CN109680097A - 一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于油菜育种和分子生物学技术领域，具体涉及一种油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记及其应用，该分子标记综合使用可预测油菜菌核病茎杆抗性的相对高低。以油菜单株的总DNA为模板，利用上述两个引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离，可分别获得一条特异条带，能同时扩增出上述两条特异条带的个体判断为含有标记对应抗病QTL的材料，预测其茎杆抗性水平相对较高，可以保留进入后期的抗性鉴定。本发明开发的分子标记可用于油菜菌核病茎杆抗性的鉴定和预测，操作简便，方法易行，解决了常规育种方法中存在的必须到后期才能选择鉴定等问题，减轻了后期工作量，加快了油菜菌核病抗性改良的育种进程。
Description
技术领域
本发明属于油菜育种和分子生物学领域，具体涉及一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记，同时还涉及该分子标记在选育抗菌核病油菜中的应用。
背景技术
中国是油菜(甘蓝型油菜)的种植大国，占全世界油菜种植面积的三分之一，但我国油菜的单产一直处于世界平均水平，每年因油菜菌核病危害而导致的油菜减产约10～80％。选育抗病品种是解决油菜菌核病危害最经济有效的途径，育种家们通过系统选育，培育了一批耐病的油菜品种，比如‘中油821’和‘中双’系列品种等，这些品种的推广种植在一定程度上减轻了菌核病给生产带来的危害。但是在油菜抗菌核病育种过程中存在几个关键难点，主要是无优质抗源、无可用的分子标记、后期抗性鉴定工作量大等，致使油菜抗菌核病育种进程缓慢。
利用一些具有部分抗性的油菜材料，国内外学者先后定位了很多与油菜菌核病抗性相关的QTL，这些QTL分布在C01，C02，C03，C06，C09，A02，A03，A08,A09,A10等染色体上，近来有学者还通过全基因组关联分析、转录组测序等技术，在油菜中筛选到一些跟菌核病抗性相关的基因。尽管找到诸多QTL，但可利用于油菜抗菌核病育种的分子标记目前尚鲜有报道。
发明内容
本发明提供一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记，该分子标记可直接在油菜菌核病茎杆抗性育种中应用，通过该分子标记可对油菜进行早期鉴定和辅助选择，可尽早淘汰不含标记所在抗病QTL的个体，选择出含抗病QTL、具有较好抗性的个体进入后期的抗性鉴定程序，减轻后期表型鉴定及繁育工作，有效提高选择效率。
获得上述与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记的具体过程如下：
1)以一份感菌核病甘蓝与一份抗病甘蓝(Brassica incana)杂交产生F1代，F1代自交种通过组培手段将每个F2基因型扩繁至20个拷贝，生根后种植于大田，获得149个F2代无性系。
2)于苗期提取每个F2无性系幼嫩叶片的DNA进行全基因组分子标记，采用图谱构建软件构建甘蓝的遗传连锁图谱；于开花后2周进行茎杆菌核病抗性鉴定，获得表型数据。
3)采用QTL扫描软件，结合遗传连锁图谱与表型数据进行QTL扫描，在C09染色体上获得2个主效抗病QTL。
4)将主效QTL“qC09-2”侧翼标记与甘蓝参考基因组对应，找出QTL对应物理区间，从中设计SSR引物，并将在甘蓝F2群体中有多态性的标记加密到图谱中。
5)加密后的QTL“qC09-2”区间覆盖6个标记，通过在抗病甘蓝、感病甘蓝和3份油菜中扩增鉴定，其中在抗病甘蓝与其他材料间存在多态性的两个分子标记为本发明所述与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记。
