KR20150083992A

KR20150083992A - 디지털 pcr 실험 디자이너를 위한 방법 및 시스템

Info

Publication number: KR20150083992A
Application number: KR1020157009139A
Authority: KR
Inventors: 니베디타 수미 마줌다르; 토마스 베셀; 데이비드 씨. 우; 마르신 시코라; 고든 자나웨이; 쉬웨타 라이자다; 조안나 란케스터; 제프리 마크스; 다니엘 베셀
Original assignee: 라이프 테크놀로지스 코포레이션
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2013-09-13
Publication date: 2015-07-21
Also published as: AU2013315167A1; CN104937600B; US10984888B2; JP2016500856A; IN2015DN02987A; US20150278437A1; CN104937600A; SG11201502797PA; EP2895978A1; EP4044188A1; CN108229104B; RU2015113523A; BR112015005702A2; WO2014043581A1; CN108229104A; US20210313010A1

Abstract

디지털 PCR(dPCR) 실험을 설계하기 위한 컴퓨터-구현 방법이 제공된다. 그 방법은 최적화 유형의 선택을, 사용자로부터, 수신하는 단계를 포함한다. 최적화 유형은, 예를 들어, 동적 범위를 최대화하거나, 실험을 위해 필요로 되는 반응 부위를 포함하는 기질의 수를 최소화하거나, 희석 인자를 결정하거나, 또는 검출 하한을 결정하는 것일 수 있다. 그 방법은 실험을 위한 정밀도 척도, 및 실험을 위한 반응 부위 내 표적의 최소 농도를, 사용자로부터, 수신하는 단계를 더 포함한다. 그 방법은 또한 최적화 유형에 기반하여 실험을 위한 일 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 단계를 포함한다. 그 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 그 후 사용자에게 디스플레이된다.

Description

디지털 PCR 실험 디자이너를 위한 방법 및 시스템{METHODS AND SYSTEMS FOR A DIGITAL PCR EXPERIMENT DESIGNER}

디지털 PCR(dPCR)은 핵산 시료의 절대 정량을 제공하고, 희귀 표적의 농도를 검출 및 정량하고, 핵산 농도에서의 낮은 폴드-변화를 측정하는데 사용되는 분석 기술이다.

dPCR에 있어서, 비교적 적은 수의 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 있는 용액은, 각각의 시료가 일반적으로 표적 뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 분자를 포함하고 있거나 표적 뉴클레오타이드 서열의 아무것도 포함하고 있지 않게 되도록, 더 많은 수의 작은 시험 시료로 세분될 수 있다. 시료가 PCR 프로토콜, 절차 또는 실험에서 후속 열 순환될 때, 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 있는 시료는 증폭되어 양성의 검출 신호를 산출하는 한편, 표적 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 있지 않은 시료는 증폭되지 않고 검출 신호를 산출하지 않는다.

잠재적으로, dPCR 시스템은 유전자 정량의 정확한 측정을 가능하게 하는 초고정밀도를 갖고 있을 수 있다. 미지의 시료와의 도전과제는 시스템에 의해 지원되는 동적 범위 내에 드는 희석으로 실험을 수행하는 것이다.

일반적으로, 복제 수를 증가시키는 것은 dPCR 결과의 정확도 및 재현성을 증가시킨다. 동적 범위는 가용 반응 용기의 총 수에 그리고 당신의 애플리케이션을 위해 필요한 측정 정밀도에 의존한다.

대표적 일 실시예에서는, 디지털 PCR(dPCR) 실험을 설계하기 위한 컴퓨터-구현 방법이 제공된다. 그 방법은 최적화 유형의 선택을, 사용자로부터, 수신하는 단계를 포함한다. 최적화 유형은, 예를 들어, 동적 범위를 최대화하거나, 실험을 위해 필요로 되는 반응 부위를 포함하는 기질의 수를 최소화하거나, 희석 인자를 결정하거나, 또는 검출 하한을 결정하는 것일 수 있다. 그 방법은 실험을 위한 정밀도 척도, 및 실험을 위한 반응 부위 내 표적의 최소 농도를, 사용자로부터, 수신하는 단계를 더 포함한다. 그 방법은 또한 최적화 유형에 기반하여 실험을 위한 일 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 단계를 포함한다. 그 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 그 후 사용자에게 디스플레이된다.

