JP2016500856A - デジタルpcr実験設計器のための方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
デジタルPCR(dPCR)実験を設計するためのコンピュータ実施方法が提供される。本方法は、ユーザから、最適化タイプの選択を受信することを含む。最適化タイプは、たとえば、ダイナミックレンジを最大化すること、実験に必要とされる反応部位を含む基板の数を最小限に抑えること、希釈係数を求めること、または、検出下限を求めることであってもよい。本方法は、ユーザから、実験の精度基準、および、実験の反応部位における標的の最低濃度を受信することをさらに含む。本方法はまた、最適化タイプに基づく実験のdPCR実験設計要因のセットを決定することをも含む。dPCR実験設計要因のセットはその後、ユーザに表示される。【選択図】21A
Description
デジタルPCR(dPCR)は、核酸サンプルの絶対量測定を可能にし、希少な標的の濃度を検出および定量化し、核酸濃度の低い倍率変化を測定するために使用される分析手法である。
dPCRにおいて、相対的に少数の標的ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む溶液が、多数の小さい試験サンプルに、各サンプルが一般的に1つもしくは複数の標的ヌクレオチド配列の分子を含むか、または、標的ヌクレオチド配列をまったく含まないように、細分化され得る。サンプルがその後PCRプロトコル、手順、または実験において熱サイクル処理されると、標的ヌクレオチド配列を含むサンプルは増幅されて肯定的な検出信号を生成し、一方で、標的ヌクレオチド配列を含まないサンプルは増幅されず、検出信号を生成しない。
潜在的に、dPCRシステムは、遺伝子定量化のための正確な測定を可能にする非常に高い精度を有し得る。未知のサンプルに伴う課題は、システムによってサポートされるダイナミックレンジ内に入る希釈において実験を実施することである。
一般的に、複製の数が増大すると、dPCR結果の精度および再現性が増大する。ダイナミックレンジは、利用可能な反応槽の総数および使用するアプリケーションに必要な測定精度に応じて決まる。
例示的な一実施形態において、デジタルPCR(dPCR)実験を設計するためのコンピュータ実施方法が提供される。本方法は、ユーザから、最適化タイプの選択を受信することを含む。最適化タイプは、たとえば、ダイナミックレンジを最大化すること、実験に必要とされる反応部位を含む基板の数を最小限に抑えること、希釈係数を求めること、または、検出下限を求めることであってもよい。本方法は、ユーザから、実験の精度基準、および、実験の反応部位における標的の最低濃度を受信することをさらに含む。本方法はまた、最適化タイプに基づく実験のdPCR実験設計要因のセットを決定することをも含む。dPCR実験設計要因のセットはその後、ユーザに表示される。
最大の感度、ダイナミックレンジおよび測定精度のためのデジタルPCRモデリング
デジタルPCRは大いに有望であり、遺伝子定量化の正確な測定を可能にする他に類を見ない精度を実現する可能性がある。最大の精度が所望されるとき、未知のサンプルに伴う課題は、必要とされる測定精度において対象の1つまたは複数の標的の検出をサポートする希釈において実験を実施することである。利用可能な反応部位の数、サンプル体積低減(様々な原因に起因する)、および偽陰性/偽陽性率のような、精度に影響を与える要因を用いたデジタルPCRシステムのモデリングに、数学的枠組みを使用することができる。この枠組みは、精度とサポートされるダイナミックレンジとの間の関係を示すグラフを明らかにするのに使用される。検出下限または感度に対する総入力サンプル体積の影響も示される。様々な実施形態によれば、この枠組みは、デジタルPCR実験設計器として、コンピューティングシステムのプロセッサ上に実装可能な、コンピュータ可読媒体上に符号化される方法において使用されてもよい。
デジタルPCRは大いに有望であり、遺伝子定量化の正確な測定を可能にする他に類を見ない精度を実現する可能性がある。最大の精度が所望されるとき、未知のサンプルに伴う課題は、必要とされる測定精度において対象の1つまたは複数の標的の検出をサポートする希釈において実験を実施することである。利用可能な反応部位の数、サンプル体積低減(様々な原因に起因する)、および偽陰性/偽陽性率のような、精度に影響を与える要因を用いたデジタルPCRシステムのモデリングに、数学的枠組みを使用することができる。この枠組みは、精度とサポートされるダイナミックレンジとの間の関係を示すグラフを明らかにするのに使用される。検出下限または感度に対する総入力サンプル体積の影響も示される。様々な実施形態によれば、この枠組みは、デジタルPCR実験設計器として、コンピューティングシステムのプロセッサ上に実装可能な、コンピュータ可読媒体上に符号化される方法において使用されてもよい。
様々な実施形態によれば、様々なシステムパラメータの効果をモデリングするグラフのセットは、ユーザにとって、所望の精度で数値による回答に至るのに必要な希釈係数および反応部位の数を推定するための強力なツールとしての役割を果たすことができる。このモデルは、2つの希釈点を使用することによる同じ数の反応部位(各希釈に対して半数の反応部位を使用する)に関する、所与の精度におけるサポートされるダイナミックレンジの増大を予測する。このダイナミックレンジの増大は、ダイナミックレンジ全体にわたる連続的な検出が望ましい場合(たとえば、遺伝子定量化)には明らかに有利である。第2の希釈点への半数の反応部位の損失によって、所与の精度における検出可能な濃度範囲のわずかな損失がもたらされる。しかしながら、この損失は、第2の希釈点の重複効果のために、検出可能な濃度のセットにおける利得によるオフセットよりも大きい。その結果はまた、希釈係数を慎重に選択することによって、所与のサンプル内に大きく異なる割合で存在する2つの標的の正確な検出を可能にするために、利用可能な数の反応部位をレバレッジする可能性をも予測することができる。いくつかの実施形態では、非常に異なる希釈において、利用可能な反応部位の大部分が、稀な型を検出するのに専用になり得、残りの部位が、非常に異なる割合の野生型を検出するのに専用になり得る。
デジタルPCRモデル
デジタルPCRモデル
デジタルPCR実験において、サンプルDNAが、多数の反応部位に、各々が複製をまったく得ないか、または1つまたは複数の複製を得るように、分割される。PCRが実施された後、DNAテンプレートを含んでいた反応部位においては増幅が検出され得、一方で、DNAテンプレートがない反応部位では増幅は検出され得ない。
増幅されたサンプルを示さない反応部位は陰性と称され、増幅を示す反応部位は陽性と称される。λが反応室あたりの平均分子数を示し、pがデジタルPCR実験におけるn個の反応部位にわたる陰性の割合を示すものとする。したがって、陰性の割合「p」は、以下の式によってλに関係付けられる。
p=e−λ(1)
=r/n(2)
式中、r=陰性反応部位の数であり、n=反応部位の総数である。システム内の反応部位を含む基板の数はNである。したがって、たとえば、基板が20000個の反応部位を含む場合、n=20000*Nである。
p=e−λ(1)
=r/n(2)
式中、r=陰性反応部位の数であり、n=反応部位の総数である。システム内の反応部位を含む基板の数はNである。したがって、たとえば、基板が20000個の反応部位を含む場合、n=20000*Nである。
複製がポアソン分布すると仮定した多数の反応部位を使用すると、反応部位あたりの複製の平均数はλ=−ln(r/n)として計算することができ、式中、rは陰性結果の数であり、nは反応部位の総数である。したがって、入力体積における標的の濃度を推定することができる。
λの推定値の信頼限界は式3によって与えられる。
