CN102191314A

CN102191314A - 一种基于pcr的低成本、简单、高效的snp检测方法

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Publication number: CN102191314A
Application number: CN2010101393705A
Authority: CN
Inventors: 孙朝辉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-03-12
Filing date: 2010-03-12
Publication date: 2011-09-21

Abstract

本发明提供了一种基于PCR的低成本，简单、高效的SNP检测方法；该方法能一次检测多个SNP，检测效率高，特异性好。本发明针对不同SNP的不同等位基因设计长度特异的引物；通过生物信息学算法优化PCR引物和实验方案，使得PCR反应能够高效的多重化，并最大程度地消除引物间的相互干扰和非特异性扩增；最终，多个SNP的不同等位基因都可以通过简单检测PCR产物长度清楚地、特异地区分开，因此PCR检测的效率和可靠性得到最大化。与现有的基因芯片，Infinium等大规模检测方法相比，本发明设备要求简单，成本低，对于针对一组数目不大的SNP的低成本的检测需要，本发明的方法具有优越性。

Description

一种基于PCR的低成本、简单、高效的SNP检测方法

专利领域

本发明属于生物技术，涉及遗传学检测领域。

技术背景

近年来，随着大规模DNA(脱氧核糖核酸)测序技术的迅速发展，科学家已经能够广泛了解重要的DNA区域的编码，并研究不同人的个体之间的DNA差异；遗传学家利用这些手段和数据做了大量研究，成功地找到了许多人的遗传多样性与疾病或其他性状的联系。科学家研究最多的遗传标记是单核苷酸多态性(SNP)，即同一物种的不同个体在基因组DNA某一单核苷酸位点上的差异。SNP有广泛的用途。SNP对疾病产生的机制有影响，也对个体对药物，病原体，疫苗的反应有影响。类似的，SNP在别的生物学领域，比如对于庄稼和牲畜的培育都有重要作用。

由于SNP在科学研究和应用上的价值，已经涌现出多种SNP分型(检测)的技术(参考资料1)。下面对主要的技术进行分类介绍。

1.测序。最常见的方式是对包括该SNP的周边区域的DNA进行测序。这种方法较为直接可靠，被很多遗传学科研实验室采用。其缺点是需要昂贵的测序设备，费用高，通量低速度慢。

2.限制性内切酶长度多样性(RFLP)。这是最早最简单的一种检测方法。限制性内切酶有很多种，每种都能以很高的亲合力与特异的DNA限制性位点结合并切断DNA。在使用多种限制性内切酶对基因组DNA进行消化后，再用凝胶电泳检测片断大小，就有可能知道内切酶是否切断了一个预期的限制性位点。如果没有切断，则胶电泳检测不到那个预期大小的片断，则表明该位点(SNP)有不同的核苷酸。然而，由于真核生物基因组的复杂性及这种方法针对不同位点需要特定内切酶的特性，该方法一个反应往往只能做一个位点，无法增加通量。

3.PCR方法。针对SNP的不同的等位基因设计不同引物对该位点进行PCR扩增。这些引物与SNP周边的序列配对，但每种只与SNP上的一个等位基因配对。每种不同的引物只扩增出与之对应的SNP等位基因型。两种引物得到的产物片段大小有一定的差异，因此可以通过检测区分。PCR方法简单，设备需要小，较为经济，但设计出特异性好又能高效多重化的引物则有较大难度，并且实验经常需要摸索条件，因而也不容易做高通量的检测。

4.翻转内切酶法(Flap-endonuclease，或FEN)。两个不同的寡聚核苷酸探针与一个SNP相结合，形成一定的结构，然后一种内切酶识别这个结构并将DNA切断。其中，第一个探针与SNP的3’端DNA结合，第二个探针与特定的SNP等位基因结合。通过使用不同的第二探针，就可以检测不同的SNP等位基因型。这里，DNA切割可以用荧光共震能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer，或FRET)系统来探测。该方法的灵敏度和特异性都较好，但目前也只能一次做单个SNP的检测。

