CN112410436B - 一种许氏平鮋耐低氧个体筛选的分子标记及筛选方法 - Google Patents

一种许氏平鮋耐低氧个体筛选的分子标记及筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112410436B
CN112410436B CN202011342083.4A CN202011342083A CN112410436B CN 112410436 B CN112410436 B CN 112410436B CN 202011342083 A CN202011342083 A CN 202011342083A CN 112410436 B CN112410436 B CN 112410436B
Authority
CN
China
Prior art keywords
screening
sebastes schlegeli
low
schlegeli
oxygen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011342083.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112410436A (zh
Inventor
贾玉东
孟振
高云涛
徐荣静
李丁军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Original Assignee
Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences filed Critical Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority to CN202011342083.4A priority Critical patent/CN112410436B/zh
Publication of CN112410436A publication Critical patent/CN112410436A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112410436B publication Critical patent/CN112410436B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种许氏平鮋耐低氧个体筛选的分子标记及筛选方法，从而为许氏平鮋网箱和大型设施化平台等模式下提供优良养殖品种的筛选标记，进而为鱼类绿色健康养殖提供有效的技术手段。本发明先提供一种许氏平鮋耐低氧相关的微卫星分子标记，所述的微卫星分子标记用于筛选耐低氧的许氏平鮋个体亲本。本发明还提供一种筛选耐低氧的许氏平鮋个体亲本的方法，是使用荧光标记的PCR扩增引物检测待检测个体的基因组DNA，扩增产物进行自动荧光检测；检测PCR扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型。本发明筛选获得的许氏平鮋耐低氧性能相关的微卫星标记，并将其用于耐低氧性能的亲本的筛选，从而加快许氏平鮋的遗传育种选育速度。