精度は、λの真の値と比較したλの信頼区間の広がりとして定義される。この広がりが小さくなるほど、推定値はより正確になる。精度は、2つの値がどれだけ近いものであり得るか、および、なおシステムによって検出可能であり得るかの上限に影響を与える。精度測定値はすべての濃度において一定ではない。図3は、10K、20K、40Kおよび1Mの反応部位の濃度(反応あたりの分子で表現される)の範囲にわたる測定値の信頼区間を示すプロット300を示す。この例において、最良の精度は、マーカ310によって示されている、20.32%の陰性反応の割合(反応の数にかかわりなく)を示す濃度において達成される。図3はまた、精度がより高い濃度に向かってより急速に低下していることも示している。プロット302は、10Kの反応に関する、各反応部位における濃度および陰性の百分率に対するパーセント偏差を示す。プロット304は、20Kの反応に関する、各反応部位における濃度および陰性の百分率に対するパーセント偏差を示す。プロット306は、1Mの反応に関する、各反応部位における濃度および陰性の百分率に対するパーセント偏差を示す。この例において、精度の低下は、導入濃度が低減するとき(x軸上で左から右)よりも、導入濃度が増大するとき(x軸上で右から左)の方がより尖鋭である。この観点から、実験により多くの希釈サンプルを使用し過ぎると失敗する傾向にあるということが、当を得ていると言え得る。λの測定精度は以下の式によって与えられる。
log λ空間におけるσによって表される変動が、以下の式5に示すように、ポアソンまたはサンプリング関連成分を構成する。
デジタルPCR結果は、少なくとも1つの陰性または1つの陽性結果を有することに基づく。すべて陰性またはすべて陽性であるそれ以外の場合、dPCR理論に基づいて反応部位内の反応物体積中サンプルの濃度を推定することは可能ではない。陰性結果が1つだけであるか、または陽性結果が1つだけである実験シナリオによって、dPCR実験の検出限界が与えられる。
検出下限(LLOD)は陽性が1つだけである場合に生じる。任意のサンプルが存在することを所与として、すべて陰性が得られる確率は(1−信頼度)に設定され得、または同等に、少なくとも1つの陽性が得られる確率は信頼水準に設定され得る。たとえば、下限における95%の信頼水準について、サンプルの存在は95%の実験において検出されるはずであり、他の5%の実験は陽性を示さないことになる。その点においてλについて解くことによって、以下のように与えられる、検出下限におけるλ、すなわち、λLLODが与えられる。
λLLOD=−ln((1−C)1/n)(6)
λLLOD=−ln((1−C)1/n)(6)
式中、Cは信頼水準である。
検出上限(ULOD)は陰性が1つだけである場合に生じる。すべて陽性が得られる確率は(1−信頼度)に設定され得、または同等に、少なくとも1つの陰性が得られる確率は信頼水準に設定され得る。その点においてλについて解くことによって、以下のように与えられる、検出上限におけるλ、すなわち、λULODが与えられる。
λULOD=−ln(1−(1−C)1/n)(7)
λULOD=−ln(1−(1−C)1/n)(7)
式中、Cは信頼水準である。
定義されているようなULODおよびLLODは理論的検出限界を記述している。しかしながら、ULODおよびLLODにおける測定精度は非常に乏しいため、必要とされる最小精度の観点から検出限界を定義することを想像することができる。代替的に、システムのノイズ特性に基づいて、実験においてどれだけ多くの実際の陽性または陰性を見たいかに応じて、任意の検出限界を定義することを選択してもよい。検出限界はまた、反応部位の数に応じても決まり得る。図2におけるグラフ200のプロット202は、反応部位の数が増大することによって検出下限がどのように低下するかを示す。図2におけるグラフ200のプロット204は、反応部位の数が増大することによって検出上限がどのように上昇するかを示す。
この文脈において、ダイナミックレンジが、log10 unitにおける検出可能な濃度の範囲を定義する。ダイナミックレンジは通常、2つの他の情報、すなわち、検出精度および最低検出可能濃度によって限定される。図1Aにおけるプロット100は、20000個の反応部位についての10%精度におけるダイナミックレンジを示す。また、図1Aにおけるプロット150が、システムからの精度要件が低下するに従って、ダイナミックレンジがどのように増大するかを示している。ダイナミックレンジ(DR)はまた、図1Bに示すように、明示的な検出下限および上限を定義することによっても制約され得る。
検出精度は主に、利用可能な反応部位の数によって影響され、最低検出可能濃度は主に、対象の総サンプル体積によって影響される。図3および図4は、反応槽の数が多くなるに従って、精度がどのように改善するかを示す。図4における等高線は、割合として表現されている測定精度の値である。精度値は、反応部位の数が増大するに従って低くなる(改善する)。図5は、最低検出可能濃度が、固定数の反応部位の体積(反応部位がより大きい単位体積に対応すると仮定する)とともにどのように変化するかを示し、これによって、検出下限が改善する要因が、対象の総サンプル体積であることが明らかになる。したがって、稀な事象の検出について、焦点は、反応部位の数よりも、総サンプル体積をより大きくすることに向けられるはずである。図5において生成されているプロットは、一例として、20,000個の反応部位を示す。プロット502は、10μLの反応物体積についての、精度に対する濃度を示す。プロット504は、20μLの反応物体積についての、精度に対する濃度を示す。プロット506は、200μLの反応物体積についての、精度に対する濃度を示す。プロット508は、600μLの反応物体積についての、精度に対する濃度を示す。プロット510は、1000μLの反応物体積についての、精度に対する濃度を示す。
エラーモデリング
エラーモデリング
この節では、純粋なポアソンモデルに対するノイズ要因を紹介する。検出されないままになる標的分子を有する反応部位が偽陰性をもたらす。標的分子を有しないが、陽性反応と分類されるようになる反応部位が、偽陽性をもたらす。偽陰性の可能性のある原因は、たとえば、増幅の失敗であり得る。誤検出の可能性のある原因は、汚染、化学効果、ソースサンプル関連効果、および、光学的またはシステムノイズ効果を含む。そのため、式5の変動成分は、以下の2つの他の要因からの変動を含むように拡大され得る。
偽陽性、偽陰性検出率
システム関連バイアス
偽陽性、偽陰性検出率
システム関連バイアス
この追加の変動は以下のように推定される。λfalseが、偽陽性および偽陰性判定のために観測されるλを示すものとする。これは、式9に示すように、真のλに関係付けられる。
観測される陰性の割合が、式10によって与えられる。
(10)によって与えられる陰性の割合を式(3)に使用すると、以下の式(11)に示すように、95%の信頼限界が見出され得る。
サンプリングおよび非ゼロ偽陽性および偽陰性判定率からの変動が、以下のように与えられる。
システムノイズに関係する任意の変動源σSystemBiasが上記の変動とともにプールされ、以下のように総変動が与えられる。
これによって、式(14)によって与えられる拡大された信頼限界がもたらされる。
より正確な精度の推定値を求めて、式(14)が式(4)における精度式に代入される。
誤判定率からの影響が、モンテカルロシミュレーションを使用して以下のように調べられる。ゼロ誤判定率の影響下で、20%の陰性をもたらす導入濃度が最良の精度を可能にする。しかし、偽陰性率が増大するとき、最適な測定精度のためにより高い陰性率を目標とすることが望ましい。検出下限(上限)が、偽陽性(陰性)によって最大限まで影響を受ける。
図6は、精度が誤判定によって低下することを示すグラフ600を示す(偽陽性が検出可能な濃度の下端に影響を与え、一方で偽陰性が検出可能な濃度の上端に影響を与える。