5.引物延伸法。这种方法有两个步骤。首先，特异的探针与SNP位点的直接上游结合。然后，DNA多聚酶将探针的DNA延伸，使之含有该SNP的核苷酸。SNP的不同等位基因可以通过荧光标记检测。一种常用的方法是在反应中加入带有不同荧光标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)，在引物与SNP上游结合后让其延伸单个碱基，然后通过检测加上的不同ddNTP的荧光，就可以知道这个SNP的等位基因是哪个。Sequenom′s iPLEX系统采用了这种方法，并用质谱仪来检测。该方法适合用来检测中等数目(小于40)的SNP，但需要较昂贵的专门仪器。Illumina的Infinium系统也是基于这类方法，但它使用了抗体检测。该方法可以做超过10000个SNP的检测，适合全基因组扫描，但是价格较贵。APEX-2方法则将引物延伸法与基因芯片技术结合起来，也能达到高通量。

6.5’-核酸酶法。TaqMan检测法利用了Taq DNA多聚酶的5’核酸酶活性。这种方法用5’和3’端的PCR引物来扩增含SNP的区域，再用FRET系统结合两个特异的DNA探针来区分不同的等位基因。这些探针在5’端有荧光基团，3’端有熄灭基团，因此在探针完整时不产生荧光。在PCR过程中，如果该探针序列与SNP特异配对，则可以与目标DNA完美结合，然后Taq酶在进行DNA扩增时就可以将探针的5’端降解，荧光基团就游离出来并发光。如果该探针序列与SNP不特异配对，则与目标DNA不能完美结合，5’核酸酶活性就无法使探针的5’端降解。TaqMan法可以用来检测最多7个SNP。如果在一块板上同时进行多个反应，可以达到很高的通量。

7.SNP基因芯片。高密度寡聚核苷酸SNP芯片可以在一个小的芯片上排列几十万个探针，使得大量的SNP可以同时检测。由于SNP的等位基因只相差一个核苷酸，要让芯片上所有探针的杂交条件都达到最优化是有难度的。这个问题在一定程度上可以通过对一个SNP重复性地选取几个探针来解决。在这些重复性的探针上，SNP处于不同的位置，并且有些探针与SNP等位基因是错误配对的。通过比较目标DNA与这些重复性探针的杂交强度，就有可能判定特异的纯合或杂合的SNP等位基因。相对来讲，SNP基因芯片的灵敏度和特异性都较低，但是，由于其超大规模的特性，对于全基因组扫描它有非常大的优势。Affymetrix公司的GeneChip是个广泛使用的SNP基因芯片，它可以检测超过50万的SNP。

8.基于DNA物理性质的方法。这些方法包括单链构象多态性，温度梯度胶电泳，变性高效液相色谱法(DHPLC)等。这些方法可以达到很好的特异性，但是都需要高度优化的实验条件，也很难提高通量。

在现有的方法中，基因芯片、Infinium等大规模方法可同时检测成千上万的SNP，但是成本较高且需要特殊设备。比如说，一个基因芯片至少要几百美元，但至多只能用来做少数几次检测。这些方法适合全基因组SNP扫描。但是，如果在一个小成本实验室，科研人员只是对一小组SNP(比如，10到20个)感兴趣，这些方法则显得昂贵且不合适。其他的方法，比如测序，RFLP，FEN等，虽然简单经济，但主要适合做单个SNP检测，用来检测多个SNP效率很低。用多重PCR来检测多个SNP，会遇到引物相互干扰，非特异性扩增，引物与基因组别处匹配等难题；并且一旦PCR产物种类一多，区分它们就有难度，如果用荧光标记引物或毛细管电泳来检测，就需要特别设备，检测成本就大大上升。因此，如果科研人员知道数目不大的一组SNP与某个性状或疾病相关，并想寻找一种快捷又成本非常低的方法来检测这组SNP，就很难找到合适的方法。本发明设计了一种新的基于多重PCR的方法，用一整套的生物信息学方法来辅助实验设计，能够迅速找到最优化的一套引物和实验设计方案，从而能使用简单方法特异地、高效地分辨多个SNP，因此提供了检测一组SNP的一种低成本、简单、有效的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用来检测一组SNP的低成本，简单、效率高的检测方法；该方法能一次检测多个SNP，检测效率高、特异性好，并且只需简单的分子生物学设备。