本发明所述的一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记，包括SWUC797和SWUC934，所述SWUC797和SWUC934的正向引物序列和反向引物序列依次如下所示：
| 标记名称 | 正向引物序列(5'→3') | 反向引物序列(5'→3') |
| SWUC797 | GGACTTACTGCAACGGGAAA | ATTCTCTCGAACTTCGCCCT |
| SWUC934 | TTCACACTCCCGATCTCTCC | AGATTCCCTCCCCAACAAGT |
6.本发明所述分子标记在鉴定油菜菌核病抗性中的应用，优选的，所述分子标记鉴定油菜菌核病抗性在油菜抗菌核病育种中的应用。
上述分子标记在鉴定油菜菌核病抗性中应用的方法如下：
(1)以待鉴定油菜单株总DNA为模板，利用SWUC797和SWUC934分别进行PCR扩增分别得到扩增产物①和②；
(2)将扩增产物①和②分别进行凝胶电泳，若扩增产物①中观察到180bp的特异条带同时扩增产物②中观察到175bp的特异条带；则判断待鉴定单株为具备菌核病抗性(含有抗病QTL“qC09-2”)的单株。
一种鉴定油菜菌核病抗性的试剂盒，包括权利要求1所述分子标记中的SWUC797和SWUC934。
本发明通过在抗菌核病的野生甘蓝中初步确定了抗菌核病QTL，然后对多个重要的QTL区间进行标记开发与加密，缩小QTL区间最终获得一些与抗病位点连锁度高、可用于油菜育种的标记。本发明的分子标记的应用可极早判断植株是否具有抗病QTL位点，去除不含抗病QTL的植株，保留含抗病QTL的植株进行成株期的茎杆抗性鉴定以及后代繁育。本发明可增强选择的目标性，大幅度减小后期抗性鉴定工作量，提高选择效率。
附图说明
图1标记SWUC797和SWUC934在抗菌核病QTL“qC09-2”中的位置展示图。说明：箭头所指为QTL“qC09-2”覆盖区域最边界的标记，下划线表示标记SWUC797和SWUC934所在位置。
图2标记SWUC797和SWUC934在油菜中的扩增情况展示图。说明：箭头指示标记特异条带所在位置；泳道1～6分别代表marker、感病甘蓝、抗病甘蓝、油菜商品种“中双9号”、油菜商品种“中油821”、油菜育种系“HAUS7”；*代表扩增出标记特异条带的油菜个体。
图3各种类型油菜的菌核病茎秆抗性展示。说明：CK代表油菜对照；**代表在P＝0.05水平达到显著差异。
具体实施方式
以下为本发明方法的一种具体实施方式，但并不是对本发明方法的限定，任何不超离本发明实质内容的变换，仍应属于本发明的保护范围。
实施例1
一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记，通过以下方法获得：
以一份感菌核病甘蓝与一份抗病甘蓝B.incana发展的F2无性系分离群体为例，详细说明获得与茎杆抗性紧密相关分子标记的方法，具体如下：
(1)群体构建及表型鉴定
以一份感菌核病甘蓝与一份抗病甘蓝B.incana杂交产生F1代，F1代自交种萌发后通过组培技术将每个F2基因型扩繁至20个拷贝以上，生根后种植于大田，获得149个F2代无性系。田间种植采用随机区组设计，设置2个田间重复，种植2年。茎杆菌核病抗性鉴定在开花后2周进行，采用离体茎杆室内接种法进行鉴定(参照“梅家琴等，一种植物离体茎杆接种鉴定菌核病抗性的方法，ZL201210229952.1”)，每次每个无性系鉴定3～5株，3次重复。
(2)遗传连锁图谱构建与QTL扫描
于苗期提取149个F2无性系幼嫩叶片，用CTAB法提取DNA；用油菜通用SSR引物以及根据甘蓝参考基因组设计的SSR引物进行PCR扩增；采用JoinMap3软件构建甘蓝遗传连锁图谱；然后用WinQTL2.5Cartographer 2.5软件结合图谱和表型数据，采用复合区间作图程序(CIM)扫描抗病QTL位点，最终在甘蓝C09染色体获得2个主效抗病QTL，分别命名为“qC09-1”和“qC09-2”。两个QTL表现为加性效应，分别可解释表型变异的16.7％和16.1％。
(3)QTL区间标记加密