図7は、最良の測定精度のために異なる陰性率を目標とすることによってノイズ要因からどのように回復するかを決定するのに有用な、例示的な等高線を示す。上述したように、ゼロ誤判定率の影響下で、最良の精度を可能にする陰性率は20%の陰性である。しかしながら、偽陰性率が増大するとき、最適な測定精度のためにより高い陰性率を目標とすることが望ましい。等高線のラベルは、陰性率における最良の精度のための導入濃度値を提示する。
図8は、偽陽性判定が低下することによって検出下限が改善することを示すグラフである。等高線のラベルは、20%の検出精度における最小検出可能複製/反応値を提示する。
限定ではないが、塵またはゴミの存在のような品質考慮事項を含む様々な原因に起因する反応漏れからの影響も、モンテカルロシミュレーションを使用して調べられる。
図9は、陽性/陰性反応損失を補償するときの、最良の精度による測定のための所望の導入濃度による等高線を示す。理想的なシステムについて、ピーク測定精度は20%の陰性であると導出された。したがって、同じ陽性低下率が、最良の測定精度点周辺で、低下した陰性反応部位に対して低下した陽性反応部位のより多数の実際の反応部位に影響を与える。これは、陰性低下率の増大に対して陽性低下率の増大によって変化の速度がより速くなるという事実から証拠付けられる。この影響から回復するために、シミュレーションは、陽性および陰性の両方の反応低下に対して導入サンプル濃度をより高くすることを示唆している。等高線のラベルは、陰性率における最良の精度のための導入濃度値を提示する。
図10は、検出下限に対する影響を低減するために陰性反応を拒絶することを目的としたより低いバイアスを示す。等高線のラベルは、20%の精度における最小検出可能複製/反応値を提示する。
濃度の推定に対する反応部位の間での体積変動の影響が、モンテカルロシミュレーションを用いて調べられた。より大きい体積が、反応部位が分子を含む確率の増大によって表される。体積変動の通常の分布は、平均体積の百分率としてとられる標準偏差によって仮定される。
図11は、反応物体積における体積変動が、標的のより高い濃度において測定能力を低下させることを示す。
図12は、分割サイズ変動を補償するための最良の精度のための陰性率における標的導入を示す。
希釈を使用したダイナミックレンジの拡大
希釈を使用したダイナミックレンジの拡大
前の節におけるエラーモデリングは、理論的ダイナミックレンジがノイズ要因によってどのように低下するかを示した。この問題を軽減してデジタルPCR実験からのダイナミックレンジを増強する1つの方法が、1つまたは複数の希釈点を運用することによるものである。図13は、例示的なdPCRワークフローを示す。サンプル302が、基板304に示すように複数の反応部位に分割され得る。サンプル302は少なくとも1回希釈されて、複数の反応部位に分割され得る。図13において、サンプル302は1回希釈されて、基板306内の反応部位セット内に導入される。さらに、サンプルは、2回目に希釈されて、基板308内の第2の反応部位セット内に導入され得る。サンプル302は、3回目に希釈されて、基板310内の第3の反応部位セット内に導入され得る。例において、本教示の様々な実施形態に従って、少なくとも1回の希釈がサンプルに対して実施されて、ダイナミックレンジおよび精度が増大される。
図14は、精度に対する希釈の影響を示す。希釈は、サポートされる範囲よりも高い濃度のサンプルを検出する一助となるが、検出下限付近のサンプルをサポートされる範囲外にし得る。さらに、希釈の様々な組合せにおいて使用される希釈が、稀な標的の検出を保持するサンプルの元の濃度、および、豊富な標的の検出を可能にする希釈点によって、ダイナミックレンジを拡大する。図15は、反応部位の半分が第2の希釈点に対して示されているときの、単一の基板からの、検出下限およびダイナミックレンジに対する希釈の影響を示すプロット図である。
2つの希釈の間で利用可能な反応を分割することに起因する、検出下限に対する影響は、以下のように示される。
::λLLOD_Diluted=−ln((1−C)2/n)=−2*ln(1−C)1/n)=2*λLLOD>λLLOD(16)
::λLLOD_Diluted=−ln((1−C)2/n)=−2*ln(1−C)1/n)=2*λLLOD>λLLOD(16)
2つの希釈の間で利用可能な反応を分割することに起因する、検出上限に対する影響は、以下のように示される。
λULOD_Diluted=−ln((1−C)2/n)<−ln(1−(1−C)1/n)=λULOD(17)
λULOD_Diluted=−ln((1−C)2/n)<−ln(1−(1−C)1/n)=λULOD(17)
図17は、20Kの反応部位を使用して1回の追加の希釈によってより大きいダイナミックレンジが可能になった例を示す。この例において、元の濃度点からの検出範囲および希釈点からの検出範囲を利用するために、元のサンプルは追加の希釈点によって運用された。しかしながら、式16および17に示すように、利用可能な反応を複数の希釈の間で分割する場合、元の濃度におけるサンプル体積に専用にされる利用可能な反応部位が少なくなることに起因して検出下限がわずかに上昇することになる。しかしながら、現在は、希釈されたサンプルを有する反応セットからより高い濃度を検出可能である。いかなる応答についてもシステムからの精度要件を満たすことを達成する試行のために、元の濃度点からのダイナミックレンジの上側x%が、希釈点からのダイナミックレンジの下側y%と重複され、それによって、必要とされる精度における連続的な検出が保証される。
図16Aおよび図16Bは、上述した希釈係数に対する制限を示す。2つの希釈点が希釈点1および2と名付けられることとし、希釈点1は希釈点2よりも濃度が高い。2つの希釈点の間で連続的な検出が可能である場合、第2の希釈点は、第1の希釈点からの検出上限以下の検出下限を有し得る。そうでない場合、図16Aおよび図16Bに示すように、不連続な隙間があり得る。これは、第1の希釈点のLLODと第2の希釈点のULODとの間で連続的に検出することが可能であることが必要な場合、希釈し得る最低濃度には制限があることを示す。
必要とされる精度、検出下限、および、ダイナミックレンジを拡大するための追加の希釈の使用の間にはトレードオフが存在する。図18Aは、2つだけの希釈を使用することを超えて、追加の希釈が、システムからのダイナミックレンジをどのように拡大することができるかを示す。このシミュレーションにおいて、20Kの反応部位が等しい区分に分割された。図18Bは、最初の希釈からのウェルが追加の希釈点に分散されたときの検出下限への影響を示す。5%精度における3つ以上の希釈点が、制限された追加のダイナミックレンジをもたらすことが見てとれる。しかしながら、精度要件が低下すると、より多くの希釈点によってダイナミックレンジの相当な利得が可能になる。これらのダイナミックレンジの利得は、検出下限に対する低下を受け入れる意思があることを条件とする。また、希釈を実施することによって、さらなる変動源が導入され得、これによって、システムの実効精度が制限され得る。図18Cは、例として5%および10%の精度要件で4つの希釈点を導入する影響を示す。
上記の教示を使用して、方法は、本教示の様々な実施形態による、ユーザにdPCR実験設計器ツールを提供するためのコンピューティングシステムによって実施されてもよい。ユーザは、dPCR実験設計器によって提供される出力に基づいて所望の実験をより容易に計画することが可能になり得る。さらに、ダイナミックレンジ拡大関連希釈係数または標的デジタルPCR関連希釈係数の両方が推定された後、さらなる計算セットが、原液濃度から標的dPCR反応混合物希釈液に変換するための原液−反応混合物希釈係数を示唆するのに利用される。これらの計算は、以下の節において説明される。
原液−反応混合物希釈係数−原液濃度から標的dPCRへの希釈係数
原液−反応混合物希釈係数−原液濃度から標的dPCRへの希釈係数