本发明是一种基于PCR的方法，主要特点是采用多对针对不同SNP等位基因的特异性引物进行多重PCR扩增；通过一种算法找到使检测SNP的数目最大的PCR产物长度分配方案，以及用生物信息学的方法寻找最优引物设计来消除引物的相互干扰和非特异性扩增；最终，多个SNP的不同等位基因都可以通过简单检测PCR产物长度清楚地、特异地区分开。我们实验设计的算法既考虑了结果的完全性，又对运行时间作了很好的控制。这个算法可以编写计算机程序来实现，从而使实验设计快速准确。此方法适合同时检测一组数目不大(小于20)的SNP。本发明的目的是通过以下的具体方法和步骤来实现的。

PCR检测SNP原理：本发明采用的PCR方法需要两对引物。引物1(中心引物)的3’端与DNA的A链的SNP的一个等位基因配对，引物2(侧端引物)与A链下游的序列配对，引物1和2可以从带有这个SNP等位基因的DNA特异扩增出一个长度为a的片段。引物3(中心引物)的3’端与DNA的B链中SNP的另一个等位基因配对，引物4(侧端引物)与B链下游的序列配对，这样，引物3和4可以从带有此SNP另一个等位基因的DNA扩增出长度为b的片段。中心引物1和3与特异的SNP等位基因配对。侧端引物2与4则不管SNP的等位基因是什么，都可以扩增出长度为a+b的片段。这个片段可以作为阳性对照。这样，通过检测PCR产物的长度就可以知道此SNP的基因型。如果a和b两个片段都出现，则模板DNA是杂合基因型。

穷尽搜索非特异性扩增：目前，人们在作引物与目标DNA的比较时，一般使用BLAST。然而，BLAST是一种经验算法，在比较短DNA序列时往往不能找全所有的配对序列。由于引物序列都较短，因此BLAST就不是对此最合适的方法。这里应当使用能把所有匹配序列都找到的“穷尽的序列比较方法”。本发明使用了一种穷尽的序列比较方法TAGSCAN(参考资料2)，可以迅速找到所有的配对的短片段DNA。在本发明方法的第二步中，采用了这种方法来寻找所有的非特异性扩增，步骤如下。首先根据退火温度确定最小匹配区段长度R及最大错配数目E。将一个长度为R的窗口在第一个引物序列上从头到尾移动，每次移动一个核苷酸，并且每次将窗口中DNA片段的序列及最大错配数目E输入到TAGSCAN中，寻找在目标基因组中匹配的所有位置，将在所有窗口找到的匹配位置汇总到P＝(p₁，p₂，……p_y-1，p_y)。同样的，找到第二个引物在基因组上匹配的所有位置Q＝(q₁，q₂，……q_x-1，q_x)。将P中的每个位置与Q中的每个位置相比较，对于任何一个组合p_i和q_j，如果它们在同一个染色体上并且距离小于最大检测长度L，则p_i和q_j之间的DNA区段是这对引物的一个非特异性扩增。在比较过所有位置后，所有可能检测到的非特异性扩增片段就找到了。

本发明的操作步骤如下：

第一步，确定PCR产物长度分配；根据检测DNA(PCR产物)的设备手段的特性，推导出使用这种手段能检测到最多SNP的方案。在进行具体实验设计之前，需要确定用来分辨PCR产物的仪器手段(比如，凝胶电泳)。