도 1a 및 도 1b는 본 교시의 다양한 실시예에 따라 동적 범위, 측정 정밀도, 및 검출 하한 및 상한의 관계를 도시하는 그래프 예시도;
도 2는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 검출 하한(LLOD) 및 검출 상한(ULOD) 대 반응 부위를 포함하는 기질 수의 관계를 도시하는 플롯 예시도;
도 3은 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 dPCR 실험을 위한 최적 농도 범위를 도시하는 플롯 예시도;
도 4는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 더 많은 수의 반응으로 정밀도가 얼마나 개선되는지 도시하는 플롯 예시도;
도 5는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 검출 최하한 상에서 총 질의된 부피의 효과 예시도;
도 6은 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 거짓 콜과 정밀도의 관계 예시도;
도 7은 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 영이 아닌 거짓 양성 및 거짓 음성의 영향 하에 최적 정밀도에 대한 소망 로드를 도시하는 등고선 예시도,
도 8은 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 거짓 양성 및 거짓 음성 콜의 영향 하에 검출 하한을 도시하는 등고선 예시도,
도 9는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 양성/음성 반응 손실을 보상하기 위한 소망 로드 농도를 도시하는 등고선 예시도,
도 10은 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 반응 드롭아웃(reaction dropout)의 효과 하에 검출 하한을 도시하는 등고선 예시도;
도 11은 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 파티션 사이즈에서의 부피 측정 변량이 더 높은 농도에서의 측정 능력을 얼마나 저하시키는지 도시하는 그래프 예시도;
도 12는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 파티션 사이즈 변량을 보상하기 위한 최상 정밀도에 대한 백분율 음성에서의 표적 로드를 도시하는 그래프 예시도;
도 13은 여기에서 설명되는 실시예에 따라 파티션을 갖는 일례의 다수의 희석 예시도;
도 14는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 dPCR 시스템에서 표적의 검출시 희석의 효과 예시도;
도 15는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 단일 기질로부터 동적 범위 및 검출 하한 상에서 희석의 효과를 도시하는 플롯 예시도;
도 16a 및 도 16b는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 다수 희석의 조합을 사용할 때 계속적 검출을 대한 희석 인자에 대한 제약 예시도;
도 17은 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따른 희석으로 동적 범위에서의 증가 예시도;
도 18a, 도 18b 및 도 18c는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 희석 포인트 수와 동적 범위에서의 증가 간 절충점의 예시도;
도 19는 여기에서 설명되는 다양한 실시예가 구현될 수 있는 대표적 컴퓨팅 시스템의 예시도;
도 20a 및 도 20b는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 dPCR 실험 디자이너에 의해 구현된 다양한 디지털 PCR 방법을 갖는 순서도;
도 21a, 도 21b, 도 21c 및 도 21d는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 dPCR 실험 디자이너를 사용하는 유전자 발현 작업 흐름을 위한 방법의 예시도;
도 22a, 도 22b, 도 22c 및 도 22d는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 dPCR 실험 디자이너를 사용하는 희귀 돌연변이 검출 작업 흐름 내 방법의 예시도;
도 23a 및 도 23b는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 dPCR 실험 디자이너의 정량 결과의 예시도; 및
도 24는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 배경 신호 대비 희귀 표적 검출의 예시도.

최대 감도, 동적 범위 및 측정 정밀도를 위한 디지털 PCR 모델링

디지털 PCR의 큰 장래성은 유전자 정량에 대한 정확한 측정을 가능하게 하는 독보적 정밀도에 대한 잠재력이다. 최대 정밀도가 소망될 때, 미지의 시료와의 도전과제는 요구되는 측정 정밀도로 하나 또는 다수의 관심 표적의 검출을 지원하는 희석에서 실험을 수행하는 것이다. 가용 반응 부위, 시료 부피 감축(각종 원인에 기인함), 및 거짓 음성/거짓 양성 레이트와 같이 정밀도에 충격을 주는 인자로 디지털 PCR 시스템을 모델링하도록 수학적 프레임워크가 사용될 수 있다. 이러한 프레임워크는 정밀도와 지원되는 동적 범위 간 관계를 도시하는 그래픽을 개발하도록 사용된다. 감도 또는 검출 최하한에 대한 총 입력 시료 부피의 충격이 또한 예시된다. 다양한 실시예에 따라, 이러한 프레임워크는 디지털 PCR 실험 디자이너로서 컴퓨팅 시스템의 프로세서 상에서 구현가능한 컴퓨터-판독가능한 매체 상에 인코딩되는 방법으로 사용될 수 있다.

다양한 실시예에 의하면, 다양한 시스템 파라미터의 효과를 모델링하는 그래픽 세트는 소망 정밀도를 갖는 디지털 답에 도달하는데 필요한 반응 부위 수 및 희석 인자를 추정하도록 사용자에게 강력한 툴로서 역할할 수 있다. 그 모델은 2개의 희석 포인트의 사용(각각의 희석에 대해 반응 부위 수의 반을 사용함)으로 동일한 수의 반응 부위에 대해, 소정 정밀도에서, 지원되는 동적 범위에서의 증가를 예측한다. 동적 범위에서의 이러한 증가는 동적 범위 전체에 걸친 계속적 검출이 바람직한 경우(예를 들어, 유전자 정량) 유익함이 자명하다. 제2 희석 포인트로 반응 부위 수의 반의 손실은 소정 정밀도에서 검출가능한 농도 범위에서의 사소한 손실을 유발한다. 그렇지만, 이러한 손실은 제2 희석 포인트의 중첩 효과 때문에 검출가능한 농도 세트에서의 이득에 의한 오프셋보다 더 많다. 결과는 또한 희석 인자의 신중한 선택에 의해 소정 시료 내 대체로 다른 비율로 존재하는 2개의 표적의 정밀한 검출을 가능하게 하도록 반응 부위의 가용 수를 레버리징할 가능성을 예측할 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 대다수의 가용 반응 부위는 희귀 유형을 검출하는데 전용일 수 있고 나머지 부위는 매우 다른 희석에서 야생 유형을 검출하는데 전용일 수 있다.

디지털 PCR 모델

디지털 PCR 실험에서, 시료 DNA는 각각이 복제를 하나도 얻지 않거나 하나 이상을 얻도록 많은 수의 반응 부위로 파티셔닝된다. PCR을 수행한 후에, DNA 템플릿을 포함한 반응 부위에서는 증폭이 검출될 수 있는 반면 DNA 템플릿이 결핍된 반응 부위에서는 증폭이 검출되지 않을 수 있다.

증폭된 시료를 나타내지 않는 반응 부위는 음성이라고 지칭되고 증폭을 나타내는 반응 부위는 양성이라고 지칭된다. λ가 반응 챔버당 평균 분자 수를 표시하고 p가 디지털 PCR 실험에서 n개의 반응 부위에 걸친 음성의 비율을 표시한다고 하자. 그리하여, 음성의 비율 'p'은 다음 식에 의해 λ와 관련된다:

여기서 r = 음성 반응 부위 수; n = 반응 부위의 총 수이다. 시스템에서 반응 부위를 포함하는 기질의 수는 N이다. 그리하여, 예를 들어, 기질이 20000 반응 부위를 포함하면, 그때 n = 20000*N이다.

복제의 푸와송 분포의 가정으로 많은 수의 반응 부위를 사용하면, 반응 부위당 평균 복제 수는 λ = -ln(r/n)으로 계산될 수 있고, 여기서 r은 음성 결과의 수이고 n은 반응 부위의 총 수이다. 그리하여, 입력 부피 내 표적의 농도가 추정될 수 있다.

λ의 추정치 주위의 신뢰 한계는 식(3)에 의해 주어진다.

정밀도는 λ의 참값에 비한 λ 주위 신뢰 구간의 스프레드로서 정의된다. 이 스프레드가 작을수록, 추정치는 더 정밀하다. 정밀도는 2개의 값이 얼마나 가깝고 또 시스템에 의해 검출가능할 수 있는지의 상한을 통제한다. 정밀도 측정은 모든 농도에서 균일하지는 않다. 도 3은 10K, 20K, 40K 및 1M 반응 부위에 대해 소정 범위의 농도(반응당 분자로 표현됨)에 대한 측정 주위 신뢰 구간을 나타내는 플롯(300)을 도시하고 있다. 이 예에 있어서, 최상 정밀도는, 마커(310)로 나타낸, (반응 수에 무관하게) 음성 반응의 20.32% 비율을 나타내는 농도에서 달성된다. 도 3은 또한 정밀도가 더 높은 농도로 향하여 더 급속히 저하함을 보여준다. 플롯(302)은 10k 반응에 대하여 백분율 편차 대 각각의 반응 부위에서의 농도 및 음성의 백분율을 도시하고 있다. 플롯(304)은 20k 반응에 대하여 백분율 편차 대 각각의 반응 부위에서의 농도 및 음성의 백분율을 도시하고 있다. 플롯(306)은 1M 반응에 대하여 백분율 편차 대 각각의 반응 부위에서의 농도 및 음성의 백분율을 도시하고 있다. 이 예에 있어서, 정밀도에서의 하락은 로드 농도가 (x축 상에서 좌에서 우로) 감소함에 따라서보다는 로드 농도가 (x축 상에서 우에서 좌로) 증가함에 따라 더 첨예하다. 이러한 관점으로부터, 실험에 대해 더 희석한 시료를 사용하는 측에서 실수를 범하는 것이 나을 수 있다. λ에 대한 측정 정밀도는 다음에 의해 주어진다:

logλ 공간에서 σ에 의해 표현되는 변량은 식(5)에 나타난 바와 같은 푸아송 또는 샘플링 관련 성분을 이룬다:

디지털 PCR 결과는 적어도 하나의 음성 또는 하나의 양성 결과를 갖는 것에 기반한다. 그렇지 않고 전부 음성 또는 전부 양성이면, dPCR 이론에 기반하여 반응 부위 내 반응 부피 내 시료의 농도를 추론하는 것이 가능하지 않다. 단 하나의 음성 또는 단 하나의 양성 결과를 갖는 실험 시나리오는 dPCR 실험에 대한 검출 한계를 준다.