Description

一种许氏平鮋耐低氧个体筛选的分子标记及筛选方法
技术领域
本发明属于水产养殖遗传育种技术领域，具体涉及一种许氏平鮋耐低氧个体筛选的分子标记及筛选方法。
背景技术
许氏平鮋(Sebastes schlegelii)属于鮋形目、鮋科(Scorpaenidae)，平鮋属，卵胎生岩礁性鱼类，分布于西北太平洋近岸，为我国东黄海区常见底层经济鱼类之一。随着过度捕捞与环境恶化，其自然资源量不断下降，目前已成为人工养殖与增殖放流的主要鱼种之一，在韩国，许氏平鮋现已成为产量仅次于牙鲆的主要海水养殖鱼类。2003年，韩国养殖许氏平鲉产量高达23711吨。在我国，许氏平鲉由于味道鲜美，经济价值高，生长较快，且耐温范围广泛(1℃-28℃)，目前在北方沿大连、烟台、威海、青岛离岸网箱和大型养殖平台广泛养殖。
然而，离岸网箱和大型养殖平台养殖模式不同于陆基工厂化和池塘养殖模式，虽然养殖环境自然生态，但是环境因子突变如浪流温氧突变，会对许氏平鮋生长存活产生显著影响。在诸多环境因子中，温度和溶氧是最重要环境因素，许氏平鮋作为岩礁性鱼类，溶氧突变对其摄食、生长存活影响显著，且随着环境温度改变，水体中溶氧产生显著改变，进而影响其正常生理功能。因此在离岸网箱和大型设施化平台养殖模式下，选择具有较强耐低氧能力许氏平鮋，是保证其健康养殖的关键。Mu et al(2017)报道了许氏平鮋最适溶氧浓度为7.5mg/L，同时低氧胁迫引起相关基因表达水平改变，但其对许氏平鮋低氧耐受能力并没有进行详细研究。对许氏平鮋低氧耐受个体如何筛选，目前尚未有研究和系统报道，因此建立评价许氏平鮋低氧耐受能力方法，进而筛选出耐低氧能力个体，具有显著产业应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种许氏平鮋耐低氧个体筛选的分子标记及筛选方法，从而为许氏平鮋网箱和大型设施化平台等模式下提供优良养殖品种的筛选标记，进而为鱼类绿色健康养殖提供有效的技术手段。
本发明首先提供一种许氏平鮋耐低氧相关的微卫星分子标记，所述的分子标记的核苷酸序列信息如下：
AGTGAGCGTGAAACGGCCAAGGAACCGTGCGGCTGAAATGCGTGACTTTGTTACTCTTCCAGGAAGCTTTCAAGAGCAACACCTGGACAACCATCACATTCTGGCCTGGAC(GAA)nCTTGTTCTGGCCCTGCTGCCGCTGAGTTGTGCGTGAAAGGTGGCCCGACATGGCTAGGGCTGCCTGGTGCACTGGTTTCACAATCTTCGCTCGGACGTGGAGAAGATGAAGTCAAAGGTGAAGGCCATTTTTCCTTGATTTTTCACCGCAGGGCCTGGTGTCCCGGGCCCGGATGCAATGATAGACAAGCATTTAACCCGCCTGGTT；
其中n为自然数4-9；
所述的微卫星分子标记用于筛选耐低氧的许氏平鮋个体亲本；
本发明另一个方面是提供一种筛选耐低氧的许氏平鮋个体亲本的方法，是通过检测待筛选个体中上述微卫星标记的GAA重复次数为5和7；
所述的方法，是通过PCR引物对筛选个体的核酸样品进行扩增后，再对扩增产物进行测序后，对序列进行分析完成的。
作为实施例的一种具体记载，其中PCR扩增的引物的序列信息如下：
上游引物：5′-CCAGGAAGCTTTCAAGAGCAAC-3′(SEQ ID NO:2)；
下游引物：5′-CGTCCGAGCGAAGATTGTGAAAC-3′(SEQ ID NO:3)；
上述引物扩增产物，其中基因型为165/171的个体相比于基因型为165/165、171/171和165/177的个体具有更好的耐低氧性能。
本发明还提供一种筛选耐低氧的许氏平鮋个体亲本的方法，是使用荧光标记的PCR扩增引物检测待检测个体的基因组DNA，扩增产物进行自动荧光检测；检测PCR扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型。
本发明筛选获得的许氏平鮋耐低氧性能相关的微卫星标记，并将其用于耐低氧性能的亲本的筛选，从而加快许氏平鮋的遗传育种选育速度。
附图说明
图1：许氏平鮋临界氧分压溶氧浓度图；
图2：许氏平鮋失去平衡点溶氧浓度图；
图3：165/165基因型分型结果图，
图4：165/171基因型分型结果图，
图5：165/177基因型分型结果图，
图6：171/171基因型分型结果图，
图7：耐低氧许氏平鮋临界氧分压溶氧浓度图，
图8：耐低氧许氏平鮋失去平衡点溶氧浓度图，
图9：耐低氧许氏平鮋子代临界氧分压溶氧浓度图，
图10：耐低氧许氏平鮋子代失去平衡点溶氧浓度图。
具体实施方式
本发明通过长期的研究建立了许氏平鮋耐低氧个体筛选方法，通过对许氏平鮋低氧耐受能力测定方法确定了耐低氧的群体，并通过对耐低氧个体进行微卫星标记检测，最终筛选到耐低氧特异微卫星标记。
实施例1：筛选耐受低氧的许氏平鮋个体
1、许氏平鮋低氧耐受能力测定
选取100尾体重96±5.9克许氏平鮋，分别放养在5个圆形测试实验桶内(100L水体，20尾/桶)，通过停水，停气和透明塑料膜封闭等方式，观察许氏平鮋运动和呼吸行为，同时利用溶氧仪检测水体中溶解氧的变化。在运动行为上，低氧敏感的个体首先出现朝水体表面游动“浮头”现象、呼吸频率升高，随着低氧胁迫加剧，腹部出现翻转、失去平衡(LOE)。而对低氧耐受能力强的个体，较晚出现上述行为现象。通过溶氧仪记录水体中溶解氧变化，根据其代谢率和溶氧水平变化做图，采用“双线法(two-segmented straightlines)”求出MO2随溶氧下降而出现显著下降拐点，即为Pcrit(表示随溶氧水平的降低，鱼体不能维持其静止代谢率(MO2rest)时的水体溶氧水平)。
通过行为学观察，结合计算，得出许氏平鮋Pcrit时溶解氧为3.31±0.11mg/L(图1)，失去平衡点(LOE)溶解氧浓度为2.42±0.10mg/L(图2)。
2、耐低氧个体筛选方法