根据所使用的手段检测DNA的长度范围和分辨率(长度差)，就可以知道它至多可以分辨出几种不同长度的DNA。假设可以检测DNA长度范围是(0，L)个碱基对，分辨率是S个碱基对，则至多可以分辨N＝L/S个不同PCR产物。在不同的长度范围内，分辨率S可能是不同的，这点要考虑到。在本发明中，每个SNP可能有三种不同的PCR产物a、b、和c，其中他们的长度a+b＝c。本发明的第一步，就是通过以下的算法，找到一种SNP的PCR产物长度的组合，使得能尽量利用DNA检测手段所提供的长度空间，从而能分辨尽可能多的SNP。由于每个SNP的PCR产物a、b、c的长度可以灵活变动，这个问题抽象后就是：

如果有一个数列1，2，…，N-1，N，每个SNP从此数列中抽取三个不同的数a、b、c，使得a+b＝c；每个SNP抽取的数不能相同；要找到一个抽取数字的方式，使得尽可能多的SNP能抽到数。

本发明的算法是从数列的两端(靠近1和N)及从数列的中心点附近轮流取数，一个SNP接着一个SNP地取。流程如下：

1)为第一个SNP(a、b、c)抽取1、N-1、和N。

2)确定一个中心数M。第二个SNP抽取N-2-M、M和N-2。若N是奇数，M＝N/2；若是偶数，M＝N/2+1。

3)第3个SNP取数方式类似第1步，但a＝2，取出数为2、N-5、N-3；第4个SNP则照第2步的取法，但b＝M+1，取出数为N-5-M、M+1和N-4。如此轮流地取数，c的值逐步下降。如果a、b或c的预期数值已被取出，则取下一个可能的数字组合。这样往下执行，直到照第2步取数方式已无法取到数。

4)这时，只照第1步的方式取数，c的值继续逐步下降，直到剩下的数中没有三个数能使a+b＝c成立。

本算法的好处是从两端和从中间轮流取数，使得数列的每个区段都能被抽到，基本上使所有的数都不会被浪费。用本算法对一些数列做了试验，效果良好。对很多数列都达到了最佳效果，比如，N＝15，16或17时，理论上最多只能容纳15/3＝5套SNP(a、b、c)的数字组合，用本算法得出的抽取方式能得到5个SNP，达到了最理想的数目。当N＝26时，理论上最多只能容纳8套SNP，本算法也能得到8个SNP。在最差的情况下，本算法得出的抽数方式也能至少得到N/3-1个SNP(比最理想值少1个)。在为每个SNP得到一个(a，b，c)数组后，其PCR产物的长度就是a×S、b×S、c×S，其中S为分辨率。

因此，通过这个算法的计算，我们可以找到一种效率最高的PCR产物的长度分配方案，使得一次能检测尽量多的SNP。而这个方案中的PCR产物长度将用来直接指导下面的引物设计。

第二步，按照以下流程/算法进行所有PCR引物设计及优化；这里综合考虑第一步得出的引物长度，目标基因组序列，及DNA结合的热动力学，并使用了一种穷尽搜索的方法来寻找非特异性扩增，因此设计出的一套引物能检测尽量多的SNP，并能尽量降低PCR中非特异性扩增和引物二聚体形成。检测的效率和准确性都得以优化。

假定要检测n个SNP：SNP₁，SNP₂，……，SNP_n-1，SNP_n，而且在前面步骤中已得到了h个SNP的PCR产物长度分配方案，h≥n，通过以下步骤可以完成所有SNP的引物优化设计。

先从SNP₁开始(i＝1)，进行下面循环(直到设计好所有SNP的引物，即i＝n)，每次为一个SNP(SNP_i)设计引物，。预期的退火温度为Tm。

1)从前面得到的PCR产物的长度分配方案中，为SNP_i选取一套产物长度(a、b、c)，使得a+b＝c。根据基因组在SNP_i周边的序列及这两个PCR产物的长度(a、b)，还有退火温度范围、GC比例等参数，进行PCR引物设计(参考资料3和4)。引物2在引物1下游a个核苷酸附近的位置，也就是说产物长度约为a。同样，引物4在引物3下游b个核苷酸附近的位置。