様々な実施形態によれば、dPCR実験設計器はさらに、同じくdPCR実験設計器によって計算される、原液サンプルを標的dPCR希釈係数まで希釈するための原液−反応混合物希釈係数を計算するのに使用され得る。言い換えれば、dPCR実験設計器は、ユーザが、たとえばダイナミックレンジおよび/または精度要件に基づいて既知の濃度の原液を所望の濃度に希釈するための追加の希釈係数をユーザに提供することによって、所望の実験を実施するにあたってさらにユーザを支援することができる。
原液−反応混合物希釈係数の計算は、所望のdPCR反応の体積、反応試薬の濃度、ならびに、サンプルおよび反応試薬の両方の最小ピペット体積のようなパラメータに基づく。さらに、原液−反応混合物希釈係数は、標的dPCR反応混合物希釈液に対する原液サンプルを得るために反応混合物に添加するための反応成分の各々の適切な体積にさらに基づいてもよい。原液−反応混合物希釈係数はまた、サンプルの標的dPCR反応混合物希釈を達成するのに必要なサンプルまたはアッセイの任意の初期希釈(それらを反応混合物に添加する前の)を求めるための最小ピペット体積に基づいてもよい。ピペットから正確に分注することができる体積の制限のような、ピペットの機能が、ユーザがサンプルを調製することができるかに影響を及ぼす場合があるため、最小ピペット体積は、考慮する必要があり得る。これらの要因を考慮に入れて、ユーザは、以下のパラメータを、たとえば、様々な実施形態による原液−反応混合物希釈係数を計算するためのdPCR実験設計器に入力する必要があり得る。
入力パラメータ
−サンプルに関するdPCR反応混合物における標的dPCR希釈係数
−最小サンプルピペット体積
−最小試薬ピペット体積
−所望の総反応物体積
−非希釈マスタ混合物濃度
−アッセイリスト
−非希釈アッセイ濃度
−サンプルに関するdPCR反応混合物における標的dPCR希釈係数
−最小サンプルピペット体積
−最小試薬ピペット体積
−所望の総反応物体積
−非希釈マスタ混合物濃度
−アッセイリスト
−非希釈アッセイ濃度
dPCR実験設計器の原液−反応混合物希釈部分の結果は、様々な実施形態による、サンプルの標的dPCR反応混合物希釈液を生成する反応混合物に添加されるべき反応成分体積(および任意の必要な希釈前の要因)のリストであり得る。dPCR実験設計器によって提供される成分体積は、最小ピペット体積制約を満たし得る。たとえば、dPCR実験設計器の出力は、限定ではないが、以下のものを含んでもよい。
出力
−初期サンプル希釈係数(dPCR反応混合物を除く)
−初期アッセイ希釈係数(dPCR反応混合物を除く)
−以下のものの混合物における体積および最終濃度
−マスタ混合物
−初期希釈アッセイ
−初期希釈サンプル
−水
−総体積
−初期サンプル希釈係数(dPCR反応混合物を除く)
−初期アッセイ希釈係数(dPCR反応混合物を除く)
−以下のものの混合物における体積および最終濃度
−マスタ混合物
−初期希釈アッセイ
−初期希釈サンプル
−水
−総体積
様々な実施形態によれば、原液−反応混合物希釈係数を求めるための方法は、最終サンプル希釈係数が可能か否かをチェックする第1のステップを含む。第2のステップは、サンプルおよびアッセイの初期希釈係数を計算することを含み得る。第3のステップは、実験のための所望の体積として試験体積を設定することを含み得る。第4のステップは、アッセイ濃度が1xに等しくなるまで様々なパラメータを求め得る。第5のステップは、サンプルの初期希釈係数、アッセイ(複数の場合もあり)の初期希釈係数、最終マスタ混合物体積、最終アッセイ体積(複数の場合もあり)、最終サンプル体積、および最終水体積を含む結果をユーザに提供することを含み得る。原液−反応混合物希釈係数を求める方法の一例は以下のようなものである。
ステップ1:最終サンプル希釈係数が可能であるか否かをチェックする。
a.反応試薬が計上された後に残された体積を計算する。
b.最終サンプル希釈係数が残りの体積の割合よりも大きい場合、返す
a.反応試薬が計上された後に残された体積を計算する。
b.最終サンプル希釈係数が残りの体積の割合よりも大きい場合、返す
ステップ2:サンプルおよびアッセイの初期希釈係数を計算する
a.試薬濃度および試薬の最小ピペット体積に基づいて必要とされる最小反応物体積を計算する
b.初期マスタ混合物体積を計算する
c.初期アッセイ体積を計算する
d.所望の希釈におけるサンプル体積が残りの体積に適合するか否かを判定する
i.そうである場合、サンプルを残りの体積に適合させる単純な体積計算を実行する
ii.そうでない場合、最終サンプル希釈係数を達成するのに必要とされる超過分のサンプル体積を計算する
e.2dにおいて計算されたサンプル体積に基づいてサンプルの初期希釈係数を計算する
f.所望の総反応物体積、最小反応物体積、および最終サンプル希釈係数に基づいてアッセイ(複数の場合もあり)の初期希釈係数を計算する
a.試薬濃度および試薬の最小ピペット体積に基づいて必要とされる最小反応物体積を計算する
b.初期マスタ混合物体積を計算する
c.初期アッセイ体積を計算する
d.所望の希釈におけるサンプル体積が残りの体積に適合するか否かを判定する
i.そうである場合、サンプルを残りの体積に適合させる単純な体積計算を実行する
ii.そうでない場合、最終サンプル希釈係数を達成するのに必要とされる超過分のサンプル体積を計算する
e.2dにおいて計算されたサンプル体積に基づいてサンプルの初期希釈係数を計算する
f.所望の総反応物体積、最小反応物体積、および最終サンプル希釈係数に基づいてアッセイ(複数の場合もあり)の初期希釈係数を計算する
ステップ3:試験体積=所望の体積に設定する
ステップ4:試薬濃度が1×に等しくなるまでサイクルする
a.最終マスタ混合物体積を計算する
b.試験アッセイ体積(複数の場合もあり)を計算する
c.試験サンプル体積を計算する
d.試験水体積を計算する
e.サンプルの初期希釈係数を再計算する
f.アッセイ(複数の場合もあり)の初期希釈係数を再計算する
g.再計算されたアッセイ(複数の場合もあり)の初期希釈係数に基づいて最終アッセイ体積(複数の場合もあり)を再計算する
h.再計算されたサンプルの初期希釈係数および最小サンプルピペット体積に基づいて最終サンプル体積を再計算する
i.最終水体積を計算する
j.試験最終体積(試験体積の最大値ならびにマスタ混合物、アッセイ、サンプル、および水の体積の総計)を計算する
k.いずれかのアッセイ濃度が1に等しくない場合、試験体積を増分する
a.最終マスタ混合物体積を計算する
b.試験アッセイ体積(複数の場合もあり)を計算する
c.試験サンプル体積を計算する
d.試験水体積を計算する
e.サンプルの初期希釈係数を再計算する
f.アッセイ(複数の場合もあり)の初期希釈係数を再計算する
g.再計算されたアッセイ(複数の場合もあり)の初期希釈係数に基づいて最終アッセイ体積(複数の場合もあり)を再計算する
h.再計算されたサンプルの初期希釈係数および最小サンプルピペット体積に基づいて最終サンプル体積を再計算する
i.最終水体積を計算する
j.試験最終体積(試験体積の最大値ならびにマスタ混合物、アッセイ、サンプル、および水の体積の総計)を計算する
k.いずれかのアッセイ濃度が1に等しくない場合、試験体積を増分する
ステップ5:サンプルの初期希釈係数、アッセイ(複数の場合もあり)の初期希釈係数、最終マスタ混合物体積、最終アッセイ体積(複数の場合もあり)、最終サンプル体積、および最終水体積を返す。
dPCR実験設計器の使用
dPCR実験設計器の使用
dPCR実験設計器は、デジタルPCR実験のための3つの一般的なワークフローを有する上記のデジタルPCRモデルに基づいて構築されるツールである。ユーザが以前のqPCR実験からのナノドロップ読み値またはCt値に関する代替的な情報を有する場合、dPCR実験設計器は、その情報を入力することによって標的デジタルPCR希釈係数を計算するのに使用され得る。さらに、dPCR実験設計器は、デジタルPCR実験のための反応混合物に関するユーザに対する推奨を生成し得る。
代替的に、dPCR実験設計器は、2つの異なる濃度にある2つの基板にわたって実施されるデジタルPCR実験のためのPCR混合物に関する推奨を生成するのに使用され得る。これは、たとえば、所望のダイナミックレンジにわたる遺伝子発現定量化ワークフローをサポートする。
稀な標的の検出について、dPCR実験設計器は、特定の信頼水準において所望の倍率変化を検出するのに必要とされる、各々が所定数の反応部位を含む基板の数に関する推奨を提供することができる。これは、一例として、デュアルレポータSNPアッセイを使用した稀な変異の検出ワークフローをサポートする。
図20Aおよび図20Bは、本明細書において説明される様々な実施形態による、デジタルPCR実験設計器ツールによってサポートされる3つの異なるワークフローの流れ図2000の例を示す。ワークフローは、dPCRを使用してユーザが実施することを所望し得る実験のタイプを含む。dPCR実験設計器は、ユーザが所望の実験を計画する一助となり得る。
dPCR実験設計器に含まれるワークフローは、稀な変異のワークフロー2004、絶対量測定ワークフロー2006のためのdPCR実験の検出属性最適化、および、dPCR実験ワークフロー2008のための希釈係数を推定するためのqPCRまたはNanoDropデータの使用を含み得る。様々な実施形態によれば、dPCR実験設計器は、ステップ2002においてユーザが解決しようとしている問題のタイプを、ユーザが選択することを可能にする。言い換えれば、ユーザはワークフローを選択することができる。
一例として、ユーザは、稀な変異のワークフロー2004を選択し得る。dPCR実験設計器はその後、実験を設計するのに必要とされる情報を入力するようにユーザを誘導し得る。たとえば、ステップ2010において、ユーザは、自身が有する野生型濃度の型を選択するよう求められることになる。ユーザがNanoDrop濃度を有する場合、ユーザは、2倍体ゲノム重量またはゲノムサイズおよび倍数性のような、ステップ2012において分かるゲノムに関する情報を選択するよう求められることになる。ユーザが野生型濃度のソースとしてqPCR読み値を有する場合、ユーザは、ステップ2014において、Ct値が希釈系列を用いて導出されたか、または用いずに導出されたかを選択するよう尋ねられる。
その後、ステップ2016において、ユーザは、検出下限をどのように制約したいかを選択するよう求められることになる。ユーザは、たとえば、偽陽性分布または検出下限を設定することを所望し得る。
その後、ユーザは、ステップ2018において、たとえば、NanoDrop濃度、単一のCt、または使用される希釈系列に基づいて必要とされる情報を入力し得る。ユーザはまた、ステップ2020において、使用される機器のタイプ、偽陽性率、偽陰性率のような他の高度な入力をも提供し得る。
その後、様々な実施形態によれば、ユーザは、ステップ2024において、限定ではないが、野生型希釈情報、dPCR設定情報、インタラクティブなグラフ、および/または原液設定情報を含む結果情報を提供されることになる。その後、ユーザは、この情報を使用して所望の稀な変異の実験を実施することができる。
図22A〜図22Dは、本教示によって説明される様々な実施形態によるdPCR実験設計器の稀な変異のワークフロー2004を実施するユーザに表示されるユーザインターフェースを示す。図22A〜図22Dは下記により詳細に説明される。
絶対量測定ワークフロー2006のためのdPCR実験の検出属性最適化において、ユーザは、ステップ2030において、実験の目的を選択するよう求められる。たとえば、ユーザは、ダイナミックレンジを最大化すること、反応部位のチップの数を最小限に抑えること、希釈係数を計算すること、および/または検出下限を計算することを選択し得る。目的がダイナミックレンジを最大化することであることをユーザが選択する場合、ユーザは、ステップ2032において、ダイナミックレンジをどのように制約したいかを選択することを求められる。ユーザが選択する目的に応じて、ユーザはステップ2034において異なる情報を入力する。ユーザはまた、ステップ2036において、使用される機器のタイプ、特定の希釈において使用されるチップの数(既知の反応部位数を含む)、偽陽性率、および偽陰性率のような、高度な入力をも提供し得る。ステップ2038において結果がユーザに提供される。
図21A〜図21Dは、本教示によって説明される様々な実施形態による検出属性最適化ワークフロー2006を実施するユーザに表示されるdPCR実験設計器のユーザインターフェースを示す。図21A〜図21Dは下記により詳細に説明される。
デジタル実験ワークフロー2008の希釈係数を推定するためのqPCRまたはNanoDropデータの使用において、ユーザは、ステップ2050において、自身が有するデータのタイプを入力するよう求められることになる。たとえば、ユーザがNanoDropデータを有する場合、ユーザは、ステップ2052において、2倍数ゲノム重量ならびにゲノムサイズおよび倍数性のタイプを入力するよう求められることになる。ユーザがqPCRデータを有する場合、ユーザは、ステップ2054において、導出されたCt値が希釈系列を用いたか、または用いなかったかを選択するよう求められることになる。次に、ユーザは、ステップ2056において、実験のタイプを選択するよう求められることになる。実験のタイプは、たとえば、シングルプレックス、デュプレックス、SNPアッセイ、またはカスタムであってもよい。ユーザは、ステップ2058において、前の質問において選択された情報に応じて他の情報を入力するよう求められる場合がある。さらに、ステップ2058において、ユーザはまた、原液−反応混合物希釈係数を求めるのに必要とされるパラメータを入力するようにも求められる場合がある。ステップ2060において、ユーザは他の高度な入力を提供し得る。ステップ2062において、ユーザは、使用したデータのタイプ、たとえば、qPCRまたはNanoDropに基づいて結果を提供され得る。
図21A、図21B、図21C、および図21Dは、dPCR実験設計器を使用した遺伝子発現定量化ワークフローのためのステップを含む方法の一例を示している。測定精度要件および最小複製/反応入力が、デジタルPCRモデルを使用してダイナミックレンジ拡大希釈係数を推定するのに使用される。
図22A、図22B、図22C、および図22Dは、デジタルPCR実験設計器を使用した稀な変異の検出実験設計のステップを示している。一例において、ユーザは最初に、qPCR実験またはナノドロップ読み取りを実行して、自身のサンプル中に存在する野生型標的を定量化することができる。この情報は、dPCR実験設計器によって、所望の複製/反応におけるバックグラウンドの検出を可能にするための標的デジタルPCR希釈係数を推定するために使用され得る。加えて、dPCR実験設計器は、ユーザが、アッセイおよびシステムの偽陽性分布に関して何を実験的に求めることができるかを入力することを可能にする。その後、ユーザは、非標的制御を実行して、実験において一般的に見られる擬陽性の数の平均および標準偏差を求めることができる。この情報は、標的倍率変化および標的p値とともに、dPCR実験設計器が、デジタルPCRモデルを使用してバックグラウンドを上回る所望の信頼水準において稀な事象を検出するのに必要なチップの数を推定することを可能にすることができる。
定量化結果
定量化結果
この節は、dPCRシステムにおける1〜1e6複製/μlの範囲の定量化を説明する。この例において、Life Technologies製のQuantStudio 3Dが2チップ2希釈液方針で使用される。モデルに関連して、要件は、1複製/μlの検出下限で、6logのダイナミックレンジ(DR)である。0.025%の偽陽性率および0.05%の偽陰性率を使用すると、dPCR実験設計器は、0.001の希釈係数の推奨をもたらす。
6log離れているサンプルAA〜GGは、チップの希釈されていない対および希釈されている対において、下記の表に与えられる濃度にある。強調されている濃度はシステム上で実行された。これはシミュレーションされた例であるため、このシステムによって検出可能でなかった濃度は実行されなかった。
図23Aは、本明細書において説明される実施形態による、上述のモデルに基づく定量化結果を示す。ここで、サンプルAA、BBおよびCCは希釈チップ上で正確に定量化されており、一方でサンプルEE、FFおよびGGは非希釈チップ上で正確に定量化された。サンプルDDは両方のデータ点を使用して定量化された。図23Bは、本明細書において説明される様々な実施形態によるdPCR実験設計器において使用されるモデリング方式にサンプルを投影している。
比推定結果
比推定結果
以下の節は、2チップ2希釈液戦略によるコンピュータシミュレーションデータを使用したバックグラウンド信号に対する稀な標的の検出を説明する。1:1000の比が、3logのダイナミックレンジ要件に変換可能である。検出下限は10複製/μlに設定された。モデルのシステムパラメータは、Life Technologies QuantStudio 12K Flexに従って選択された。0.07%の偽陽性率および0.18%の偽陰性率を使用すると、システムは、30%の精度よりも良好な各標的における検出について0.005の希釈係数を推奨した。
図24は、1000倍のバックグラウンドの存在下での稀な標的の推定を示すモデルを示す。サンプルAは、10000複製/μlの豊富な標的および10複製/μlの稀な標的でシミュレートされた。希釈されていない構成および希釈された構成の両方において、このデータから多数回の反復にわたってサブサンプリングすることによって、6.95%の精度で希釈点において野生型が検出され、一方で、4.49%の精度で希釈されていない点において稀な標的が検出された。比は0.001で正確に予測された。
コンピュータ・システム
コンピュータ・システム
様々な実施形態の動作は、必要に応じて、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、またはそれらの組合せを使用して実施されてもよいことを当業者は認識しよう。たとえば、いくつかのプロセスは、ソフトウェア、ファームウェア、または配線論理の制御下でプロセッサまたは他のデジタル回路を使用して実行することができる。(「論理」という用語は、本明細書においては、記載されている機能を実行するための技術分野における当業者によって認識されるように、固定ハードウェア、プログラム可能論理および/またはそれらの適切な組合せを指す。)ソフトウェアおよびファームウェアは、コンピュータ可読媒体に記憶することができる。何らかの他のプロセスは、当業者には既知であるように、アナログ回路を使用して実施することができる。加えて、メモリまたは他のストレージ、および通信構成要素が、本発明の実施形態に利用されてもよい。
図19は、dPCR実験設計器の様々な実施形態による、処理機能を実行するのに利用されてもよいコンピューティングシステム1900を示すブロック図である。コンピューティングシステム1900は、プロセッサ1904のような、1つまたは複数のプロセッサを含むことができる。プロセッサ1904は、たとえば、マイクロプロセッサ、コントローラまたは他の制御論理のような汎用または専用処理エンジンを使用して実装することができる。この例において、プロセッサ1904はバス1902または他の通信媒体に接続されている。
さらに、図19のコンピューティングシステム1900は、ラックマウント式コンピュータ、メインフレーム、スーパーコンピュータ、サーバ、クライアント、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、タブレットコンピュータ、ハンドヘルドコンピューティングデバイス(たとえば、PDA、携帯電話、スマートフォン、パームトップなど)、クラスタグリッド、ネットブック、埋め込みシステム、所与の用途または環境に望ましいまたは適切であり得るような任意の他のタイプの専用または汎用コンピューティングデバイスのような、いくつかの形態のいずれかにおいて具現化されてもよいことが諒解されるべきである。加えて、コンピューティングシステム1900は、クライアント/サーバ環境および1つもしくは複数のデータベースサーバを含む従来のネットワークシステム、またはLIS/LIMSインフラストラクチャとの一体化を含み得る。ローカルエリアネットワーク(LAN)または広域ネットワーク(WAN)を含み、無線および/または有線構成要素を含むいくつかの従来のネットワークシステムが当該技術分野において既知である。加えて、クライアント/サーバ環境、データベースサーバ、およびネットワークについては当該技術分野において十分な文献がある。
コンピューティングシステム1900は、情報を通信するためのバス1902または他の通信メカニズムと、情報を処理するためにバス1902と結合されているプロセッサ1904とを含んでもよい。
コンピューティングシステム1900はまた、プロセッサ1904によって実行されるべき命令を記憶するための、バス1902に結合されている、ランダムアクセスメモリ(RAM)または他の動的メモリとすることができるメモリ1906をも含む。メモリ1906はまた、プロセッサ1904によって実行されるべき命令の実行中に一時変数または他の中間情報を記憶するのにも使用されてもよい。コンピューティングシステム1900は、プロセッサ1904のための静的情報および命令を記憶するための、バス1902に結合されている、読み出し専用メモリ(ROM)1908または他の静的記憶デバイスをさらに含む。
コンピューティングシステム1900はまた、磁気ディスク、光ディスクのような記憶デバイス1910をも含んでもよく、または、情報および命令を記憶するためにソリッドステートドライブ(SSD)が提供されてバス1902に結合される。記憶デバイス1910は、メディアドライブおよび取り外し可能ストレージインターフェースを含んでもよい。メディアドライブは、ハードディスクドライブ、フロッピー(登録商標)ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、CDまたはDVDドライブ(RまたはRW)、フラッシュドライブ、または他の取り外し可能または固定メディアドライブのような、固定または取り外し可能記憶可能媒体をサポートするためのドライブまたは他のメカニズムを含んでもよい。これらの例が示すように、記憶媒体は、特定のコンピュータソフトウェア、命令、またはデータを内部に記憶しているコンピュータ可読記憶媒体を含んでもよい。
代替的な実施形態において、記憶デバイス1910は、コンピュータプログラムまたは他の命令もしくはデータがコンピューティングシステム1900にロードされることを可能にするための他の同様の手段を含んでもよい。そのような手段は、たとえば、プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース、取り外し可能メモリ(たとえば、フラッシュメモリまたは他の取り外し可能メモリモジュール)およびメモリスロット、ならびに、ソフトウェアおよびデータが記憶デバイス1910からコンピューティングシステム1900に転送されることを可能にする他の取り外し可能記憶ユニットおよびインターフェースのような、取り外し可能記憶ユニットおよびインターフェースを含んでもよい。
コンピューティングシステム1900はまた、通信インターフェース1918をも含むことができる。通信インターフェース1918は、ソフトウェアおよびデータがコンピューティングシステム1900と外部デバイスとの間で転送されることを可能にするために使用され得る。通信インターフェース1918の例は、モデム、ネットワークインターフェース(Ethernet(登録商標)または他のNICカードなど)、通信ポート(たとえば、USBポート、RS−232Cシリアルポートなど)、PCMCIAスロットおよびカード、Bluetooth(登録商標)などを含み得る。通信インターフェース1918を介して転送されるソフトウェアおよびデータは、通信インターフェース1918によって受信されることが可能な電子信号、電磁信号、光信号または他の信号の形態にある。これらの信号は、無線媒体、ワイヤもしくはケーブル、光ファイバ、または他の通信媒体のようなチャネルを介して通信インターフェース1918によって送受信されてもよい。チャネルのいくつかの例は、電話回線、携帯電話リンク、RFリンク、ネットワークインターフェース、ローカルエリアネットワークまたは広域ネットワーク、および他の通信チャネルを含む。
コンピューティングシステム1900は、バス1902を介して、情報をコンピュータユーザに表示するための、陰極線管(CRT)または液晶ディスプレイ(LCD)のようなディスプレイ1912に結合されてもよい。英数字および他のキーを含む入力デバイス1914が、たとえば、プロセッサ1904に情報およびコマンド選択を通信するためにバス1902に結合されている。入力デバイスはまた、タッチスクリーン入力機能を有して構成されているLCDディスプレイのようなディスプレイであってもよい。別のタイプのユーザ入力デバイスが、方向情報およびコマンド選択をプロセッサ1904に通信し、ディスプレイ1912上のカーソル移動を制御するための、マウス、トラックボールまたはカーソル方向キーのような、カーソル制御装置1916である。この入力デバイスは一般的に、デバイスが平面内の位置を指定することを可能にする、2つの軸、すなわち、第1の軸(たとえば、x)および第2の軸(たとえば、y)における2自由度を有する。コンピューティングシステム1900は、データ処理を可能にし、そのようなデータの一定の信頼水準をもたらす。本教示の実施形態の特定の実施態様と一致して、データ処理および信頼値は、プロセッサ1904がメモリ1906に含まれている1つまたは複数の命令の1つまたは複数のシーケンスを実行するのに応答してコンピューティングシステム1900によって提供される。そのような命令は、記憶デバイス1910のような別のコンピュータ可読媒体からメモリ1906に読み出されてもよい。メモリ1906に含まれている命令シーケンスの実行が、プロセッサ1904に、本明細書において説明されているプロセス状態を実施させる。代替的に、本教示の実施形態を実装するために、ソフトウェア命令の代わりに、またはソフトウェア命令と組み合わせて、配線回路が使用されてもよい。したがって、本教示の実施形態の実施態様は、ハードウェア回路およびソフトウェアのいかなる特定の組合せにも限定されない。
「コンピュータ可読媒体」および「コンピュータプログラム製品」という用語は、本明細書において使用されている場合、一般的に、1つもしくは複数のシーケンスまたは1つもしくは複数の命令を実行のためにプロセッサ1904に提供するのに関与する任意の媒体を指す。一般的に「コンピュータプログラムコード」と称されるそのような命令(コンピュータプログラムまたは他のグループ分けの形態でグループ化され得る)は、実行されると、コンピューティングシステム1900が、本発明の実施形態の特徴または機能を実施することを可能にする。これらのおよび他の形態のコンピュータ可読媒体は、限定ではないが、不揮発性媒体、揮発性媒体、および伝送媒体を含む多くの形態をとってもよい。不揮発性媒体は、たとえば、記憶デバイス1910のような、ソリッドステート、光または磁気ディスクを含む。揮発性媒体は、メモリ1906のような動的メモリを含む。伝送媒体は、バス1902を含むワイヤを含む、同軸ケーブル、銅線、および光ファイバを含む。
一般的な形態のコンピュータ可読媒体は、たとえば、フロッピー(登録商標)ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、もしくは任意の他の磁気媒体、CD−ROM、任意の他の光媒体、パンチカード、紙テープ、穿孔パターンを有する任意の他の物理媒体、RAM、PROM、およびEPROM、FLASH−EPROM、ならびに任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、以下に説明するような搬送波、またはコンピュータがそこから読み出すことができる任意の他の媒体を含む。
様々な形態のコンピュータ可読媒体が、1つまたは複数の命令の1つまたは複数のシーケンスを実行のためにプロセッサ1904に搬送するのに関与してもよい。たとえば、命令は、最初は遠隔コンピュータの磁気ディスク上に保持されていてもよい。遠隔コンピュータは、命令をその動的メモリにロードして、モデムを使用して電話回線にわたって命令を送信することができる。コンピューティングシステム1900に対してローカルなモデムが、電話回線上のデータを受信して、赤外線送信機を使用してデータを赤外線信号に変換することができる。バス1902に結合されている赤外線検出器が、赤外線信号内に保持されているデータを受信して、データをバス1902上に置くことができる。バス1902はデータをメモリ1906に搬送し、そのデータから、プロセッサ1904は命令を取り出し実行する。メモリ1906によって受信される命令は任意選択的に、プロセッサ1904による実行の前または後のいずれかに、記憶デバイス1910に記憶されてもよい。
明瞭にする目的で、上記の記載は、種々の機能ユニットおよびプロセッサを参照して本発明の実施形態を説明してきたことが諒解されよう。しかしながら、本発明から逸脱することなく、種々の機能ユニット、プロセッサまたは領域の間での機能の任意の適切な分散が使用されてもよいことが諒解されよう。たとえば、別個のプロセッサまたはコントローラによって実施されるように示されている機能は、同じプロセッサまたはコントローラによって実施されてもよい。したがって、特定の機能ユニットへの参照は、厳密な論理的または物理的構造または編成を示すのではなく、記載されている機能を提供するための適切な手段に対する参照としてのみ見られるべきである。
本発明を特定の例示的な実施形態、例、および用途に関して説明してきたが、本発明から逸脱することなく様々な修正および変更が行われてもよいことが当業者には諒解されよう。
Claims (47)
- デジタルPCR(dPCR)実験を設計するための方法であって、前記方法は、
ユーザから、最適化タイプの選択を受信することと、
前記ユーザから、実験の精度基準を受信することと、
前記ユーザから、前記実験の反応部位における標的の最小濃度を受信することと、
前記最適化タイプに基づいて前記実験のdPCR実験設計要因セットを決定することと、
前記dPCR実験設計要因セットを前記ユーザに表示することと
を含む、方法。 - 前記最適化タイプはダイナミックレンジを最大化することである、請求項1に記載の方法。
- 前記最適化タイプは基板の数を最小限に抑えることであり、各基板は所定数の反応部位を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記最適化タイプは希釈係数を計算することである、請求項1に記載の方法。
- 前記最適化タイプは検出下限を計算することである、請求項1に記載の方法。
- 前記ユーザから前記実験において使用されることになる原液情報を受信することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 原液−反応混合物希釈係数を求めることと、
前記原液−反応混合物希釈係数を前記ユーザに表示することと
をさらに含む、請求項6に記載の方法。 - 前記dPCR実験設計要因セットは、単回希釈のダイナミックレンジを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記dPCR実験設計要因セットは、最小および最大の単回希釈の検出範囲を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記dPCR実験設計要因セットは、複数回希釈のダイナミックレンジを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記dPCR実験設計要因セットは、最小および最大の複数回希釈の検出範囲を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記実験の前記dPCR実験設計要因セットを求めることは、体積変動に基づいて計算することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記実験の前記dPCR実験設計要因セットを求めることは、偽陽性および偽陰性モデルに基づいて計算することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記実験の前記dPCR実験設計要因セットを求めることは、予測される反応漏れに基づいて計算することを含む、請求項1に記載の方法。
- プロセッサによって実行可能な命令を符号化されている持続性コンピュータ可読記憶媒体であって、前記命令は、
ユーザから、最適化タイプの選択を受信するための命令と、
前記ユーザから、実験の精度基準を受信するための命令と、
前記ユーザから、前記実験の反応部位における標的の最小濃度を受信するための命令と、
前記最適化タイプに基づいて前記実験のdPCR実験設計要因セットを決定するための命令と、
前記dPCR実験設計要因セットを前記ユーザに表示するための命令と
を含む、持続性コンピュータ可読記憶媒体。 - 前記最適化タイプはダイナミックレンジを最大化することである、請求項15に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。
- 前記最適化タイプは基板の数を最小限に抑えることであり、各基板は所定数の反応部位を含む、請求項15に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。
- 前記最適化タイプは希釈係数を計算することである、請求項15に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。
- 前記最適化タイプは検出下限を計算することである、請求項15に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。
- 前記ユーザから前記実験において使用されることになる原液情報を受信するための命令をさらに含む、請求項15に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。
- 原液−反応混合物希釈係数を求めることと、
前記原液−反応混合物希釈係数を前記ユーザに表示することと
をさらに含む、請求項20に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。 - 前記dPCR実験設計要因セットは、単回希釈のダイナミックレンジを含む、請求項15に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。
- 前記dPCR実験設計要因セットは、最小および最大の単回希釈の検出範囲を含む、請求項15に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。
- 前記dPCR実験設計要因セットは、複数回希釈のダイナミックレンジを含む、請求項15に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。
- 前記dPCR実験設計要因セットは、最小および最大の複数回希釈の検出範囲を含む、請求項15に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。
- 前記実験の前記dPCR実験設計要因セットを求めることは、体積変動に基づいて計算することを含む、請求項15に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。
- 前記実験の前記dPCR実験設計要因セットを求めることは、偽陽性および偽陰性モデルに基づいて計算することを含む、請求項15に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。
- 前記実験の前記dPCR実験設計要因セットを求めることは、予測される反応漏れに基づいて計算することを含む、請求項15に記載の持続性コンピュータ可読記憶媒体。
- デジタルPCRシステムを設計するためのシステムであって、前記システムは、
プロセッサと、
前記プロセッサによって実行可能な命令を符号化されているメモリと
を含み、前記命令は、
ユーザから、最適化タイプの選択を受信するための命令と、
前記ユーザから、実験の精度基準を受信するための命令と、
前記ユーザから、前記実験の反応部位における標的の最小濃度を受信するための命令と、
前記最適化タイプに基づいて前記実験のdPCR実験設計要因セットを決定するための命令と、
前記dPCR実験設計要因セットを前記ユーザに表示するための命令と
を含む、システム。 - 前記最適化タイプはダイナミックレンジを最大化することである、請求項29に記載のシステム。
- 前記最適化タイプは基板の数を最小限に抑えることであり、各基板は所定数の反応部位を含む、請求項29に記載のシステム。
- 前記最適化タイプは希釈係数を計算することである、請求項29に記載のシステム。
- 前記最適化タイプは検出下限を計算することである、請求項29に記載のシステム。
- 前記ユーザから前記実験において使用されることになる原液情報を受信するための命令をさらに含む、請求項29に記載のシステム。
- 原液−反応混合物希釈係数を求めることと、
前記原液−反応混合物希釈係数を前記ユーザに表示することと
をさらに含む、請求項34に記載のシステム。 - 前記dPCR実験設計要因セットは、単回希釈のダイナミックレンジを含む、請求項29に記載のシステム。
- 前記dPCR実験設計要因セットは、最小および最大の単回希釈の検出範囲を含む、請求項29に記載のシステム。
- 前記dPCR実験設計要因セットは、複数回希釈のダイナミックレンジを含む、請求項29に記載のシステム。
- 前記dPCR実験設計要因セットは、最小および最大の複数回希釈の検出範囲を含む、請求項29に記載のシステム。
- 前記実験の前記dPCR実験設計要因セットを求めることは、体積変動に基づいて計算することを含む、請求項29に記載のシステム。
- 前記実験の前記dPCR実験設計要因セットを求めることは、偽陽性および偽陰性モデルに基づいて計算することを含む、請求項29に記載のシステム。
- 前記実験の前記dPCR実験設計要因セットを求めることは、予測される反応漏れに基づいて計算することを含む、請求項29に記載のシステム。
- デジタルPCR(dPCR)実験を設計するための方法であって、前記方法は、
ユーザから、濃度データタイプの選択を受信することと、
前記ユーザから、実験のゲノム情報を受信することと、
前記ユーザから、前記実験の検出下限基準を受信することと、
前記ユーザから、前記実験の所望の倍率変化を受信することと、
前記濃度データタイプに基づいて前記実験のdPCR実験設計要因セットを決定することと、
前記dPCR実験設計要因セットを前記ユーザに表示することと
を含む、方法。 - 前記dPCR実験設計要因セットは、前記実験の野生型希釈情報を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記dPCR実験設計要因セットは、前記ユーザが前記実験に使用し得る基板の数を含み、各基板は既知の数の反応部位を有する、請求項43に記載の方法。
- 前記ユーザから前記実験において使用されることになる原液情報を受信することをさらに含む、請求項43に記載の方法。
- 原液−反応混合物希釈係数を求めることと、
前記原液−反応混合物希釈係数を前記ユーザに表示することと
をさらに含む、請求項46に記載の方法。
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