将Pcrit和LOE做为筛选耐低氧个体的两个重要指标。具体操作如下。将实验鱼放置圆形实验桶内(100L水体，20尾/桶)，将溶氧缓慢降低至3.31±0.11mg/L和2.42±0.10mg/L，较晚出现“浮头”和腹部翻转、失去平衡的个体，初步判断为耐低氧个体；最早出现“浮头”和腹部翻转的个体为低氧敏感个体。最终筛选出耐受低氧的种群和非耐受种群进行进一步分子标记分析。
实施例2：微卫星标记分析
选取耐低氧和低氧敏感许氏平鮋鳍条，置于1.5mL离心管中，在每个装有鳍条的离心管中加入500μL裂解液和15μL蛋白酶K，55℃水浴裂解1小时，期间轻摇数次以加速裂解。将裂解好的离心管取出，加入500μL酚：氯仿：异戊醇，颠倒轻摇10min,12000转离心10min，取上清液450μL加入提前准备好对应编号装有500μL酒精的离心管中，轻摇30次，12000转离心5min，可见白色DNA沉淀于离心管底部。倒掉离心管中的液体，将DNA沉淀晾干，加入100μLddH2O,涡旋两次使DNA充分溶解。
使用发明人所在的实验室分离的微卫星位点对提取的许氏平鮋基因组DNA进行PCR扩增，反应体系为15μL，包括10×buffer1.5μL、dNTP0.8μL、上下游引物各0.6μL，其中在上游引物5′端标记荧光素FAM、模板DNA1μL、ddH2O 11.3μL，最后加入rTaq酶0.2μL。反应程序为95℃10分钟，95℃变性、54℃复性、72℃延伸35个循环，72℃10分钟后冷却。用ABI3730XLDNA分析仪对PCR产物进行自动荧光检测。
从15个微卫星位点中筛选确定位点F0768在许氏平鮋低氧耐受种群和非耐受种群中具有明显的基因型差异。
微卫星位点F0768的核心重复序列为(GAA)n，其中n为4-9；其核心重复序列重复4次的序列信息如下：
AGTGAGCGTGAAACGGCCAAGGAACCGTGCGGCTGAAATGCGTGACTTTGTTACTCTTCCAGGAAGCTTTCAAGAGCAACACCTGGACAACCATCACATTCTGGCCTGGAC GAA GAA GAA GAA CTTGTTCTGGCCCTGCTGCCGCTGAGTTGTGCGTGAAAGGTGGCCCGACATGGCTAGGGCTGCCTGGTGCACTGGTTTCACAATCTTCGCTCGGACGTGGAGAAGATGAAGTCAAAGGTGAAGGCCATTTTTCCTTGATTTTTCACCGCAGGGCCTGGTGTCCCGGGCCCGGATGCAATGATAGACAAGCATTTAACCCGCCTGGTT(SEQ ID NO:1)；
设计了用于检测GAA重复的引物对，其序列信息如下：
上游引物：5′-CCAGGAAGCTTTCAAGAGCAAC-3′(SEQ ID NO:2)；
下游引物：5′-CGTCCGAGCGAAGATTGTGAAAC-3′(SEQ ID NO:3)；
其中上游引物的5′端标记荧光素FAM，以方便进行用ABI3730XLDNA分析仪对PCR产物进行自动荧光检测。
结果表明，使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的引物对检测F0768位点，在许氏平鮋群体中能扩增出165/165(图3)、165/171(图4)、165/177(图5)、171/171(图6)基因型。其中基因型为165/171的个体相比于基因型为165/165、171/171和165/177的个体具有更好的耐低氧性能。因此，使用微卫星位点F0768来筛选许氏平鮋。
实施例3：使用F0768位点的165/171基因型筛选耐低氧性能的许氏平鮋
选取健康、发育良好，无病无伤、无畸形的许氏平鮋，取鱼体鳍条样本，提取基因组DNA，利用本发明的微卫星位点F0768标记筛选出耐低氧许氏鲆鮋，进行低氧耐受能力测试。结果表明利用微卫星位点F0768筛选出的许氏鲆鮋，其临界氧分压(Pcrit)(图7)和失去平衡点(LOE)(图8)的溶氧溶度都低于正常组3.31±0.11mg/L和2.42±0.10mg/L,这表明利用该位点筛选耐低氧许氏平鮋结果可靠。
将筛选的低氧耐受许氏平鮋，选取发育良好，无病无伤、无畸形、性腺发育良好的作为雌雄亲本，进行亲鱼的养殖培育，产卵受精，构建耐低氧家系。当仔鱼养殖规格达到20g左右时，进行低氧性状测试实验。结果表明许氏平鮋耐低氧子代的临界氧分压(Pcrit)(图9)和失去平衡点(LOE)(图10)的溶氧溶度和亲本无显著差异。
上述的结果表明，采用本发明技术筛选的耐低氧许氏平鮋具有养殖成活率高、死亡率低、生长速度较快的特点，适合在网箱和大型养殖平台养殖许氏平鮋推广应用。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 一种许氏平鮋耐低氧个体筛选的分子标记及筛选方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtgagcgtg aaacggccaa ggaaccgtgc ggctgaaatg cgtgactttg ttactcttcc 60
aggaagcttt caagagcaac acctggacaa ccatcacatt ctggcctgga cgaagaagaa 120
gaacttgttc tggccctgct gccgctgagt tgtgcgtgaa aggtggcccg acatggctag 180
ggctgcctgg tgcactggtt tcacaatctt cgctcggacg tggagaagat gaagtcaaag 240
gtgaaggcca tttttccttg atttttcacc gcagggcctg gtgtcccggg cccggatgca 300
atgatagaca agcatttaac ccgcctggtt 330
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaggaagct ttcaagagca ac 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtccgagcg aagattgtga aac 23