2)将新设计的引物序列与前面已经设计的引物序列进行一一比较，主要看看引物之间是否会形成交叉二聚体。判断标准是靠近3’端的交叉二聚体的ΔG≥-5kcal/mol，引物中间区域的交叉二聚体的ΔG≥-6kcal/mol。ΔG＝ΔH-TΔS，计算方法可参照文献2和3。

a)如果SNP_i的侧端引物2或4与别的引物形成二聚体，则回到第1步，将SNP_i的侧端引物2或4的位置做变动，来消除这些二聚体。

b)如果是SNP_i的中心引物1或3与另一个SNP_k的侧端引物2或4形成二聚体，则将SNP_k的原有引物设计清除，再把SNP_k移至SNP列表的最后，即在后面再对SNP_k重新进行引物设计。

c)如果SNP_i的中心引物1或3与另一个SNP_k的中心引物1或3形成二聚体，将SNP_i中心引物1或3的长度做些调整，使形成二聚体的ΔG值达到最高。同时，对此作记录，在后面的实验中需要观察，如果这个二聚体使检测效率非常差，则可以将SNP_i移到一个分开的反应。

3)将新设计的引物序列与前面已经设计的引物序列一一配对与基因组进行比对，看是否有非特异性扩增。这里使用了一种穷尽的序列比较方法(参见前面的“穷尽寻找非特异性扩增”部分)，来迅速地在目标DNA序列中找到所有的与引物可能配对的短片段，并据此找到可能的长度小于最大检测长度L的非特异性扩增。如果扩增片段长度大于L，将不会对检测造成干扰。

a)如果SNP_i的侧端引物2或4与别的引物配对导致非特异性扩增，则回到第1步，将SNP_i 的侧端引物2或4的位置做变动，来消除这些非特异性扩增。

b)如果是SNP_i的中心引物1或3与另一个引物SNP_k的侧端引物2或4配对产生非特异扩增，则将SNP_k的原有引物设计清除，再把SNP_k移至SNP列表的最后，即在后面再对SNP_k重新进行引物设计。

c)如果SNP_i的中心引物1或3与另一个SNP_k的中心引物1或3配对产生非特异性扩增，可将SNP_i中心引物1或3的长度做些调整，使引物非特异性结合的区域变小，看是否可以消除非特异性扩增。

d)如果步骤a、b或c中无法消除非特异性扩增，则停止循环，增加引物长度和退火温度，从头开始引物设计。同时，对此作记录，在实验中观察是否该特异性扩增可以通过控制反应条件来消除；如果不能，则将SNP_i移到一个分开的反应。

第三步，使用设计好的引物对样本DNA进行PCR反应，PCR产物用预定的DNA检测设备进行分辨，每一个预期的PCR产物长度就代表一个SNP的一种基因型。因此，一个反应就可分析一个样本的多个SNP。有些情况下，特别是在引物设计时发现了有产生引物二聚体或非特异性扩增的可能性的情况下，需要对PCR的反应条件进行优化。可以设计一组dNTP，MgCl和引物的浓度梯度实验，寻找最优的反应条件。如果还不能很好消除引物二聚体或非特异性扩增的不良影响，则可以将导致问题的SNP(参见引物设计步骤)从这个反应中分离出去，或换成别的SNP，再重新进行第二步的引物设计。

本发明提供了一种检测一组SNP的一种低成本、简单、效率高的检测方法。本发明用生物信息学算法辅助实验设计，充分利用了DNA检测手段的检测空间，并考虑所有的非特异性扩增和引物相互干扰的情况，使多重PCR的效率和可靠性得到最大化；因而克服了现有PCR方法的非特异性扩增和难以简单高效地多重化等困难。而与现有的基因芯片，Infinium等价格贵并且需要特别设备的大规模检测方法相比，本发明只需要基本的分子生物学设备，不需要任何其他特殊检测设备，因此具有非常低的成本；对于针对一组数目不大的SNP的低成本的检测需要，本发明的方法具有优越性。

具体实施方案

本发明的方法适合同时检测一组数目不大(小于20)的SNP。因此，首先要选取与检测目的最相关的关键SNP，比如非常明确的与某种疾病直接相关的SNP。如果想大规模分析大范围的SNP，则不适宜用本方法。

在本发明的方法中，用凝胶电泳检测PCR产物的DNA长度是一种比较合适的手段。当然，也可以使用别的手段来检测DNA长度。不同浓度的凝胶电泳具有不同的检测长度范围和分辨率，在实际应用中可以进行选择。本发明的算法可以用计算机软件程序来实现，从而使实验设计变得操作简便并且高效。这个软件包括三个模块：1)用于确定PCR产物长度分配方案的程序；2)用于在基因组上穷尽地寻找非特异性扩增的程序；3)根据预定的PCR产物长度和基因组序列寻找最优化的引物设计的程序。这三个程序基于在发明内容中所述的相对应的算法，其中第3个模块(优化引物设计的模块)使用了第2个模块(穷尽寻找非特异性扩增的程序)。这些程序可以用不同的计算机语言来实现，并建立用户界面来辅助使用。

以下是本专利的一个典型的实施例。

假设我们知道有5个SNP与某种疾病的发病密切相关。我们采用2％凝胶电泳，其检测的DNA长度范围是800个核苷酸以下，并可以清楚分辨40个核苷酸的差别，在中心区域的分辨率还可以更高。使用这种手段可以比较轻松地检测到15种不同长度的PCR产物。首先，用前面所述的设计PCR产物长度分配方案的程序，得到以下结果(表1)。

表1.PCR产物长度

位点	PCR产物a(等位基因x)	PCR产物b(等位基因y)	PCR产物c(侧端引物扩增)
				SNP 1	约40个核苷酸	约560个核苷酸	约600个核苷酸
SNP 2	约240个核苷酸	约280个核苷酸	约520个核苷酸
				SNP 3	约80个核苷酸	约400个核苷酸	约480个核苷酸
SNP 4	约120个核苷酸	约320个核苷酸	约440个核苷酸

SNP 5

约160个核苷酸

约200个核苷酸

约360个核苷酸

从表1中可以看到，对每个SNP来说，PCR的3种产物长度a、b、c满足a+b＝c。得出的PCR产物长度的分配最充分地利用了凝胶的长度空间，因此达到了最高的效率。

然后，根据以上设计的产物长度，用前面所述的寻找最优化的引物设计的程序，来设计引物及PCR反应。在使用该程序时，一开始先选择初始参数，让引物的长度为18到22核苷酸之间，Tm为55-65摄氏度；在寻找PCR非特异性扩增时，让最小允许的配对长度为12，并且最多允许一个错配。这步算法可以迅速地优化一整套引物设计，并尽量避免引物二聚体和非特异扩增。最后，用设计的引物对样本DNA做PCR，再用2％的凝胶电泳来检测PCR产物，并根据表1中的产物长度来确定每个SNP的等位基因型。这样，我们就用这种简单、经济的方法，通过一个反应一个检测达到了快速、特异地检测多个SNP的目的。

参考资料：

1.http://en.wikipedia.org/wiki/SNP_genotyping及其中列出的参考文献。

2.Indexing Strategies for Rapid Searches of Short Words in Genome SequencesIseli C，Ambrosini G，Bucher P，Jongeneel CV，PLoS ONE.2007；2(6)：e579.

3.A computer program for selection of oligonucleotide primers for polymerasechain reactions.Lowe T，Sharefkin J，Yang SQ，Dieffenbach CW，NucleicAcids Res.1990 Apr 11；18(7)：1757-61

4.Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.Rychlik W，Spencer WJ，Rhoads RE，Nucleic Acids Res.1990 Nov 11；18(21)：6409-12

5.A unified view of polymer，dumbbell，and oligonucleotide DNAnearest-neighbor thermodynamics.SantaLucia J，Proc Natl Acad Sci USA.1998Feb 17；95(4)：1460-5

Claims

1.一种基于PCR的用于检测SNP的方法，其特征在于，a)每个SNP的每个等位基因都有一个特异的引物和相对应的长度唯一的PCR产物；b)针对检测中采用的DNA检测手段的特性，寻找一种优化的PCR产物长度分配方案，以增大检测SNP的数目；c)根据设计的PCR产物长度分配方案及待测SNP，按一定算法，逐个地设计和优化所有SNP的PCR引物。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，每个SNP有两对特异引物，引物1(中心引物)的3’端与DNA的A链的SNP的一个等位基因x配对，引物2(侧端引物)与A链下游的序列配对；引物3(中心引物)的3’端与DNA的B链的SNP的另一个等位基因y配对，引物4(侧端引物)与B链下游的序列配对；引物1和2可以从带有等位基因x的DNA扩增出长度为a的片段，引物3和4可以从带有等位基因y的DNA扩增出长度为b的片段，a不等于b。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，利用一种算法找到可以检测尽量多SNP的PCR产物长度分配方案，其步骤如下：

根据可检测的DNA长度范围(O，L)和分辨率(S)，算出可以检测的DNA的不同长度的数目为N＝L/S；

将这算法的目的抽象为：对一个数列(1，2，…，N-1，N)，每个SNP从此数列中抽取三个不同的数a、b、c，使a+b＝c，要找到一个抽取数字的方式，使得尽可能多的SNP能抽到数；

循环进行以下两个取数步骤，直到取不到合适的数为止：1)从以上数列的两端取出3个还未被取走的数a、b、c，使a+b＝c，赋给下一个SNP，2)从数列的中间点两侧取出3个还未被取走数a、b、c，使a+b＝c，赋给再下一个SNP；

根据每个SNP取到的3个数a、b、c和分辨率(S)，可得出该SNP的3个产物长度，即a×S、b×S、c×S。

4.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，在逐个为每个SNP设计引物时，将新设计的引物序列与已经设计好的引物序列进行一一比较，看看引物之间是否会形成交叉二聚体；如果该SNP的侧端引物与别的引物形成二聚体，则将该SNP的侧端引物的位置做变动，来消除这些二聚体；如果是该SNP的中心引物与另一个SNP的侧端引物形成二聚体，则将另外那个SNP移至待设计的SNP列表的最后，以待重新设计引物。

5.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，在逐个为每个SNP设计引物时，每次将新设计的引物序列与前面已经设计的引物序列一一配对，再使用穷尽的序列比较方法(可以是，但不限于TAGSCAN)与基因组进行比较，看是否有长度小于最大检测长度的非特异性扩增；如果该SNP的侧端引物与别的引物配对导致非特异性扩增，则将该SNP的侧端引物的位置做变动，来消除这些非特异性扩增；如果是该SNP的中心引物与另一个引物SNP的侧端引物配对产生非特异扩增，则将另外那个SNP移至待设计的SNP列表的最后，以待重新设计引物；如果该SNP的中心引物与别的SNP的中心引物配对产生非特异性扩增，则可将该SNP中心引物的长度做调整，以试图消除非特异性扩增；如果无法通过调整引物来消除非特异性扩增，则可增加引物长度和退火温度，重新设计所有引物。

6.由以上方法得出的PCR引物和实验方案，其特征是，每个SNP的每个等位基因对应一个唯一的PCR产物长度，PCR产物长度分配充分利用了检测的空间，引物和实验设计排除了非特异性扩增；利用所设计引物和实验方案进行单个PCR反应，再用实验方案中指明的手段检测产物长度，就可确定所有SNP的基因型。