利用QTL“qC09-2”的侧翼标记引物序列，在公共数据库(http://brassicadb.org/brad/index.php)中用blastn查询各QTL在甘蓝参考基因组上所对应的物理区间，将区间中的gDNA序列下载，然后各均分为30小段，将每小段序列输入primer5软件中设计一对SSR引物，QTL“qC09-2”对应物理区间共均匀设计30对SSR引物。利用F2群体的两个亲本对引物进行多态性检测，获得8个具有多态性的标记，再在“(一)”中所述的F2群体DAN中扩增这8个标记，将结果与原有分子标记结果一起输入JoinMap3软件重新构建甘蓝遗传连锁图谱，并重新扫描抗病QTL位点。最终有5个标记成功加密到两个QTL区间中。
(4)功能标记转化与检测
将QTL“qC09-2”加密后重新进行QTL检测，以对QTL位置及效应进行修正。新获得的QTL“qC09-2”解释的表型变异度为18.8％，置信区间位于原有QTL区间内并有所缩短，该区间覆盖6个SSR标记，其中2个标记为第一次QTL扫描到的标记，另外4个为新加密标记。将6个标记在抗病甘蓝、感病甘蓝和3份油菜中进行PCR扩增，发现其中4个在抗病甘蓝和油菜之间无多态性，另外2个有多态性，其引物序列如下：
| 标记名称 | 正向引物序列(5'→3') | 反向引物序列(5'→3') |
| SWUC797 | GGACTTACTGCAACGGGAAA | ATTCTCTCGAACTTCGCCCT |
| SWUC934 | TTCACACTCCCGATCTCTCC | AGATTCCCTCCCCAACAAGT |
实施例2
一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记在油菜抗菌核病育种中的应用，其步骤是：
以利用抗菌核病甘蓝B.incana与一份感病白菜杂交，经过胚挽救及染色体加倍获得人工合成甘蓝型油菜，以其自交产生的221个F2代植株为研究材料，利用实施例1中所发展的标记进行鉴定，步骤如下：
1)以工合成甘蓝型油菜单株DNA为模板；
2)利用下述引物分别对模板进行PCR过程：
| 标记名称 | 正向引物序列(5'→3') | 反向引物序列(5'→3') |
| SWUC797 | GGACTTACTGCAACGGGAAA | ATTCTCTCGAACTTCGCCCT |
| SWUC934 | TTCACACTCCCGATCTCTCC | AGATTCCCTCCCCAACAAGT |
3)PCR反应体系：总体积为10ul，具体成分如下：
4)PCR扩增程序：94℃5min，[94℃45s，55℃45s，72℃1min]×35循环，72℃10min。运行完毕后4℃条件下保存。
5)PCR扩增产物经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，标记SWUC797产生180bp的特异条带，标记SWUC934获得175bp的特异条带；同时出现上述两种条带的个体，判断为含有抗病QTL“qC09-2”的个体，选择其进入后期的茎秆抗性鉴定，供进一步育种选择培育为抗菌核病油菜。
根据上述步骤，标记选择及抗性鉴定结果如下：
281份人工合成甘蓝型油菜中，标记SWUC797和标记SWUC934均能扩增出特异条带的材料共52份，判断为含有QTL“qC09-2”，其茎杆病斑长度平均值为5.0±0.67cm(范围：3.7～6.3cm)；均没有扩增出两个标记的特异条带的材料共79份，判断为不含QTL“qC09-2”，随机选择其中20份进行茎秆抗性鉴定，其茎杆病斑长度平均值为6.2±0.94cm(范围：5.0～7.2cm)；其余90份材料为仅有一个标记扩增出抗病特异条带，无法判断其是否含有QTL“qC09-2”，未进行茎秆抗性鉴定。结果表明，同时出现标记SWUC797和标记SWUC934特异条带的材料，其病斑长度显著小于没有出现特异条带的病斑长度(P<0.05)(见图3)。
实施例3
本实施例与实施例2的区别在于，本实施例中油菜群体不同，其他均与实施例2相同。
