CN104937600B

CN104937600B - 为数字pcr实验设计者所用的方法和系统

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Publication number: CN104937600B
Application number: CN201380052860.3A
Authority: CN
Inventors: 奈弗蒂塔·苏米·马朱木达尔; 托马斯·维塞尔; 大卫·C·伍欧; 马克新·希克拉; 戈登·亚纳威; 史韦塔·莱贾德; 乔安娜·兰科斯特尔; 杰弗里·马克斯; 丹尼尔·维塞尔
Original assignee: Life Technologies Inc
Current assignee: Life Technologies Inc
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2013-09-13
Publication date: 2018-01-16
Anticipated expiration: 2033-09-13
Also published as: AU2013315167A1; KR20150083992A; US10984888B2; JP2016500856A; IN2015DN02987A; US20150278437A1; CN104937600A; SG11201502797PA; EP2895978A1; EP4044188A1; CN108229104B; RU2015113523A; BR112015005702A2; WO2014043581A1; CN108229104A; US20210313010A1

Abstract

提供一种用于设计数字PCR(dPCR)实验的计算机实施的方法。所述方法包含从用户处接收优化类型的选择。所述优化类型可以是例如将动态范围增至最大、将包含用于所述实验所需的反应部位的衬底的数目减到最小、确定稀释因子或确定检测的下限。所述方法进一步包含从所述用户处接收用于实验的精度测量，以及用于所述实验的反应部位中目标的最小浓度。所述方法还包含基于所述优化类型确定用于所述实验的一组dPCR实验设计因素。随后向所述用户显示所述dPCR实验设计因素组。

Description

为数字PCR实验设计者所用的方法和系统

背景技术

数字PCR(dPCR)是一种用以提供核酸样本的绝对定量、用以检测和定量稀有目标的浓度并且用以测量核酸浓度中的较低倍数变化的分析技术。

在dPCR中，含有相对少量的目标多核苷酸或核苷酸序列的溶液可以被细分成大量的小测试样本，使得每一样本一般或者含有目标核苷酸序列的一或多个分子或者不含有任何目标核苷酸序列。当样本随后在PCR协议、程序或实验中经过热循环时，含有目标核苷酸序列的样本被扩增并产生阳性检测信号，而不含有目标核苷酸序列的样本未被扩增且不产生检测信号。

可能，dPCR系统可以具有能够精确测量基因定量的非常高的精度。对于未知样本所面临的挑战在于在系统所支持的动态范围内的稀释度下进行实验。

通常，增加复制的数目提高了dPCR结果的准确性和再现性。动态范围取决于可用反应容器的总数目以及您的应用必需的测量精度。

发明内容

在一个示例性实施例中，提供一种用于设计数字PCR(dPCR)实验的计算机实施的方法。所述方法包含从用户处接收优化类型的选择。优化类型可以是例如将动态范围增至最大、将包含用于实验所需的反应部位的衬底的数目减到最小、确定稀释因子或确定检测的下限。所述方法进一步包含从用户处接收用于实验的精度测量，以及用于实验的反应部位中目标的最小浓度。所述方法还包含基于优化类型确定用于实验的一组dPCR实验设计因素。随后向用户显示所述dPCR实验设计因素组。

附图说明

图1A和图1B图示图表，其示出根据本发明教示的各种实施例的动态范围、测量精度以及检测下限和上限的关系。

图2图示曲线,其示出根据本文所描述的各种实施例的检测下限(LLOD)和检测上限(ULOD)与包含反应部位的衬底的数目的关系。

图3图示曲线，其示出根据本文所描述的各种实施例的用于dPCR实验的理想浓度范围。

图4图示曲线，其示出根据本文所描述的各种实施例精度如何随着大量的反应而提高。

图5图示根据本文所描述的各种实施例的总研究体积对检测最下限的影响。

图6图示根据本文所描述的各种实施例的精度与假调用的关系。

图7图示等高线，其示出根据本文所描述的各种实施例在非零假阳性和假阴性的影响下用于理想精度的所需载入。

图8图示等高线，其示出根据本文所描述的各种实施例在假阳性和假阴性调用影响下的检测下限。

图9图示等高线，其示出根据本文所描述的各种实施例用以补偿阳性/阴性反应损失所需的载入浓度。

图10图示等高线，其示出根据本文所描述的各种实施例在反应丢弃影响下的检测下限。

图11图示图表，其示出根据本文所描述的各种实施例在较高浓度下分区大小中的体积变化如何降低测量能力。

图12图示图表，其示出根据本文所描述的各种实施例用以补偿分区大小变化的用于最佳精度的阴性百分比内的目标载入。

图13图示根据本文所描述的实施例的具有分区的多个稀释的实例。

图14图示根据本文所描述的各种实施例稀释对dPCR系统中的目标检测的影响。

图15图示曲线，其示出根据本文所描述的各种实施例，对于单个衬底，稀释对检测下限以及动态范围的影响。

图16A和16B图示根据本文所描述的各种实施例当使用多个稀释的组合时对用于连续检测的稀释因子的约束。

图17图示根据本文所描述的各种实施例动态范围通过稀释而增加。

图18A、18B和18C图示根据本文所描述的各种实施例在稀释点的数目与动态范围的增加之间的折衷。

图19图示本文所描述的各种实施例可以实施的示例性计算系统。

图20A和图20B图示根据本文所描述的各种实施例通过dPCR实验设计者实施的各种数字PCR方法的流程图。

图21A、图21B、图21C、图21D图示使用根据本文所描述的各种实施例的dPCR实验设计者的基因表达工作流的方法。

图22A、图22B、图22C和图22D图示根据本文所描述的各种实施例使用dPCR实验设计者在稀有突变检测工作流内的方法。

图23A和图23B图示根据本文所描述的各种实施例的dPCR实验设计者的定量结果。

图24图示根据本文所描述的各种实施例相对于背景信号的稀有目标检测。

具体实施方式

用于最大灵敏度、动态范围以及测量精度的数字PCR建模

数字PCR的极大前景是可能用于实现基因定量的精确测量的空前未有的精度。当需要最大精度时，未知样本的挑战是在支持以需要测量精度检测一或多个感兴趣的目标的稀释下进行实验。可以使用数学框架来建立数字PCR系统模型，所述系统具有影响精度的因素，例如可用的反应部位的数目、样品体积减少(由于多种原因引起的)以及假阴性/假阳性率。此框架用以产生示出在精度与所支持的动态范围之间的关系的图形。还图示总输入样本体积对检测最低限或灵敏度的影响。根据各种实施例，此构架可以用于作为数字PCR实验设计者在可在计算系统的处理器上执行的计算机可读媒体上编码的方法。

根据各种实施例，建立各种系统参数影响的模型的一组图形可以被用户用作强大的工具，以估算为使数字应答获得所需精度所必需的稀释因子和反应部位的数目。模型通过两个稀释点的使用(使用一半数目的反应部位用于每一稀释)，对于相同数目的反应部位以给定精度预测所支持的动态范围的增加。当跨越整个动态范围的连续检测是理想的(例如，遗传定量)时，动态范围的增加是明显有利的。一半数目的反应部位损失至第二稀释点会产生在给定精度内可检测浓度范围的轻微损失。然而，由于第二稀释点的重叠影响，因此这种损失更多地由所述可检测浓度组中的增益得以补偿。结果也可以预测充分利用可用数目的反应部位的可能性，从而实现通过谨慎选择稀释因子来精确检测以极不同的比例存在于给定样本内的两个目标。在一些实施例中，大部分可用的反应部位可以专用于检测稀有类型，而余下部位可以专用于检测极不同稀释度下的野生型。

数字PCR模型

在数字PCR实验中，将样本DNA分割成大量反应部位使得每一部位不获得拷贝或获得一或多个拷贝。在执行PCR之后，在包含DNA模板的反应部位中可以检测到扩增，而在缺少DNA模板的反应部位中不可以检测到扩增。

没有显示出扩增的样本的反应部位被称为阴性，且显示出扩增的的反应部位被称为阳性。假设λ指代每个反应室的分子的平均数，且p指代在数字PCR实验中跨越n个反应部位的阴性的百分率。因此，通过以下等式阴性的百分率“p”与λ有关：

当时r＝阴性反应部位的数目；n＝反应部位的总数目。在系统中包含反应部位的衬底的数目是N。因此，例如，如果衬底包含20000个反应部位，那么n＝20000×N。

使用大量反应部位，采用拷贝的泊松(Poisson)分布，则每个反应部位的拷贝的平均数可以计算为λ＝-ln(r/n)，其中r是阴性结果的数目，n是反应部位的总数目。因此，可以估算输入体积中的目标的浓度。

通过等式3得出关于λ的估算的置信界限。

精度定义为关于λ的置信区间相比于λ的真实值的扩展。此扩展越小，则估算越精确。精度决定了这两个值可以接近且尚可通过系统检测的程度的上限。在所有浓度下精度测量都是不均匀的。图3示出曲线300，其示出针对1万、2万、4万和1百万个反应部位关于一定范围的浓度(以分子/反应来表达)的测量的置信区间。在此实例中，在显示20.32％的阴性反应百分率(不考虑反应数目)的浓度下实现最佳精度(由标记310指示)。图3还示出趋向于更高浓度精度更迅速地降低。曲线302示出每一反应部位的浓度对比对于1万次反应的阴性百分比的百分比偏差。曲线304示出每一反应部位的浓度对比对于2万次反应的阴性百分比的百分比偏差。曲线306示出每一反应部位的浓度对比对于一百万次反应的阴性百分比的百分比偏差。在此实例中，在载入浓度增大(x轴的右至左)时比在载入浓度减小(x轴的左至右)时精度下降更快。从这种观点看，很有可能在使用更多稀释样本用于实验方面出现误差。通过以下等式得出λ的测量精度：

由logλ空间中的σ表示的变化构成泊松(Poisson)或取样有关的分量，如等式5中所示：

数字PCR结果基于具有至少一个阴性或一个阳性结果。否则的话，当全部阴性或全部阳性时，不可能基于dPCR理论推导在反应部位内的反应体积内样本的浓度。具有仅仅一个阴性结果或仅仅一个阳性结果的实验性情境提供dPCR实验的检测限。

当存在仅仅一个阳性时出现检测下限(LLOD)。假定存在任何样本，获得全部阴性的概率可以设定成(1-可信度)；或等效地，获得至少一个阳性的概率可以设定成置信水平。例如，对于在下限处的95％置信水平，应在95％的实验中检测到样本的存在，而其它5％的实验将显示无阳性。在该点处求解λ得到检测下限处的λ，或λ_LLOD，通过以下等式得出：

λ_LLOD＝-ln((1-C)^1/n)) (6)，

其中，C是置信水平。

当存在仅仅一个阴性时出现检测上限(ULOD)。获得全部阳性的概率可以设定成(1-可信度)；或等效地，获得至少一个阴性的概率可以设定成置信水平。在该点处求解λ得到检测上限处的λ，或λ_ULOD，通过以下等式得出：

λ_ULOD＝-ln(1-(1-C)^1/n) (7)，

其中，C是置信水平。

如所描述界定的ULOD以及LLOD是理论检测限。然而，因为在ULOD和LLOD的测量精度非常差，所以可以设想界定关于最小所需精度的检测限。替代地，取决于基于系统的噪声特征而希望在实验中见到多少实际阳性或阴性，可以选择界定任意检测限。检测限还可以取决于反应部位的数目。图2中的图表200的曲线202示出如何通过增加反应部位的数目来降低检测下限。图2中的图表200的曲线204示出如何通过增加反应部位的数目来提高检测上限。

在此环境中，动态范围界定log10单位中的可检测浓度的跨度。动态范围通常由两个其它的信息来限定：检测精度和最低可检测浓度。图1A中的曲线100示出对于20000个反应部位10％精度内的动态范围。图1A中的曲线150还示出如何根据来自系统的较低精度要求增加动态范围。动态范围(DR)还可以通过界定明确的检测下限和上限来约束，如图1B所示。

检测精度主要受可用的反应部位的数目影响，并且最低可检测浓度主要受所询问的样本总体积影响。图3和图4示出精度如何根据反应容器的较大数目而提高。图4中的等高线是表达为百分率的测量精度的值。随着反应部位的数目增加，精度值变低(改进)。图5示出最低可检测浓度如何根据用于固定数目的反应部位的体积而变化(假定反应部位容纳较大单位体积)；这证明改进检测下限的促成因素为所询问的样本总体积。对于检测稀有事件，焦点因此应是朝向比反应部位数目更高的样本总体积。作为一实例，图5中产生的曲线示出20,000个反应部位。曲线502示出对于10μL反应体积的浓度对比精度。曲线504示出对于20μL反应体积的浓度对比精度。曲线506示出对于200μL反应体积的浓度对比精度。曲线508示出对于600μL反应体积的浓度对比精度。曲线510示出对于1000μL反应体积的浓度对比精度。

误差建模

此部分将噪声因子引入至纯泊松(Poisson)模型中。具有目标分子的成为未经检测的反应部位产生假阴性。不具有目标分子，但是分类为阳性反应的反应部位产生假阳性。导致假阴性的可能原因可以是例如扩增失效。导致假调用的可能原因包含例如污染、化学影响、样本源相关影响以及光学或系统噪声影响。因而，等式5的变化分量可以扩展至包含来自两个其它因子的变化：

●假阳性，假阴性调用率

●系统相关偏置

此另外的变化估算如下：假设λ_false指代由于假阳性和假阴性调用而观察到的λ。其与实际λ有关，如等式9所示。

λ_false＝-ln(e^-λ-false Positive Rate+false Negative Rate) (9)

通过等式10得出观察到的阴性的百分率。

p_false＝exp(-λ_false) (10)

在等式(3)中使用通过(10)得出的阴性的百分率，可以发现95％置信界限，如等式(11)所示：

如下得出来自取样以及非零假阳性和假阴性调用率的变化：

与系统噪声相关的任意变化源σ_SystemBias连同以上变化一起合并，从而得出总变化为：

这使得通过等式(14)得出扩展的置信界限。

将表达式(14)替换至等式(4)中的精度公式中用于更准确估算精度：

使用蒙特卡洛(Monte Carlo)模拟研究来自假调用率的影响如下：在零假调用率的影响下，产生20％阴性的载入浓度能得到最佳精度。但是，当假阴性率提高时，期望获得用于理想测量精度的更高阴性百分比。检测下(上)限最大限度地受假阳性(阴性)影响。

图6图示图表600，其示出精度随假调用而降低(假阳性影响可检测浓度的较低端而假阴性影响可检测浓度的较高端。

图7图示实例等高线，可用于确定如何通过定向用于最佳测量精度的不同阴性百分比来从噪声因子恢复。如上所述，在零假调用率的影响下，得到最佳精度的阴性百分比是20％阴性。然而，当假阴性率提高时，期望获得用于理想测量精度的更高阴性百分比。等高线的标记呈现阴性百分比中用于最佳精度的载入浓度值。

图8图示图表，其示出通过降低假阳性调用改进检测下限。等高线的标记呈现20％检测精度内的最小可检测拷贝/反应值。

还使用蒙特卡洛(Monte Carlo)模拟研究了因各种原因(包含但不限于质量考虑，例如灰尘或碎屑的存在)引起的反应丢弃的影响。

图9图示等高线，其示出当补偿阳性/阴性反应损失时所需的用于测量最佳精度的载入浓度。对于理想系统，将在20％阴性处导出峰值测量精度。因此，对于最佳测量精度点周围的经丢弃阳性反应部位对比弃阳性阴性反应部位，相同阳性丢弃率会影响大量的实际反应部位。这从以下事实得到证明：阳性丢弃率增加时的变化率对比阴性丢弃率增加时更快。为了从此影响中恢复，模拟建议对于阳性反应丢弃和阴性反应丢弃两者均移到较高载入样本浓度。等高线的标记呈现阴性百分比中用于最佳精度的载入浓度值。

图10图示趋向阴性反应排斥的较低偏置以减少对检测下限的影响。等高线的标记呈现20％精度内的最小可检测拷贝/反应值。

使用蒙特卡洛(Monte Carlo)模拟研究了反应部位之中的体积变化对评估浓度的影响。含有分子的反应部位的概率增加表示体积更大。使用作为平均体积百分比的标准差来呈现体积变化的正态分布。

图11图示在较高目标浓度下反应体积中的体积变化降低测量能力。

图12图示用以补偿分区大小变化的用于最佳精度的阴性百分比内的目标载入。

使用稀释扩展动态范围

先前部分中的误差建模显示了噪声因子会如何降低理论动态范围。解决此问题并且从数字PCR实验中增加动态范围的一种方法是通过运行一或多个稀释点。图13图示了示例性dPCR工作流。样本302可以分割成多个反应部位，如衬底304所示。样本302可以经稀释至少一次并分割成反应部位。在图13中，样本302经稀释一次并载入到衬底306中的一组反应部位中。此外，所述样本可以经第二次稀释并载入到衬底308中的第二组反应部位中。样本302可以经第三次稀释并载入到衬底310中的第三组反应部位中。根据本发明教示的各种实施例，在实例中，在样本上进行至少一次稀释以增加动态范围并提高精度。

图14图示稀释对精度的影响。稀释有助于检测浓度高于所支持范围的样本，但是可将样本置于接近所支持范围之外的检测下限。此外，以稀释度的各种组合使用的稀释延伸了动态范围，其中样本的初始浓度保留稀有目标的检测并且稀释点能够检测充足目标。图15图示曲线，其示出对于当一半反应部位供给第二稀释点时的单个衬底，稀释对检测下限以及动态范围的影响。

由于在两次稀释之间拆分可用的反应导致对检测下限的影响如下示出：

λ_{LLOD_Diluted}＝-ln((1-C)^2/n)＝-2*ln((1-C)^1/n)＝2*λ_LLOD＞λ_LLOD (16)

由于在两次稀释之间拆分可用的反应导致对检测上限的影响如下示出：

λ_{ULOD_Diluted}＝-ln(1-(1-C)^2/n)＜-ln(1-(1-C)^1/n)＝λ_ULOD (17)

图17图示其中通过使用2万个反应部位的一个额外稀释得到更大动态范围的实例。在此实例中，通过额外稀释点运行初始样本，以利用初始浓度点范围内的检测以及稀释点范围内的检测。然而，如等式16和17所示，如果在稀释之间拆分可用的反应，那么由于专用于初始浓度下的样本体积的可用反应部位更少，检测下限将会稍微上升。然而，从具有经稀释样本的所述反应部位组中现在可检测到较高浓度。为了试图实现满足来自系统的精度需要用于任何应答，自初始浓度点的动态范围的上限x％与自稀释点的动态范围的下限y％重叠，从而确保所需精度内的连续检测。

图16A和16B图示对上文所描述的稀释因子的限制。假设这两个稀释点命名为稀释点1和2，其中稀释点1浓度大于稀释点2。对于在两个稀释点之间的连续检测能力，第二稀释点的检测下限可以小于或等于第一稀释点的检测上限。否则的话，就存在如图16A和16B所指示的不连续的间隙。这说明，如果需要能够在第一稀释点的LLOD与第二稀释点的ULOD之间进行连续检测，那么对可以稀释到的最低浓度就存在限制。

在所需精度、检测下限和用来延伸动态范围的额外稀释的使用之间存在折衷。图18A图示超过使用仅两次稀释时额外稀释如何可以自系统延伸动态范围。在此模拟中在相同分割区中分离2万个反应部位。图18B示出当自初始稀释的井分布到额外稀释点时对检测下限的影响。可见5％精度内的两个以上稀释点产生受限的额外动态范围。然而，当精度要求下降时，可能通过更多稀释点获得动态范围的很大增加。动态范围的这些增加以愿意接受检测下限的降低为条件。另外，进行稀释可引入额外变化源，其反过来可限制系统的有效精度。图18C示出作为实例的引入具有5％和10％精度要求的四个稀释点的影响。

根据本发明教示的各种实施例，使用前述教示，可以通过计算系统实施所述方法以向用户提供dPCR实验设计者工具。用户可以能够更方便地基于dPCR实验设计者所提供的输出来规划所需实验。此外，在估算动态范围扩展相关的稀释因子或目标数字PCR相关的稀释因子两者之后，采用另一组计算来建议从储备液浓度转换成目标dPCR反应混合物稀释度的储备液-反应混合物稀释因子。在以下部分中描述这些计算。

储备液-反应混合物稀释因子-储备液浓度至目标dPCR稀释因子

根据各种实施例，dPCR实验设计者可以进一步用以计算用于将储备液样本稀释至目标dPCR稀释因子的储备液-反应混合物稀释因子，目标dPCR稀释因子也通过dPCR实验设计者计算得出。换句话说，例如，通过为用户提供额外稀释因子以将已知浓度的储备溶液稀释至基于动态范围和/或精度要求的所需浓度，dPCR实验设计者可以进一步帮助用户进行所需实验。

储备液-反应混合物稀释因子的计算基于参数，例如dPCR反应物的所需体积、反应物试剂的浓度以及用于样本和反应物试剂两者的最小移液管体积。此外，储备液-稀释的稀释因子可以进一步基于添加至反应混合物以便使储备液样本获得目标dPCR反应混合物稀释度的反应组分中的每一者的适当体积。储备液-反应混合物稀释因子还可以基于最小移液管体积，其为了确定实现样本的目标dPCR反应混合物稀释度所必需的样本或分析物的任何初始稀释度(在它们添加至反应混合物之前)。可能需要考虑最小移液管体积，因为移液管的性能(例如，待从移液管精确分配的体积的局限性)可影响用户制备样本的能力。考虑到这些因素，根据各种实施例，用户可能需要将(例如)以下参数输入至dPCR实验设计者中以计算储备液-反应混合物稀释因子。

输入参数

-用于样本的dPCR反应混合物中的目标dPCR稀释因子

-最小样本吸移体积

-最小试剂吸移体积

-所需总反应体积

-未经稀释的主要混合物浓度

-分析物列表

-未经稀释的分析物浓度

根据各种实施例，dPCR实验设计者的储备液-反应混合物稀释部分的结果可以是一系列反应物组分体积(以及任何必需的预稀释因子)添加至反应混合物，从而产生样本的目标dPCR反应混合物稀释度。通过dPCR实验设计者所提供的组分体积可符合最小移液管体积约束。例如，dPCR实验设计者的输出可以包含但不限于以下内容：

输出

-初始样本稀释因子(在dPCR反应混合物之外)

-初始分析物稀释因子(在dPCR反应混合物之外)

-针对以下项的混合物的体积以及最终浓度

-主要混合物

-初始经稀释的分析物

-初始经稀释的样本

-水

-总体积

根据各种实施例，用以确定储备液-反应混合物稀释因子的方法包含检查最终样本稀释因子是否可能的第一步骤。第二步骤可以包含计算样本以及分析物的初始稀释因子。第三步骤可以包含将测试体积设定为用于实验的所需体积。第四步骤可以确定各种参数直到分析物浓度等于1x为止。第五步骤可以包含向用户提供结果，包含：样本的初始稀释因子、分析物的初始稀释因子、最终主要混合物的体积、最终分析物的体积、最终样本的体积以及最终水的体积。确定储备液-反应混合物稀释因子的方法的实例如下：

步骤1：检查最终样本稀释因子是否可能。

a.计算在已经考虑反应物试剂之后剩余的体积。

b.如果最终样本稀释因子大于剩余体积的百分比，则返回

步骤2：计算样本以及分析物的初始稀释因子

a.基于试剂浓度以及用于试剂的最小移液管体积计算所需的最小反应体积

b.计算初始的主要混合物体积

c.计算初始的分析物体积

d.确定所需稀释度的样本体积是否适合剩余体积

i.如果是，则实施简单的样本体积计算以使样本适合剩余体积

ii.如果否，则计算实现最终样本稀释因子所需的剩余样本体积

e.基于在2d中计算出的样本体积计算样本的初始稀释因子

f.基于所需总反应体积、最小反应体积以及最终样本稀释因子计算分析物的初始稀释因子

步骤3：设定测试体积＝所需体积

步骤4：循环直到试剂浓度等于1x为止

a.计算最终主要混合物体积

b.计算测试分析物体积

c.计算测试样本体积

d.计算测试水体积

e.重新计算样本的初始稀释因子

f.重新计算分析物的初始稀释因子

g.基于重新计算出的分析物的初始稀释因子重新计算最终分析物体积

h.基于重新计算出的样本的初始稀释因子以及最小样本移液管体积重新计算最终样本体积

i.计算最终水体积

j.计算最终测试体积(测试体积的最大值、以及主要混合物、分析物、样本和水体积的总和)

k.如果任何分析物浓度不等于1，递增测试体积

步骤5：返回样本的初始稀释因子、分析物的初始稀释因子、最终主要混合物的体积、最终分析物的体积、最终样本的体积以及最终水的体积。

dPCR实验设计者的使用

dPCR实验设计者是基于具有为数字PCR实验所用的三个典型工作流的以上数字PCR模型建立的工具。如果用户从先前qPCR实验中获得关于NanoDrop读数或Ct值的替代信息，那么可以通过输入所述信息使用dPCR实验设计者来计算目标数字PCR稀释因子。此外，dPCR实验设计者可以为用户产生对于用于数字PCR实验的反应混合物的建议。

替代地，可以使用dPCR实验设计者来产生对于以两个不同浓度跨越两个衬底进行数字PCR实验的PCR混合物的建议。例如，这将支持整个所需动态范围的基因表达定量工作流。

对于稀有目标检测，dPCR实验设计者可以提供对于以特定置信水平检测所需倍数变化所需的衬底的数目的建议，每一衬底包含预定数目的反应部位。作为一实例，这将支持使用双重报告SNP分析的稀有突变检测工作流。

图20A和图20B图示根据本文所描述的各种实施例的数字PCR实验设计者工具所支持的3个不同工作流的流程图2000实例。工作流包含用户可能想要使用dPCR进行的实验的类型。dPCR实验设计者可以帮助用户规划所需实验。

dPCR实验设计者中包含的工作流可以包含稀有突变的工作流2004、针对绝对定量优化dPCR实验的检测属性的工作流2006、以及使用qPCR或NanoDrop数据来估算用于dPCR实验的稀释因子的工作流2008。根据各种实施例，dPCR实验设计者允许用户在步骤2002中选择用户正试图解决的问题的类型。换句话说，用户可以选择工作流。

作为一实例，用户可以选择稀有突变工作流2004。随后dPCR实验设计者可以引导用户输入设计实验所需的信息。例如，在步骤2010中，用户将被询问以选择他们拥有的野生型浓度的类型。如果用户拥有NanoDrop浓度，那么用户将在步骤2012中被询问以选择有关已知基因组的信息，例如二倍基因组重量或基因组大小和倍性。如果用户拥有作为野生型浓度源的qPCR读数，那么在步骤2014中用户将被查询以选择所导出的Ct值是否具有或不具有稀释系列。

随后在步骤2016中，用户将被询问以选择他们希望如何限制检测下限。例如，用户可能想要设定假阳性分布或设定检测下限。

随后，在步骤2018中，用户可以基于例如NanoDrop浓度、单个Ct或所用的稀释系列来输入所需的信息。用户还可以在步骤2020中提供其它高级输入，例如所用的仪器类型、假阳性率和假阴性率。

随后，根据各种实施例，在步骤2024中将向用户提供结果信息，包含但不限于野生型稀释信息、dPCR设置信息、交互式图表和/或储备溶液设置信息。随后可以用户使用此信息来进行所需的稀有突变实验。

图22A到22D图示根据本发明教示所描述的各种实施例向实施dPCR实验设计者的稀有突变工作流2004的用户显示的用户界面。下文更详细描述图22A到22D。

在针对绝对定量优化dPCR实验的检测属性的工作流2006中，用户在步骤2030中被询问以选择实验的目的。例如，用户可以选择将动态范围增至最大、将反应部位的芯片的数目降至最低、计算稀释因子和/或计算检测下限。如果用户选择目的是将动态范围增至最大，那么用户在步骤2032中被询问以选择他们希望如何限制动态范围。取决于用户选择的目的，用户在步骤2034中输入不同信息。用户还可以在步骤2036中提供高级输入，例如所用的仪器类型、在特定稀释度下所用的芯片的数目(包含已知数目的反应部位)、假阳性率和假阴性率。在步骤2038中向用户提供结果。

图21A到21D图示根据本发明教示所描述的各种实施例向实施优化检测属性工作流2006的用户显示的dPCR实验设计者的用户界面。下文更详细描述图21A到21D。

在使用qPCR或NanoDrop数据来估算用于您数字实验的稀释因子的工作流2008中，用户将被询问以在步骤2050中输入他们拥有的数据的类型。例如，如果用户拥有NanoDrop数据，那么用户将在步骤2052中被询问以输入二倍基因组重量或基因组大小和倍性的类型。如果用户拥有qPCR数据，那么用户将在步骤2054中被询问以选择所导出的Ct值是否具有或不具有稀释系列。接下来，用户将在步骤2056中被询问以选择实验的类型。实验的类型可以是例如单重的、双重的、SNP分析或自定义。在步骤2058中，用户可被询问以取决于在先前查询中所选择的信息来输入其它信息。此外，在步骤2058中，用户还可以被询问以输入确定储备液-反应混合物稀释因子所需的参数。在步骤2060中，用户可以提供其它高级输入。在步骤2062中，可以基于例如用户所用的数据的类型(qPCR或NanoDrop)向用户提供结果。

图21A、图21B、图21C以及图21D图示使用dPCR实验设计者的包含基因表达定量工作流的步骤的方法的实例。使用测量精度要求以及最小复制/反应输入来估算使用数字PCR模型的动态范围扩展稀释因子。

图22A、图22B、图22C以及图22D图示使用数字PCR实验设计者的稀有突变检测实验设计的步骤。在一个实例中，用户可以首先运行qPCR实验或NanoDrop读数来定量存在于他们样本中的野生型目标。此信息可以通过dPCR实验设计者使用来估算目标数字PCR稀释因子，从而使得能够在所需复制/反应下检测背景。另外，dPCR实验设计者允许用户输入他们可以实验方式确定的有关用于分析和系统的假阳性分布的内容。随后用户可以运行非目标控制装置并且确定通常在实验中所见的假阳性的数目的平均值和标准偏差。此信息连同目标倍数变化以及目标p值可以允许dPCR实验设计者使用数字PCR模型估算以高于背景的所需置信水平检测稀有事件必需的芯片数目。

定量结果

此部分举例说明在dPCR系统上量化在每μl的1个复制与1e6个复制之间的任何位置。在此实例中，使用来自生命技术公司(Life Technologies)的具有两个芯片两种稀释策略的QuantStudio 3D。关于模型，要求是动态范围(DR)的6个对数级，具有在1个拷贝/μl下的最低检测限。使用0.025％假阳性率以及0.05％假阴性率，dPCR实验设计者提供0.001的稀释因子建议。

6个对数级相隔的样本AA到GG，未稀释和经稀释对芯片上在下表中给出的浓度处。突出显示的浓度在系统上运行。因为这是一个模拟实例，所以不运行不可通过此系统检测的浓度。

样本	浓度处的预期拷贝/μl	0.001稀释因子处的预期拷贝/μl	自实际运行的拷贝/反应
				AA	1000000	1000	-
BB	100000	100	-

CC	10000	10	-
				DD	1000	1	1.4986
EE	100	.1	0.1116
				FF	10	.01	0.0101
GG	1	.001	0.0010

图23A图示根据本文所描述的实施例的基于上文所描述模型的定量结果。此处，样本AA、BB以及CC在稀释芯片上来精确量化，而样本EE、FF以及GG在未经稀释芯片上来精确量化。样本DD使用两个数据点来量化。图23B突出在根据本文所描述的各种实施例的dPCR实验设计者中使用的建模模式上的样本。

比率评估结果

以下部分举例说明使用具有两个芯片两种稀释策略的计算机模拟数据相对于背景信号检测稀有目标。1:1000的比率转换成3log的动态范围要求。最低检测限设定为10拷贝/微升。根据生命技术公司(Life Technologies)的QuantStudio 12K Flex选择模型的系统参数。使用0.07％假阳性率和0.18％假阴性率，系统建议在每一目标处用于检测的0.005的稀释因子，精度优于30％。

图24图示模型，示出在存在1000倍背景的情况下的稀有目标估算。使用10000拷贝/μl的充足目标和10拷贝/μl的稀有目标来模拟样本。通过从这些数据中大量反复地二次取样，在未稀释和经稀释的结构二者中，以6.95％的精度在稀释点处检测到野生型，以4.49％精度在未稀释点处检测到稀有目标。在0.001处精确预测比率。

计算机系统

所属领域的技术人员将认识到，各种实施例的操作可以使用硬件、软件、固件或适当时其组合来实施。例如，可以在软件、固件或硬连线逻辑的控制下使用处理器或其它数字电路执行一些处理。(本文中的术语“逻辑”是指如所属领域的技术人员所熟知的用以执行所阐述功能的固定硬件、可编程逻辑和/或其适当组合。)软件以及固件可以存储在计算机可读媒体上。如所属领域的技术人员所熟知，可以使用模拟电路来实施一些其它处理。另外，在本发明的实施例中可以使用存储器或其它存储装置以及通信组件。

图19是图示根据dPCR实验设计者的各种实施例可以用于进行处理功能的计算机系统1900的方块图。计算系统1900可以包含一或多个处理器，例如处理器1904。处理器1904可以使用一般或专用处理引擎来实施，例如微处理器、控制器或其它控制逻辑。在此实例中，处理器1904连接到总线1902或其它通信媒体上。

此外，应了解，图19的计算系统1900可以体现为若干形式中的任一者，例如机架式计算机、大型主机、超级计算机、服务器、客户端、桌上型计算机、膝上型计算机、平板计算机、手持式计算装置(例如，PDA、蜂窝电话、智能电话、掌上电脑等)、群集栅格、上网本、嵌入式系统、或可以合乎需要或适合于给定应用或环境的任何其它类型的专用或通用计算装置。另外，计算系统1900可以包含传统的网络系统，所述网络系统包含客户端/服务器环境和一或多个数据库服务器，或者与LIS/LIMS基础设施整合。本领域中已知包含局域网(LAN)或广域网(WAN)以及包含无线和/或有线组件的许多传统网络系统。另外，客户端/服务器环境、数据库服务器以及网络在本领域中有充分记载。

计算系统1900可以包含总线1902或用于传送信息的其它通信机构、以及与总线1902耦接用于处理信息的处理器1904。

计算系统1900还包含存储器1906，所述存储器可以是随机存取存储器(RAM)或其它动态存储器，其耦接到总线1902上用于存储将由处理器1904执行的指令。存储器1906还可以用于在执行将由处理器1904执行的指令期间存储临时变量或其它中间信息。计算系统1900进一步包含只读存储器(ROM)1908或其它静态存储装置，其耦接到总线1902上用于存储用于处理器1904的静态信息和指令。

计算系统1900还可以包含存储装置1910，例如磁盘、光盘或固态驱动器(SSD)提供并耦接到总线1902上以用于存储信息和指令。存储装置1910可以包含媒体驱动器和可移动存储接口。媒体驱动器可以包含用以支持固定的或可移动的存储媒体的驱动器或其它机构，例如硬盘驱动器、软盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、CD或DVD驱动器(R或RW)、闪速驱动器、或其它可移动的或固定的媒体驱动器。如这些实例所示，存储媒体可以包含计算机可读存储媒体，其中存储了特定计算机软件、指令或数据。

在替代实施例中，存储装置1910可以包含用于允许计算机程序或其它指令或数据加载到计算系统1900上的其它类似工具。此类工具可以包含例如可移动储存单元和接口(例如，程序盒带以及盒带接口)、可移动存储器(例如，闪存或其它可移动存储器模块)和存储器槽、以及允许软件和数据从存储装置1910传递至计算系统1900的其它可移除存储单元和接口。

计算系统1900还可以包含通信接口1918。通信接口1918可以用于允许软件和数据在计算系统1900与外部装置之间传递。通信接口1918的实例可以包含调制解调器、网络接口(例如以太网或其它NIC卡)、通信端口(例如，USB端口、RS-232C串行端口)、PCMCIA插槽和卡、蓝牙等。经由通信接口1918传递的软件和数据呈信号的形式，这些信号可以是能够通过通信接口1918接收的电子、电磁、光学或其它信号。这些信号可以经由信道通过通信接口1918传输以及接收，所述信道例如无线介质、导线或电缆、光纤、或其它通信介质。信道的一些实例包含电话线、蜂窝电话链路、RF链路、网络接口、局域网或广域网以及其它通信信道。

计算系统1900可以经由总线1902耦接到显示器1912，例如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)，以用于向计算机用户显示信息。包含字母数字和其它按键的输入装置1914耦接到总线1902，以用于例如将信息和命令选择传送到处理器1904。输入装置还可以是配置有触摸屏输入功能的显示器，例如LCD显示器。另一种类型的用户输入装置是光标控制件1916，例如鼠标、轨迹球或光标方向键，其用于将方向信息和命令选择传送到处理器1904以及用于控制光标在显示器1912上的移动。此输入装置通常具有在第一轴(例如x)和第二轴(例如y)的两个轴上的自由度，这允许所述装置指定平面上的位置。计算系统1900提供数据处理并且提供用于此类数据的置信级。与本发明教示的实施例的某些实施方案相符，计算系统1900回应于执行存储器1906中包含的一或多个指令的一或多个序列的处理器1904提供数据处理以及置信度值。此类指令可以从另一计算机可读媒体(例如存储装置1910)读取至存储器1906。存储器1906中包含的指令序列的执行使得处理器1904能进行本文所描述的处理状态。替代地，可以使用硬连线电路代替或结合软件指令以实现本发明的实施例。因此本发明教示的实施例的实施方案不限于硬件电路和软件的任何特定组合。

如本文中所使用的术语“计算机可读媒体”以及“计算机程序产品”一般是指与向处理器1904提供用于执行的一或多个序列或一或多个指令有关的任何媒体。一般称为“计算机程序代码”(其可以呈计算机程序或其它分组的形式来分组)的此类指令当经执行时使得计算系统1900能够表现本发明的实施例的特征或功能。计算机可读媒体的这些以及其它形式可以采用许多形式，包含但不限于非易失性媒体、易失性媒体以及传输媒体。非易失性媒体包含例如固态盘、光盘或磁盘，例如存储装置1910。易失性媒体包含动态存储器，例如存储器1906。传输媒体包含同轴电缆、铜线以及光纤，包含包括总线1902的电线。

计算机可读媒体的常用形式包含(例如)软盘、软磁盘、硬盘、磁带、或任何其它磁性媒体、CD-ROM、任何其它光学媒体、穿孔卡片、纸带、具有孔洞图案的任何其它物理媒体、RAM、PROM和EPROM、闪存EEPROM、任何其它存储器芯片或盒带、如下文所描述的载波、或计算机可以从中进行读取的任何其它媒体。

各种形式的计算机可读媒体可以与将一或多个指令的一或多个序列加载到处理器1904用于执行有关。例如，指令可以首先承载在远程计算机的磁盘上。远程计算机可以将指令加载到其动态存储器中，并使用调制解调器经由电话线发送指令。计算系统1900本地的调制解调器可以接收电话线上的数据并使用红外发射器将数据转换成红外信号。耦接到总线1902上的红外检测器可以接收在红外信号中承载的数据并将数据置于总线1902上。总线1902将数据加载到存储器1906，处理器1904从所述存储器检索并执行这些指令。由存储器1906接收的指令可以任选地或通过处理器1904执行之前或之后存储在存储装置1910上。

应了解，为清楚起见，以上描述已经参考不同功能单元以及处理器描述了本发明的实施例。然而，其将显而易见的是，在不偏离本发明的情况下可以使用在不同功能单元、处理器或域之间的任何合适的功能分布。例如，将通过分开的处理器或控制器实现的所图示功能可以通过同一处理器或控制器实现。因此，对特定功能单元的引用仅将视为引用用于提供所描述功能的适当装置，而非指示严格的逻辑或物理结构或组织。

尽管本发明已经描述了有关某些示例性实施例、实例和应用，但所属领域的技术人员将显而易见在不脱离本发明的情况下可以对其进行各种修改和改变。

Claims

1.一种用于设计数字PCR(dPCR)实验的方法，所述方法包括：

从用户处接收对实验的检测属性进行优化的优化类型的选择；

从所述用户处接收与所述优化类型对应的至少一个约束，所述至少一个约束包括精度测量；

从所述用户处接收用于所述实验的反应部位中目标的最小浓度；

基于所述优化类型和所述精度测量确定用于所述实验的一组dPCR实验设计因素；

从所述用户处接收将在所述实验中使用的储备溶液信息；

确定储备液-反应混合物稀释因子；并且

向所述用户显示所述dPCR实验设计因素组和所述储备液-反应混合物稀释因子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述优化类型是将动态范围增至最大。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述优化类型是将衬底的数目减到最小，其中每一衬底包含预定数目的反应部位。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述优化类型是计算稀释因子。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述优化类型是计算检测下限。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述dPCR实验设计因素组包含单个稀释动态范围。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述dPCR实验设计因素组包含最小的以及最大的单个稀释检测范围。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述dPCR实验设计因素组包含多个稀释动态范围。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述dPCR实验设计因素组包含最小的以及最大的多个稀释检测范围。

10.根据权利要求1所述的方法，其中确定用于所述实验的所述dPCR实验设计因素组包含基于体积变化进行计算。

11.根据权利要求1所述的方法，其中确定用于所述实验的所述dPCR实验设计因素组包含基于假阳性以及假阴性模型进行计算。

12.根据权利要求1所述的方法，其中确定用于所述实验的所述dPCR实验设计因素组包含基于预期的反应丢弃进行计算。

13.一种用于设计数字PCR系统的系统，所述系统包括：

处理器；以及

编码有可由所述处理器执行的指令的存储器，所述指令包括用于以下的指令：

从所述用户处接收将在所述实验中使用的储备溶液信息；

确定储备液-反应混合物稀释因子；以及

14.根据权利要求13所述的系统，其中所述优化类型是将动态范围增至最大。

15.根据权利要求13所述的系统，其中所述优化类型是将衬底的数目减到最小，其中每一衬底包含预定数目的反应部位。

16.根据权利要求13所述的系统，其中所述优化类型是计算稀释因子。

17.根据权利要求13所述的系统，其中所述优化类型是计算检测下限。

18.根据权利要求13所述的系统，其中所述dPCR实验设计因素组包含单个稀释动态范围。

19.根据权利要求13所述的系统，其中所述dPCR实验设计因素组包含最小的以及最大的单个稀释检测范围。

20.根据权利要求13所述的系统，其中所述dPCR实验设计因素组包含多个稀释动态范围。

21.根据权利要求13所述的系统，其中所述dPCR实验设计因素组包含最小的以及最大的多个稀释检测范围。

22.根据权利要求13所述的系统，其中确定用于所述实验的所述dPCR实验设计因素组包含基于体积变化进行计算。

23.根据权利要求13所述的系统，其中确定用于所述实验的所述dPCR实验设计因素组包含基于假阳性以及假阴性模型进行计算。

24.根据权利要求13所述的系统，其中确定用于所述实验的所述dPCR实验设计因素组包含基于预期的反应丢弃进行计算。

25.一种用于设计数字PCR(dPCR)实验的方法，所述方法包括：

从用户处接收检测稀有突变的浓度数据类型的选择；

从所述用户处接收与所述稀有突变相关联的基因组信息；

从所述用户处接收用于所述实验的检测下限测量；

从所述用户处接收用于所述实验所需的倍数变化；

基于所述浓度数据类型和所述所需的倍数变化确定用于所述实验的一组dPCR实验设计因素；

从所述用户处接收将在所述实验中使用的储备溶液信息；

确定储备液-反应混合物稀释因子；并且

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述dPCR实验设计因素组包含用于所述实验的野生型稀释信息。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述dPCR实验设计因素组包含所述用户可以用于所述实验的衬底的数目，其中每一衬底具有已知数目的反应部位。