序仪器Illumina/Solexa测序得到大黄鱼全基因组草图，利用GATK软件tisy，从大黄鱼基因组草图中提取全基因组SNP，再利用Quality SNP软件在默认参数下分析scaffold获得大量候选SNP位点，随选取250个候选SNP位点，并从中挑选出60条，确定SNP位点后，以SNP位点为中心截取300bp长度的基因序列，将得到的基因序列，复制到文本文件，采用AssayDesigner3.1软件设计扩增引物和延伸引物；
3)PCR扩增反应：以待测样本DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，获得目标位点的PCR产物，PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul 20uM上游引物、1ul 20uM下游引物、8ul2.5mM dNTP、5ul 10×buffer、0.5ul 5U/ul Taq酶、2.5ng DNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul；PCR扩增反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸50s，扩增45个循环；72℃总延伸3min；
4)SAP反应：利用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP，虾碱式磷酸酶处理反应体系为7ul(每一个反应)：0.17μl 10×Buffer、0.3μl1.7U/ul SAP、二氯烷基铝、5μl扩增产物DNA、灭菌蒸馏水加至7μl；SAP反应程序为37℃孵育30min，85℃灭活5min；
5)延伸反应：利用各组相对应的单碱基延伸引物对消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
6)去盐：脱盐树脂纯化延伸产物；
7)MassARRAY分析：将去盐产物导入Assay中，样本表格输入，建板，点样、扫描，MassARRAY分析，质量控制及并输出结果。
SNP分子标记在大黄鱼基因组数据的基础上，成功开发了43个SNP标记，分析了不同种群大黄鱼的遗传背景，并找到了不同群体的特有SNP标记，具有设计灵活、准确性高、技术重现性好、性价比高的优势，可同时对数十个SNP位点进行数百至数千份样本检测，极大地减少了大黄鱼种质资源及群体遗传评判的纷繁复杂性，向真正意义上的大黄鱼分子标记育种迈进。
其中，SAP反应步骤中虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的用量比为100:3.4-4.2。该虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的合理比例能够发挥增益作用，不仅能与虾碱性磷酸酶反应底物中的有机磷或者水解生成的磷酸根络合，避免磷的存在而影响虾碱性磷酸酶的活性，而且还可以与虾碱性磷酸酶中的活性部位结合而提高虾碱性磷酸酶的活性和动力学转化，进而加快虾碱性磷酸酶消化PCR反应体系中剩余的dNTP，使得SNP分子标记准确性高、技术重现性好。
其中，延伸反应的条件为：94℃、30s；94℃、5s，52℃、5s、40个循环，80℃、5s、5个循环；72℃保持5min。
其中，去盐的具体步骤为：将树脂平铺到树脂板中；加16ul水到延伸产物的对应孔内；将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触；离心使树脂沉入孔底部。向单碱基延伸的产物中加入脱盐树脂，对延伸产物进行脱盐纯化，能有效避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰，提高SNP分子标记的准确性。
实施例2：
实验大黄鱼群体：120尾大黄鱼在2011-2012年12月分别采自浙江舟山群岛的东极、福建淳浦、福建宁德及海南澄迈。
SNP分子标记步骤：
1)DNA模板的制备；
2)SNP位点的获得及其扩增引物的合成：通过二代测序仪器Illumina/Solexa测序得到大黄鱼全基因组草图，利用GATK软件tisy，从大黄鱼基因组草图中提取全基因组SNP，再利用Quality SNP软件在默认参数下分析scaffold获得大量候选SNP位点，随选取250个候选SNP位点，并从中挑选出60条，确定SNP位点后，以SNP位点为中心截取300bp长度的基因序列，设计扩增引物和延伸引物，获得的引物如下表1所示；
表1采用AssayDesigner3.1软件设计获得的扩增引物和延伸引物
3)PCR扩增反应：以待测样本DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，获得目标位点的PCR产物，PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul 20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul 2.5mM dNTP、5ul 10×buffer、0.5ul 5U/ul Taq酶、2.5ng DNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul；PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸50s，扩增45个循环；72℃总延伸3min；
4)SAP反应：利用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP，其中虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的用量比为100:3.8，SAP反应程序为37℃孵育30min，85℃灭活5min；
5)延伸反应：利用各组相对应的单碱基延伸引物对消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物，延伸反应的条件为：94℃、30s；94℃、5s，52℃、5s、40个循环，80℃、5s、5个循环；72℃保持5min；
6)去盐：将树脂平铺到树脂板中；加16ul水到延伸产物的对应孔内；将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触；离心使树脂沉入孔底部；
7)MassARRAY分析：将去盐产物导入Assay中，样本表格输入，建板，点样、扫描，MassARRAY分析，质量控制及并输出结果。
SNP位点的群体基因型分析结果：
利用MassARRAY系统做SNP分型，加对引物中，57对引物表现出多态性并成功分型。一共有AA，CA，CC，CT，TT，GG，GA，GT，AT，GC 10个基因型，表明57个，位点具有多态性。60个SNP中，转换占48％，共29个；颠换占52％，共31个。共检测到147个等位基因位点。对于全部SNP位点AA基因型(AA，CC，TT)和杂合子比例高于AB基因型(CA，CT，GA，GT，AT，GC)。147个SNP位点的最小基因频率范围从0.378到0.497。对于120条大黄鱼个体CC，TT基因型和CT等位基因频率明显高于AB基因型和AG等位基因频率。AT，GC基因型为稀有突变型。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记利用Sequenom MassARRAY SNP分型技术进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记包括如下步骤：
1)DNA模板的制备；
2)SNP位点的获得及其扩增引物的合成；
3)PCR扩增反应；
4)SAP反应：利用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP；
5)延伸反应；
6)去盐：脱盐树脂纯化延伸产物；
7)MassARRAY分析：将去盐产物导入Assay中，样本表格输入，建板，点样、扫描，MassARRAY分析，质量控制及并输出结果。
3.根据权利要求2所述的一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP位点的获得及其扩增引物的合成的具体步骤为：通过二代测序仪器Illumina/Solexa测序得到大黄鱼全基因组草图，利用GATK软件tisy，从大黄鱼基因组草图中提取全基因组SNP，再利用Quality SNP软件在默认参数下分析scaffold获得大量候选SNP位点，随选取250个候选SNP位点，并从中挑选出50条，确定SNP位点后，以SNP位点为中心截取300bp长度的基因序列，设计扩增引物和延伸引物。
4.根据权利要求2所述的一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记，其特征在于：所述PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul 20uM上游引物、1ul 20uM下游引物、8ul 2.5mM dNTP、5ul 10×buffer、0.5ul 5U/ul Taq酶、2.5ng DNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul。
5.根据权利要求2所述的一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记，其特征在于：所述PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸50s，扩增45个循环；72℃总延伸3min。
6.根据权利要求2所述的一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记，其特征在于：所述SAP反应步骤中虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的用量比为100:3.4-4.2。
7.根据权利要求2所述的一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记，其特征在于：所述SAP反应步骤中SAP反应程序为37℃孵育30min，85℃灭活5min。
8.根据权利要求2所述的一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记，其特征在于：所述延伸反应的条件为：94℃、30s；94℃、5s，52℃、5s、40个循环，80℃、5s、5个循环；72℃保持5min。
9.根据权利要求2所述的一种用于大黄鱼群体鉴定的SNP分子标记，其特征在于：所述去盐的具体步骤为：将树脂平铺到树脂板中；加16ul水到延伸产物的对应孔内；将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触；离心使树脂沉入孔底部。
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