以利用抗病甘蓝B.incana与甘蓝型油菜中双11号杂交，染色体加倍后获得六倍体，与中双11号回交一轮获得BC1F1，通过自交获得BC1F2，并通过染色体数目鉴定获得2n＝38的甘蓝型油菜单株，对其连续自交并进行抗性鉴定和筛选，获得BC1F6世代255份材料，利用实施例1中所发展的标记、根据实施例2中步骤对BC1F6世代材料进行鉴定，结果如下：
255份BC1F6材料中，标记SWUC797和标记SWUC934均能扩增出特异条带的材料共52份，判断为含有QTL“qC09-2”，其茎杆病斑长度平均值为4.4±0.82cm(范围：2.4～6.3cm)；均没有扩增出两个标记的特异条带的材料共77份，判断为不含QTL“qC09-2”，随机选择其中20份进行茎秆抗性鉴定,其茎杆病斑长度平均值为5.4±0.90cm(范围：4.1～7.1cm)；其余26份材料为仅有一个标记扩增出抗病特异条带，无法判断其是否含有QTL“qC09-2”。结果表明，同时出现标记SWUC797和标记SWUC934特异条带的材料，其病斑长度显著小于没有出现特异带型的病斑长度(P<0.05)(见图3)。
实施例4
本实施例与实施例3的区别在于，本实施例中油菜群体不同，其他均与实施例2相同。
对实施例3中筛选出的含有QTL“qC09-2”且菌斑长度最小的10个BC1F6个体分别自交，获得10个BC1F7家系。每个家系随机选择30个单株，利用标记SWUC797和SWUC934进行鉴定，发现其中4个家系的所有单株均能扩增出两个标记的特异条带,说明对应家系的QTL“qC09-2”已达到纯合状态。对标记鉴定的材料进行抗性鉴定并以家系为单位计算平均值，各家系茎杆病斑长度为4.4～5.4cm，各株系变异系数范围为13.9～17.8％；另外6个家系的材料，仅部分单株能同时扩增出两个标记的特异条带，说明对应家系的QTL“qC09-2”处于杂合态；对标记鉴定的材料进行抗性鉴定并以家系为单位计算平均值，各家系茎杆病斑长度值为5.0～6.0cm(见图3)，且家系内单株间变异范围较大，介于17.9～26.1％，需进行下一轮鉴定和筛选。
上述鉴定结果表明，在育种中通过标记SWUC797和SWUC934的鉴定与筛选，根据对应180bp和175bp特异条带的出现情况，可有效预判抗病QTL“qC09-2”的存在与否、杂合与纯合状态，从而减轻后期筛选鉴定的工作量，提高下一轮选择的效率和准确性，加快育种进程。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种与油菜菌核病茎杆抗性紧密相关的分子标记，其包括标记SWUC797和标记SWUC934，所述SWUC797正向引物序列为GGACTTACTGCAACGGGAAA，其反向引物序列为ATTCTCTCGAACTTCGCCCT；所述SWUC934的正向引物序列为TTCACACTCCCGATCTCTCC，其反向引物序列为AGATTCCCTCCCCAACAAGT。
2.权利要求1所述分子标记在鉴定油菜菌核病抗性中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述分子标记鉴定油菜菌核病抗性在油菜抗菌核病育种中的应用。
4.一种鉴定油菜菌核病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以待鉴定油菜单株总DNA为模板，利用权利要求1所述分子标记中的SWUC797和SWUC934分别进行PCR扩增分别得到扩增产物①和②；
（2）将扩增产物①和②分别进行凝胶电泳，若扩增产物①中观察到180bp的特异条带同时扩增产物②中观察到175bp的特异条带；则判断待鉴定单株为具备菌核病抗性的单株。
5.一种鉴定油菜菌核病抗性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述分子标记中的SWUC797和SWUC934。
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