Claims (3)

1.一种筛选耐低氧的许氏平鮋个体的方法，其特征在于，所述的方法是通过检测与许氏平鮋耐低氧相关的微卫星分子标记来筛选个体；所述的微卫星分子标记的核苷酸序列信息如下：
AGTGAGCGTGAAACGGCCAAGGAACCGTGCGGCTGAAATGCGTGACTTTGTTACTCTTCCAGGAAGCTTTCAAGAGCAACACCTGGACAACCATCACATTCTGGCCTGGAC（GAA）nCTTGTTCTGGCCCTGCTGCCGCTGAGTTGTGCG
TGAAAGGTGGCCCGACATGGCTAGGGCTGCCTGGTGCACTGGTTTCACAATCTTCGCTCGGACGTGGAGAAGATGAAGTCAAAGGTGAAGGCCATTTTTCCTTGATTTTTCACCGCAGGGCCTGGTGTCCCGGGCCCGGATGCAATGATAGACAAGCATTTAACCCGCCTGGTT；其中n为 5和7。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法是通过PCR引物来对待筛选个体的核酸样品进行扩增，扩增产物进行分析完成的。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的引物的序列为SEQ ID NO:2和 SEQ ID NO:3。
CN202011342083.4A 2020-11-26 2020-11-26 一种许氏平鮋耐低氧个体筛选的分子标记及筛选方法 Active CN112410436B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011342083.4A CN112410436B (zh) 2020-11-26 2020-11-26 一种许氏平鮋耐低氧个体筛选的分子标记及筛选方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011342083.4A CN112410436B (zh) 2020-11-26 2020-11-26 一种许氏平鮋耐低氧个体筛选的分子标记及筛选方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112410436A CN112410436A (zh) 2021-02-26
CN112410436B true CN112410436B (zh) 2022-02-15

Family

ID=74842410

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011342083.4A Active CN112410436B (zh) 2020-11-26 2020-11-26 一种许氏平鮋耐低氧个体筛选的分子标记及筛选方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112410436B (zh)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484454B (zh) * 2013-08-16 2015-05-13 山东省海洋水产研究所 许氏平鮋微卫星dna分子标记
CN106755384A (zh) * 2017-02-15 2017-05-31 山东省海洋资源与环境研究院 一种微卫星引物及用于鉴别许氏平鲉、朝鲜平鲉和褐菖鲉的标准图谱及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112410436A (zh) 2021-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110129455B (zh) 一种生长相关的分子标记在凡纳滨对虾遗传育种中的应用
Vij et al. Barcoding of Asian seabass across its geographic range provides evidence for its bifurcation into two distinct species
CN111850133B (zh) 一种凡纳滨对虾的耐低温关联的snp分子标记、检测引物及其应用
CN104357553A (zh) 一种黄颡鱼微卫星家系鉴定方法
CN109055580B (zh) 凡纳滨对虾c型清道夫受体内与生长相关分子标记及应用
CN102653785B (zh) 团头鲂微卫星家系鉴定方法
Findra et al. Genetic profile assessment of giant clam genus Tridacna as a basis for resource management at Wakatobi National Park Waters
Xing et al. A review of environmental DNA field and laboratory protocols applied in fish ecology and environmental health
CN104694660B (zh) 卵形鲳鲹家系亲子鉴定的方法
CN107022608B (zh) Snp标记及其应用
CN111304337A (zh) 鉴定江黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交子一代的srap分子标记、试剂盒和方法及应用
CN108411007B (zh) Snp标记及其应用
CN106048028A (zh) 一个与石斑鱼生长速度相关的snp标记及其应用
CN111057771B (zh) 一种用于区分“中洋1号”和普通暗纹东方鲀的snp分子标记及其应用
CN112410436B (zh) 一种许氏平鮋耐低氧个体筛选的分子标记及筛选方法
CN115679004B (zh) 鉴定瓦氏黄颡鱼、长吻鮠和杂交种的引物、方法和试剂盒
CN115948577B (zh) 一种耐高温海参的选育方法
CN106222271A (zh) 一种微卫星遗传标记监测鱖种质的方法
CN107354234B (zh) 用于筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关引物对
CN113249442B (zh) 一种筛查牡蛎不饱和脂肪酸含量相关甲基化修饰基因的方法
KR102010705B1 (ko) 기수식용 해파리(Rhopilema esculentum) 동정을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 종 동정방법
CN110724749B (zh) 一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记c104及其应用
Neto et al. Kudoa ajurutellus n. sp.(Multivalvulida: Kudoidae), a parasite of the skeletal musculature of the Bressou sea catfish, Aspistor quadriscutis, in northeastern of the State of Para
CN108660225B (zh) 用于中间球海胆生长性状的分子标记辅助育种引物及筛选方法
CN108841930B (zh) 一种大鳞副泥鳅微卫星家系鉴定方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant