CN103988079A - 高通量单核苷酸多态性测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，用于向日葵中HaAHASL1-A122(At)T单核苷酸多态性的检测和配型分析。该方法提供了特异性向日葵基因组引物，其可以用于检测HaAHASL1-A122(At)T单核苷酸多态性的存在或不存在。描述了用于端点PCR测定法的引物组合，所述端点PCR测定法能够测定配型并且用于帮助育种渐渗。

Description

高通量单核苷酸多态性测定法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年11月29日提交的美国临时申请61/564,464的权益，其通过提及明确并入本文。
引用电子提交的序列表
序列表的正式拷贝以2012年11月27日创建且具有2kb大小的名称为“69826USNP_SEQ_ID_ST25”的文件以ASCII格式化序列表经由EFS-Web电子提交，并且与说明书同时提交。此ASCII格式化文件中含有的序列表是说明书的一部分，并且通过提及完整并入本文。
发明背景
本公开内容关注由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，用于检测向日葵(Helianthus annuus L)中AHASL1-A122(AT)T单核苷酸多态性。AHASL1-A122(AT)T等位基因赋予对咪唑啉酮除草剂的耐受性。检测方法可以用于AHASL1-A122(AT)T等位基因的育种渐渗，由此将除草剂耐受性赋予向日葵品系。本公开内容可适用于农业生物技术。
作物管理系统内的除草剂耐受性性状使用给种植者提供了更有效且有益的植物管理解决办法。采用除草剂耐受性性状的作物管理系统增加双期作(double-crop)和免耕(no-till)耕作制度的应用，改善杂草管理技术，降低能耗，并且一般而言相比于常规作物管理系统降低成本。一旦鉴定出某种除草剂耐受性性状，开发出能够用来可靠地检测该性状的方法对于该除草剂耐受性性状对作物的育种渐渗而言就是至关重要的。
已经鉴定出一种除草剂耐受性性状，其赋予对包括咪唑啉酮类在内的数类除草剂的耐受性，参见Kolkman等(2004)和WO2007/005581。在向日葵的第9号染色体内HaAHASL1编码序列的一个单核苷酸多态性(SNP)突变被定性为提供对咪唑啉酮除草剂的耐受性。不幸的是，由于与HaAHASL1享有高水平的序列相似性的侧向同源(paralogous)序列的存在，对HaAHASL1-A122(At)T特异性突变的高通量检测而变得困难。现有的用于检测HaAHASL1-A122(At)T突变的测定法，特别是基于凝胶电泳的测定法尤其是基于凝胶电泳的测定法，通量低，不方便，耗时，并且价格昂贵。期望的是通量高、划算、且效率高的基因分型测定法。
本文中描述了用于检测向日葵中的HaAHASL1-A122(At)T等位基因的单核苷酸多态性(SNP)测定法的开发。该测定法提供了用于分子标记辅助选择(MAS)的有效育种渐渗方法，以提供对向日葵品系的咪唑啉酮耐受性性状育种渐渗，由此显著提高育种选择效率。相对于其它定量PCR技术，该测定法可减少合成新测定法的成本和时间。此外，在业已尝试其他定量或检测技术失败的场合，本测定法可取得成功。
发明概述
本公开内容提供了由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，用于检测HaAHASL1基因内的HaAHASL1-A122(At)T SNP的存在或不存在，所述方法包括：
从向日葵分离基因组DNA样品；
向该分离的基因组DNA样本加入一组寡核苷酸引物，其中该组寡核苷酸引物包含(are comprised of)：由SEQ ID NO:3组成的突变型等位基因检测共用引物、由SEQ ID NO:4组成的野生型等位基因检测共用引物、由SEQ ID NO:5组成的下游共用引物，和荧光标记的引物；
对所述分离的基因组DNA样品和该组寡核苷酸引物进行扩增过程；并
检测至少一种扩增产物，其中所述扩增产物指示HaAHASL1-A122(At)TSNP的存在或不存在。
公开内容的一个实施方案涉及一种方法，其中所述扩增产物由84个碱基对组成。
公开内容的另一个实施方案涉及一种方法，其中所述存在或不存在的SNP的位点位于向日葵的第9染色体的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5之间。
公开内容的另一个实施方案涉及一种方法，其中所述存在或不存在的SNP的位点位于向日葵的第9染色体的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5之间。
公开内容的另一个实施方案涉及使用所述由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法鉴定不同植物品系中HaAHASL1-A122(At)TSNP的存在或不存在。因此，本公开内容的另一个实施方案由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，其可以用于鉴定含有HaAHASL1-A122(At)T SNP的植物品系。
公开内容的另一个实施方案涉及使用所述由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法鉴定后代植物中HaAHASL1-A122(At)T SNP的存在或不存在。为了赋予后代一种或多种额外的感兴趣性状，将包含HaAHASL1-A122(At)T SNP的亲本植物与第二个植物品系杂交。可以使用所述由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法在所得的后代植物中筛选HaAHASL1-A122(At)T SNP的存在或不存在。
公开内容的另一个实施方案涉及可用于分子标记辅助育种渐渗的分子标记系统的开发。这样的分子标记系统可以用于加速育种渐渗和建立连锁数据。所述由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法可以用于筛选HaAHASL1-A122(At)T SNP的存在或不存在，作为可用于分子标记辅助育种渐渗的分子标记系统。
公开内容的另一个实施方案涉及由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法用于确定配型(zygosity)的应用，其中HaAHASL1-A122(At)T SNP被确定为作为纯合子存在于向日葵基因组内，或者其中HaAHASL1-A122(At)T SNP被确定作为半合子存在于向日葵基因组内，或者其中HaAHASL1-A122(At)T SNP被确定不存在于(阴性)向日葵的基因组内。
公开内容的另一个实施方案使用所述由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法鉴定不同植物品系中由于HaAHASL1-A122(At)TSNP的存在而导致的咪唑啉酮除草剂耐受性。因此，本公开内容的一个实施方案描述由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，其可以用来鉴定对咪唑啉酮类除草剂有耐受性的植物品系。
公开内容的另一个实施方案涉及由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法用于确认转基因堆(a stack of transgenes)中HaAHASL1-A122(At)T SNP的存在的应用，其中额外的转基因藉由常规植物育种渐渗或通过在植物基因组中转化第二个转基因而被渐渗到含有HaAHASL1-A122(At)T SNP的植物中。
附图简述
图1描绘了由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法用于单核苷酸多态性HaAHASL1-A122(At)T的HaAHASL1基因分型和检测的结果。每种基因型重复六次。对于每份样品，将荧光发射读数作图，X轴表示FAM强度，Y轴表示JOE强度。在图上辨识出4个聚类。左上角＝纯合野生型向日葵植物；右下角＝纯合突变型向日葵植物，其含有HaAHASL1-A122(At)T)等位基因(单核苷酸多态性；右上角＝半合子对照；左下角＝阴性实验对照。
序列简要说明
SEQ ID NO:1是在用于检测HaAHASL1序列的非突变型等位基因的由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法中被扩增的野生型DNA的86个碱基对的片段。
SEQ ID NO:2是在用于检测HaAHASL1-A122(At)T的单核苷酸多态性的由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法中扩增的含有突变型等位基因的DNA的84个碱基对的片段。
SEQ ID NO:3是在5’端含有尾巴的突变型等位基因检测共用引物043-0001.1.A1，含有5’端上的尾巴，该尾巴结合标记有荧光染料5-羧基荧光素(FAM)的KBiosciences反应试剂盒引物。该引物被特别设计用来扩增HaAHASL1-A122(At)T等位基因。
SEQ ID NO:4是野生型等位基因检测共用引物043-0001.2.A2，其在5’端含有尾巴，所述尾巴结合用荧光染料2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)标记的KBiosciences反应试剂盒引物。该引物被特别设计用来扩增野生型HaAHASL1等位基因。
SEQ ID NO:5是下游共用引物043.0001.8.C，其与HaAHASL1-A122(At)T突变位点下游的序列杂交，用于扩增突变型和野生型等位基因两者。
发明详述
本公开内容提供了由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，用于测定植物中性状的配型。更具体地，本公开内容部分地涉及由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，用于检测向日葵中HaAHASL1-A122(At)T单核苷酸多态性的存在。
PCR过程用均相测定法检测系统(homogeneous assay detection system fora PCR process)是一种基因分型系统，其运用荧光共振能量转移(FRET)检测SNP的存在或不存在。此基因分型系统利用共用寡核苷酸引物来引发PCR过程。此共用引物在引物的5’部分带有DNA序列尾巴，并且尾巴不针对感兴趣的扩增子区；因而，此尾巴实质上是惰性的。该引物的3’部分针对感兴趣的扩增子区，因此指导反应的特异性。该反应中包括下游共用引物。所述下游共用引物和共用引物被用来扩增特定的DNA片段。PCR反应中还包含单个荧光标记的寡核苷酸引物，其序列与所述公用引物的尾巴区域相同。最后，反应中包含3’淬灭剂标记的寡核苷酸引物，其设计为与所述荧光标记的寡核苷酸反义。
由于两个标记的寡核苷酸(一个荧光标记的寡核苷酸引物和第二个淬灭剂标记的寡核苷酸引物)的互补性，它们彼此杂交。此杂交使淬灭剂标记物非常接近荧光标记物(其又称为荧光团)，由此使得在该荧光团的最优激发波长激发时来自荧光团分子的所有荧光信号得到淬灭。
使用公用引物引发PCR过程并产生PCR产物。在最先的几轮PCR后，生成所述荧光标记引物的反义序列。这样荧光标记PCR引物就能够在整个PCR过程中引发合成，并且确实如此。由此产生含有荧光团分子的扩增子或PCR产生的DNA片段。随着此DNA片段的合成，淬灭寡核苷酸不再能够与荧光标记的寡核苷酸杂交，这是因为PCR过程产生了双链扩增子DNA。由于淬灭寡核苷酸不再能与荧光标记的寡核苷酸杂交，就会产生与所产生的PCR产物量成正比的荧光信号。
此基因分型系统的变型可以用于终点和实时分析，来检测等位基因特异性SNP。该方法利用与上述相同的荧光团/淬灭物寡核苷酸引物对以及共用下游寡核苷酸引物和共用寡核苷酸引物。反应方案除了少数修改之外是相同的。
等位基因特异性SNP基因分型需要使用两种荧光标记的引物和相应的淬灭剂寡核苷酸来完成。每个引物加有一条独特的序列尾巴，与之相对地，在反应中包含一个独特的5’荧光标记引物。虽然认为许多染料是合适的，但两种合适的染料是FAM和JOE，两者都是荧光素的衍生物，但是彼此在光谱上可分辨。设计两个共用引物(一个设计用于突变型等位基因，另一个设计用于野生型等位基因)来与感兴趣DNA杂交，后者是引物的非加尾部分(non-tailed portion)。共用引物还包含加尾部分序列(tailed portion ofsequence)，其序列与所述两个荧光标记的寡核苷酸之一相同。在引物的非加尾部分中，两个共用引物通常仅有3’端碱基处的单个核苷酸不同。每个引物均针对所述感兴趣的DNA中的单核苷酸多态性碱基。实施PCR，只有当两个引物3’碱基完全配对时才会引发DNA合成。当发生错配时，DNA合成不会进行。
在PCR反应中，对于含有纯合的突变型等位基因的基因型或含有纯合的野生型等位基因的基因型，只有一个特异性共用引物能够引发DNA合成。在野生型与突变型等位基因杂合的基因型的情况下，两个共用引物都能够引发DNA合成。由此，PCR反应将共用引物的加尾部分纳入PCR产物中。在最先几轮PCR后，产生了对荧光标记引物反义的序列。然后，这样荧光标记的PCR引物就能够在整个PCR过程中引发合成，并且的确如此。由此产生含有荧光团分子的扩增子或PCR生成的DNA片段。随着此DNA片段的合成，淬灭寡核苷酸不再能够与荧光标记的寡核苷酸杂交，这是因为PCR方法生成双链扩增子DNA。由于淬灭寡核苷酸不再能与荧光标记的寡核苷酸杂交，就会根据哪个共用寡核苷酸引发了合成而产生荧光信号。然后在荧光酶标仪上针对两种荧光团对反应进行读数。然后，将所得的数据作图，生成一种荧光团(例如FAM)对另一种荧光团(例如JOE)的聚类图(cluster plot)。然后可以基于该聚类图确定所得的基因型。
测定结果基于正/负策略，根据该策略，“正”表示样品就测定的基因而言为阳性，“负”表示样品就测定的基因而言为阴性。这些测定法通常利用两个等位基因特异性共用引物和一个共用引物以便在同一PCR反应中鉴定HaAHASL1-A122(At)T单核苷酸多态性(突变型等位基因)和野生型HaAHASL1(野生型等位基因)。这种终点测定法的应用使得由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法应用于配型确定成为可能。
PCR产物的特异性检测是保证准确地监测感兴趣的DNA区域的存在和检测单核苷酸多态性的最稳健的方法。其它已知的测定法，诸如水解探针法，有广泛的应用。然而，这些类型的方法由于需要双重标记探针，实施起来昂贵。其它的测定法，尤其是基于凝胶电泳的测定法，是本领域中已知的。不幸的是，这些方法通量低、不方便、耗时、并且价格昂贵。期望的是通量高、划算、且效率高的基因分型测定法，例如由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法。另外，此外，这种单核苷酸多态性检测法在高水平的序列相似性的侧向同源序列的存在下应会提供稳健的检测。本公开内容的单核苷酸多态性测定法提供了一种用于准确监测感兴趣DNA区的存在和检测单核苷酸多态性的有效方法。
“寡核苷酸引物”指分离的多核苷酸序列，其通过核酸杂交与互补的靶DNA链退火，以形成引物和靶DNA链之间的杂交体，可以与聚合酶(例如DNA聚合酶)联合使用。寡核苷酸引物可以称为“寡核苷酸”或“引物”。本公开内容的寡核苷酸引物涉及它们用于扩增靶核酸序列(又称为扩增子)、例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规的核酸扩增方法扩增靶核酸序列的用途。在一个优选的实施方案中，使用由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，使用寡核苷酸引物来扩增靶核酸序列(又称“扩增子”)。
寡核苷酸引物的长度一般为12–50个碱基对或更长。此类引物在高严格度杂交条件下与靶序列特异性杂交。优选地，依照本公开内容的引物与靶序列具有完全的序列相似性，尽管通过常规方法可以设计出与靶序列有差异但保留与靶序列杂交的能力的引物。可以引入其它修饰以便在引物的5’或3’端掺入简并序列。可以添加简并序列(称为“尾巴”)以结合单一荧光标记的寡核苷酸引物。
设计特异性寡核苷酸引物使之包含荧光报道分子(荧光团)或淬灭剂。在寡核苷酸引物的合成过程中对寡核苷酸引物添加荧光团分子，由此标记该寡核苷酸引物。同样地，可以在合成过程中对寡核苷酸引物添加其它分子，诸如淬灭剂分子。向寡核苷酸引物添加这些分子不会妨碍该寡核苷酸引物在通过扩增过程与单链DNA杂交并产生新DNA链时发挥功能。
已经开发出许多在特定波长激发的荧光团，它们在本领域中是公知的。荧光团的激发导致荧光团释放荧光信号，该信号可以被紧邻该荧光团处的淬灭剂淬灭。当淬灭剂从荧光团解离时，荧光信号不再被淬灭，从而荧光信号的积累(其与靶DNA的量正相关)可以用自动化荧光计实时检测或作为终点反应检测。荧光团可以组合使用，其中激发和发射光谱显著不同，从而容许两个或更多个荧光团的多重检测。可用于本方法的一些荧光团包括：HEX荧光染料、TET荧光染料、Cy3荧光染料、Cy3.5荧光染料、Cy5荧光染料、Cy5.5荧光染料、Cy7荧光染料、或ROX荧光染料。供用于本公开的由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法的荧光团包括FAM荧光染料或JOE荧光染料。
淬灭剂被开发用来淬灭特定波长的荧光团，并且是本领域已知的。当淬灭剂位于与荧光团极其接近时，荧光团将能量转移至淬灭剂。淬灭剂通过非放射性衰变消耗此能量并且返回到天然基态。在非放射性或称黑衰变中，从荧光团转移过来的能量作为分子振动被发散。淬灭剂的选择考虑低背景荧光、高灵敏度、和最大光谱重叠等性质，以提供能够使荧光团的用途更广泛的淬灭剂。一些可用于本方法的淬灭剂包括：Dabcyl淬灭剂、Tamra淬灭剂、Qxl淬灭剂、Iowa black FQ淬灭剂、Iowa black RQ淬灭剂、或IR Dye QC-1淬灭剂。淬灭物的一个例子包括Blackhole淬灭物，其标记在设计为对FAM或JOE标记的寡核苷酸反义的寡核苷酸引物上。
编码AHAS酶的基因内的单核苷酸多态性已经得到鉴定和表征，并且已知该单核苷酸多态性提供对除草剂的耐受性。向日葵中赋予咪唑啉酮除草剂耐受性的HaAHASL1编码序列突变已经被鉴定。参见Kolkman等(2004)和WO2007/005581。HaAHASL1编码序列的单核苷酸多态性(SNP)突变(其中第122位的天然丙氨酸通过一个单核苷酸多态性(表征为鸟嘌呤至腺嘌呤的转变)突变为苏氨酸，在向日葵L中提供对咪唑啉酮除草剂的耐受性。
人们已经鉴定了向日葵中编码对AHAS抑制性除草剂抗性的单核苷酸多态性，并将其渐渗到优良近交系中以供开发和部署除草剂抗性栽培种和杂交种。提供对AHAS抑制性除草剂(诸如咪唑啉酮)的耐受性的向日葵系的鉴定，为向日葵生产者提供了用于控制阔叶杂草的新耕作系统。以CLHA-Plus为名市售的向日葵品系是咪唑啉酮耐受性的，并且已知携带HaAHASL1-A122(At)T突变型等位基因。本公开内容的一个优选的实施方案是一种由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，其可以用来检测向日葵植物中HaAHASLl-A122(At)T的存在或不存在。
HaAHASL1野生型等位基因的基因组序列作为SEQ ID NO:1给出。含有HaAHASL1-A122(At)T突变型单核苷酸多态性等位基因的基因组序列作为SEQ ID NO:2给出。导致咪唑啉酮耐受性的单核苷酸多态性位置位于SEQ IDNO:1的碱基对65和SEQ ID NO:2的碱基对65。
基于这些基因组序列，制作了特异性共用引物。本公开的由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法展示，使用这些特异性共用引物组，可以在不同的向日葵品系中鉴定出HaAHASL1-A122(At)T突变型单核苷酸多态性等位基因。由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法可以用来唯一地确定向日葵系中HaAHASL1-A122(At)T单核苷酸多态性的存在或不存在。
在一个实施方案中，由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的HaAHASL1-A122(At)T方法扩增一个84bp片段。HaAHASL1-A122(At)T特异性共用引物结合单核苷酸多态性突变型等位基因。HaAHASL1特异性共用引物结合野生型等位基因。下游共用引物结合HaAHASL1A122(At)T突变位点下游的序列，用于扩增突变型和野生型等位基因两者。对用于扩增HaAHASL1-A122(At)T单核苷酸多态性的引物测试了PCR效率。以复用能力为目的开发了引物组合和PCR扩增条件，建立了终点配型测定法(endpointzygosity assay)。
本公开内容的检测技术可以与植物育种渐渗结合使用，用来在将含有单核苷酸多态性的亲本植物与另一植物品系杂交以图赋予后代一种或多种感兴趣的额外性状之后，确定哪些后代植物含有单核苷酸多态性。
本主题的由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法可用于例如向日葵育种渐渗项目及质量控制，尤其是用于向日葵籽的商业生产。此方法还可以有益于产品注册和产品监管。此方法可以用于加速的育种渐渗策略。本公开的检测技术特别有用于与植物育种渐渗结合，，用来在将含有单核苷酸多态性的亲本植物与另一植物品系杂交以图赋予后代该单核苷酸多态性之后，确定哪些后代植物含有该单核苷酸多态性。本文公开的由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法有益于向日葵育种渐渗项目及质量控制，尤其是向日葵籽的商业生产。
本公开内容进一步包括进行向日葵植物杂交和使用本公开内容方法的方法。例如，本公开内容包括生成后代种子的方法，其通过将含有单核苷酸多态性的植物与第二种遗传上不同的植物(例如不含该SNP的近交亲本)杂交，收获所得的后代种子，并且使用所述利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法检测单核苷酸多态性。
除草剂耐受性向日葵植物可以通过如下育种：首先有性杂交第一亲本向日葵植物和第二亲本向日葵植物，由此生成多个第一后代植物，所述第一亲本向日葵植物由自含有单核苷酸多态性的品系的种子长成的向日葵植物组成；然后选择含有所述单核苷酸多态性、由此对除草剂有抗性的第一后代植物；使该第一后代植物自交，从而产生多个第二后代植物；然后从这些第二后代植物中选择含有所述单核苷酸多态性、由此对除草剂有抗性的植物。
这些步骤可以进一步包括将第一后代植物或第二后代植物与第二亲本向日葵植物或第三亲本向日葵植物回交。可以利用所述由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法迅速检测具有包含所述单核苷酸多态性的向日葵种子的向日葵作物或其后代，然后将其种植。所述由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法能够提高该过程的效率。
本公开内容可以用于分子标记辅助育种(MAB)方法。本公开可以与其他鉴定与该单核苷酸多态性邻近的基因连锁标记的方法(例如AFLP标记、RFLP标记、RAPD标记、SNP和SSR)结合使用。该由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法容许在植物育种杂交后代中追踪单核苷酸多态性编码的除草剂抗性性状。本公开的由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法可以用于鉴定含有单核苷酸多态性的任何向日葵品种。
公开的方法还包括通过分析植物育种杂交的后代的能够根据本公开检测的单核苷酸多态性，来对所述植物育种杂交的后代进行选择。例如，由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法可以用于经由与包含其它期望性状(包括转基因性状和非转基因性状两者)的植物的育种循环追踪单核苷酸多态性。通过使用本公开的方法，可以检测、鉴定、选择包含单核苷酸多态性和第二种期望性状的植物，并快速用于更多轮的育种渐渗中。单核苷酸多态性还可以通过育种渐渗与改变的油性状、抗虫性状、农艺性状、和/或其他除草剂耐受性性状组合，并且依照本公开内容加以追踪或鉴定。后者的一个优选的实施方案是包含单核苷酸多态性与编码改变的油性状的基因组合的植物。
本公开内容可以用于确定一个或多个基因座处的配型。为了评估近交水平(即基因固定(gene fixation)的程度)、偏分离(即，在转基因种质中、母本遗传测试或者对于影响配子适合度的基因座)、和远交水平(即纯合性和杂合性的相对比例)，此类配型测定可用于植物育种渐渗。在配型确定中，鉴定在一个或多个基因座上纯合或杂合的(又称为“半合”)的植物。对于任何给定的植物，其对于某种单核苷酸多态性而言可以是纯合的或杂合的，或者对于野生型等位基因而言可以是纯合的或杂合的。一个或多个基因座处的配型的测定可以用于评估杂种性，以及评估某一特定种子批次是否满足作为核准杂交种子(certified hybrid seed)的产业或监管方标准。另外，在转基因种质中，知晓倍数性，或称拷贝数是有用的，可有助于性状整合(trait integration)策略。在一个优选的实施方案中，本公开的由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法用于测定向日葵植物内HaAHASL1等位基因的配型。
在此提供定义和实施例来帮助描述本公开和指导本领域普通技术人员实施本公开。除非另有说明，术语应按照相关技术领域普通技术人员的常规用法来理解。使用37CFR§1.822中所述的DNA碱基的命名法。
此外，某个元件或组分前的不定冠词“a”和“an”意图对实例数，即该元件或组分出现的次数而言是非限制性的。因此“a”或“an”应该理解为包括一个或至少一个，且元件或组分的单数词形也包括复数，除非数目明显应该是单数。
术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、和“核苷酸序列”用于指代核苷酸(A、C、T、U、G等等，或天然存在的或人工的核苷酸类似物)的聚合物，例如DNA或RNA，或它们的表现形式，例如字符串等，取决于相关的语境。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用；这些术语用来指DNA、RNA、或本公开的其他新颖的核酸分子，除非另有说明或者与上下文明显矛盾。给定的多核苷酸或互补多核苷酸可以从任何明确的核苷酸序列确定。核酸可以是单链或者双链形式。
术语“分离的”或“分离”是指这样的材料，例如核酸或蛋白质：(1)该材料基本上游离于当该材料在其天然存在的环境中被发现时通常与其相伴随或者相互作用的组分；或者(2)如果该材料处于其天然环境中，该材料已经通过有意的人工干预变成了组合物，和/或已经被置于细胞中与该材料的天然位置不同的位置。
术语“植物”包括植物和植物部分，包括但不限于植物细胞和植物组织，诸如叶、茎、根、花、花粉和种子。能够用于本公开的植物的类别通常与适合于诱变的高等或低等植物的类别一样宽，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。如本文中使用的，“品系”是对于至少一种性状而言，个体之间显示极少或没有遗传差异的植物的群体。这样的品系可以通过数代自花授粉和选择，或者利用组织或细胞培养技术从单个亲本无性繁殖来产生。
术语“栽培种”和“品种”是同义的，指用于商业生产的品系。
术语“扩增过程”指任何用于扩增多核苷酸片段的基于聚合酶链式反应的方法。这样的方法利用寡核苷酸引物序列和DNA聚合酶来通过一系列热循环合成互补寡核苷酸片段拷贝，所得的扩增子称为“扩增产物”。
术语“单核苷酸多态性”或“SNP”是指在生物体的基因组内发生的DNA序列变化，其中单个核苷酸碱基在某个物种的成员之间不同。DNA序列变化通常造成该位置上的单个核苷酸碱基与预期的核苷酸碱基不同。术语“突变型等位基因”用来指单个核苷酸碱基从物种的大多数成员中发现的序列变化为不常见于该物种的、预料之外的不同单个核苷酸碱基的改变。术语“野生型等位基因”用来指在物种的大多数成员中发现的、预料之中的单个核苷酸碱基。
术语“配型”(zygosity)是指生物体中某种性状(遗传的特性)的等位基因之间的相似情况。如果两个等位基因是相同的，则该生物体就该性状而言是纯合的。如果两个等位基因不同，则该生物体就该性状而言是杂合的或者说是半合的。
在下面的实施例中对本公开的实施方案进行进一步定义。应该理解，这些实施例仅以示例方式给出。从上面的讨论和下面的实施例，本领域技术人员能够确定本公开的关键特征，而且在不偏离本公开的精神和范围的同时，可以对本公开的实施方案进行不同的改变的修改来使之适用于各种用途和条件。因此，除了本文显示和描述的那些之外，本领域技术人员从前面的描述容易想到本公开的实施方案的各种修改形式。随附的权利要求的范围意图涵盖这样的修改形式。
实施例
实施例1：DNA提取和定量
使用来自一种既往被定性为对HaAHASL1-A122(At)T突变型等位基因纯合的向日葵品系的植物来开发检测HaAHASL1-A122(At)T突变型等位基因的方法。此外，使用另一种先前被定性为对HaAHASL1-A122(At)T野生型等位基因纯合的向日葵品系开发检测HaAHASL1-A122(At)T野生型等位基因的方法。结果，开发了一种由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的HaAHASL1方法。开发了由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的HaAHASL1方法之后，使用既往已基因分型的向日葵品系对其进行验证。
使用QiaGene DNeasy96植物试剂盒从HaAHASL1-A122(At)T突变型等位基因纯合的向日葵系和HaAHASL1野生型等位基因纯合的向日葵品系的叶组织提取基因组DNA，并且用dsDNA定量试剂盒(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)进行定量。
实施例2：引物设计
基于HaAHASL1(SEQ ID NO:1)和HaAHASL1-A122(At)T突变型等位基因(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列信息手工设计三种引物(表1)。
合成在5’端含有尾巴的突变型等位基因检测共用引物043-0001.1.A1(SEQ ID NO:3)，所述尾巴的序列与KBiosciences反应试剂盒荧光标记的引物相同。KBiosciences反应试剂盒荧光标记的引物标记有荧光染料5-羧基荧光素(FAM)。此引物专门设计为扩增HaAHASL1-A122(At)T突变型等位基因。
合成在5’端含有尾巴的野生型等位基因检测共用引物043-0001.2.A2(SEQ ID NO:4)，所述尾巴与KBiosciences反应试剂盒荧光标记的引物是相同的。KBiosciences反应试剂盒荧光标记的引物标记有荧光染料2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)。此引物设计为特异性扩增HaAHASL1野生型等位基因。
最后，使用与HaAHASL1A122(At)T突变位点下游的序列杂交的下游共用引物043.0001.8.C(SEQ ID NO:5)扩增突变型和野生型等位基因两者。
将所有引物混合至Tris-HCl(pH8.3)中的浓度，如表2中所列的。
实施例3：HaAHASL1单核苷酸多态性测定法
将三种HaAHASL1共用引物混合以达到表2中描述的浓度。在表3和4中分别描述了HaAHASL1反应鸡尾酒和热循环程序。在PCR系统9700(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)上以96孔板形式进行HaAHASL1PCR反应。使用以下参数在荧光酶标仪上读出HaAHASL1PCR反应产物结果：(1)FAM：约485nm激发；约535nm发射；和(2)JOE：约525nm激发，约560nm发射。荧光读出数据以Microsoft Excel格式保存，并且在x-y轴上将数据绘图。将FAM值在X轴上作图，并将JOE值在Y轴上作图。
图1中呈现了测定法的结果。已知HaAHASL1野生型等位基因纯合的样品聚集于图的左上。已知HaAHASL1-A122(At)T突变型等位基因纯合的向日葵样品聚集于图的右下。等位基因半合的植物样品聚集于两组之间，位于图的右上。半合样品是通过以等摩尔比混合来自纯合野生型等位基因样品和纯合突变型等位基因样品而制备的。最后，阴性实验对照聚集在图左下，这是背景荧光读出的结果。阴性实验对照是通过在HaAHASL1反应中不纳入模板DNA而创建的。对于每种基因型和实验对照样品，将每个HaAHASL1反应重复六次。
结果证明了HaAHASL1法可以用于鉴定含有HaAHASL1-A122(At)T突变型等位基因或HaAHASL1野生型等位基因的纯合品系。另外，可以使用HaAHASL1法鉴定半合子和阴性对照样品。
表1：HaAHASL1引物序列。
表2：100μl引物混合物的混合物。
表3：HaAHASL1反应的鸡尾酒。
组分 体积
DNA(5ng/μl) 4μl
2倍反应混合物(KBiosciences Ltd.) 4μl
引物混合物(表3) 0.11μl
总计 8.11μl
表4：HaAHASL1反应的热循环程序。
实施例4：由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的HaAHASL1方法的确认
为了验证由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的HaAHASL1方法，使用上文描述的测定法对从育种杂交生成的向日葵植物进行基因分型。测定中包括纯合野生型向日葵品系、纯合HaAHASL1-A122(At)T突变型等位基因向日葵品系、和半合及阴性实验对照。将由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的HaAHASL1方法的结果与从对相同样品组实施的基于凝胶的测定法产生的结果比较。将基于凝胶的测定PCR产物在2％琼脂糖TAE凝胶上解析，使用UV透照捕捉凝胶图像，手工收集并核对基因型数据。由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的HaAHASL1方法与基于凝胶的标准测定法观察到的结果是一致的。在一些情况中，由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的HaAHASL1方法产生的分辨率比基于凝胶的测定法更好，由此可消除模棱两可的基因分型样式。例如，基于凝胶的测定法在一个杂种中检出了可疑的配型样式，而由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的HaAHASL1方法清楚地确认了该杂种是杂合的。
开发并验证了一种由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的HaAHASL1方法，用于检测向日葵中的HaAHASL1-A122(At)T突变型等位基因。此测定法通量大、划算、效率高。此新测定法将会显著改善对含有咪唑啉酮耐受性HaAHASL1-A122(At)T突变型等位基因的向日葵植物的检测能力和精确度，并且提高经由分子标记辅助选择的育种选择效率。
先前的实施例描述了由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，开发该方法是为了分离并鉴定含有HaAHASL1-A122(At)T单核苷酸多态性突变型等位基因的向日葵植物。另外，此方法可以用于测定含有HaAHASL1-A122(At)T的向日葵植物的配型并且用于分子标记辅助选择或HaAHASL1-A122(At)T单核苷酸多态性突变型等位基因对后代植物的整合。

Claims (15)

1.一种由利用FRET的PCR过程用均相测定法检测系统构成的方法，用于检测HaAHASL1基因内HaAHASL1-A122(At)T SNP的存在或不存在，所述方法包括：
a.从向日葵(Helianthus annuus)分离基因组DNA样品；
b.向该分离的基因组DNA样本加入一组寡核苷酸引物，其中该组寡核苷酸引物包括：由SEQ ID NO:3组成的突变型等位基因检测共用引物、由SEQ ID NO:4组成的野生型等位基因检测共用引物、由SEQ ID NO:5组成的下游共用引物，和荧光标记的引物；
c.对该分离的基因组DNA样品和该组寡核苷酸引物进行扩增过程；和
d.检测至少一种扩增产物，其中所述扩增产物指示HaAHASL1-A122(At)T SNP的存在或不存在。
2.权利要求1的方法，其中所述扩增产物由84个碱基对组成。
3.权利要求1的突变型等位基因检测共用引物，其中所述突变型等位基因检测共用引物含有与第一荧光标记引物序列相同的尾巴序列。
4.权利要求3的第一荧光标记引物，其包含荧光染料。
5.权利要求4的荧光染料，其包括HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy3荧光染料、Cy3.5荧光染料、Cy5荧光染料、Cy5.5荧光染料、Cy7荧光染料、或ROX荧光染料。
6.权利要求1的野生型等位基因检测共用引物，其中所述野生型等位基因检测共用引物含有与第二荧光标记引物序列相同的尾巴序列。
7.权利要求6的第二荧光标记引物，其包含荧光染料。
8.权利要求7的荧光染料，其包括HEX荧光染料、FAM荧光染料、JOE荧光染料、TET荧光染料、Cy3荧光染料、Cy3.5荧光染料、Cy5荧光染料、Cy5.5荧光染料、Cy7荧光染料、或ROX荧光染料。
9.权利要求1的方法，其中所述方法用于确定配型，其包括：
a)定量与所述突变型等位基因检测共用引物的尾巴的序列相同的所述荧光标记引物的第一荧光染料；
b)定量与所述突变型等位基因检测共用引物的尾巴的序列相同的所述荧光标记引物的第二荧光染料；
c)将第一荧光染料的量与第二荧光染料的量比较；和
d)通过比较第一荧光染料对第二荧光染料的荧光比率确定配型。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述存在或不存在的SNP的位点位于向日葵第9染色体的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5之间。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述存在或不存在的SNP的位点位于向日葵第9染色体的SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5之间。
12.权利要求1的方法，其中所述方法用于向第二向日葵品系中的育种渐渗。
13.权利要求12的育种渐渗方法，其中所述第二向日葵品系不含HaAHASL1-A122(At)T等位基因。
14.权利要求12的育种渐渗方法，其中所述方法用于检测后代植物中HaAHASL1基因内HaAHASL1-A122(At)T SNP的存在或不存在。
15.权利要求1的方法，其中所述方法用于鉴定具备咪唑啉酮除草剂耐受性的向日葵品系。
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