검출 하한(LLOD)은 양성이 단 하나만 있는 경우 일어난다. 어떠한 시료라도 존재한다고 할 때, 전부 음성을 얻을 확률은 (1 - 신뢰도)로 설정될 수 있거나; 또는 등가적으로, 적어도 하나의 양성을 얻을 확률은 신뢰도 레벨로 설정될 수 있다. 예를 들어, 하한에서 95% 신뢰도 레벨에 대해, 시료의 존재는 실험 중 95%에서 검출되어야 하는 한편, 실험 중 다른 5%는 양성을 나타내지 않을 것이다. 그 포인트에서 λ에 대해 푸는 것은 검출 하한에서의 λ 또는 λ_LLOD를 다음과 같이 준다:

여기서 C는 신뢰도 레벨이다.

검출 상한(ULOD)은 음성이 단 하나만 있는 경우 일어난다. 전부 양성을 얻을 확률은 (1 - 신뢰도)로 설정될 수 있거나; 또는 등가적으로, 적어도 하나의 음성을 얻을 확률은 신뢰도 레벨로 설정될 수 있다. 그 포인트에서 λ에 대해 푸는 것은 검출 상한에서의 λ 또는 λ_ULOD를 다음과 같이 준다:

여기서 C는 신뢰도 레벨이다.

정의된 바와 같은 ULOD 및 LLOD는 이론적 검출 한계를 설명하였다. 그렇지만, ULOD 및 LLOD에서의 측정 정밀도가 매우 불량하기 때문에, 최소 요구 정밀도의 관점에서 검출 한계를 정의하는 것에 대해 착안할 수 있다. 대안으로, 시스템의 잡음 특성에 기반하여 실험에서 실제 양성 또는 음성을 얼마나 많이 보고 싶은지에 의존하여 자의적 검출 한계를 정의하도록 선택할 수 있다. 검출 한계는 또한 반응 부위의 수에 의존할 수 있다. 도 2에서의 그래프(200)의 플롯(202)은 반응 부위의 수를 증가시킴으로써 검출 하한이 어떻게 낮춰지는지 보여주고 있다. 도 2에서의 그래프(200)의 플롯(204)은 반응 부위의 수를 증가시킴으로써 검출 상한이 어떻게 올려지는지 보여주고 있다.

이 맥락 내에서, 동적 범위는 log10 단위로 검출가능한 농도의 너비를 정의한다. 동적 범위는 통상 2가지의 다른 정보: 검출 정밀도 및 최저 검출가능한 농도에 의해 자격이 주어진다. 도 1a에서의 플롯(100)은 20000 반응 부위에 대해 10% 정밀도에서의 동적 범위를 보여주고 있다. 도 1a에서의 플롯(150)은 또한 시스템으로부터의 더 낮은 정밀도 요구에 따라 동적 범위가 어떻게 증가하는지 보여주고 있다. 동적 범위(DR)는 또한 도 1b에 도시된 바와 같이 명시적 검출 하한 및 상한을 정의함으로써 제약될 수 있다.

검출 정밀도는 주로 가용 반응 부위의 수에 의해 영향을 받고 최저 검출가능한 농도는 주로 질의된 총 시료 부피에 의해 영향을 받는다. 도 3 및 도 4는 더 많은 수의 반응 용기로 정밀도가 얼마나 개선되는지 보여주고 있다. 도 4에서의 등고선은 비율로서 표현된 측정 정밀도의 값이다. 정밀도 값은 반응 부위의 증가되는 수에 따라 더 낮아지게(개선되게) 된다. 도 5는 고정된 수의 반응 부위(반응 부위가 더 큰 단위의 부피를 수용한다고 가정함)에 대해 부피에 따라 최저 검출가능한 농도가 어떻게 변화하는지 보여주고 있다; 이것은 개선된 검출 하한을 향한 기여 인자가 질의된 총 시료 부피임을 명확히 한다. 희귀 이벤트를 검출하기 위해, 초점은 그리하여 반응 부위의 수보다는 더 높은 총 시료 부피를 향하여야 한다. 도 5에서 발생된 플롯은 일례로서 20,000 반응 부위를 나타내고 있다. 플롯(502)은 10μL 반응 부피에 대하여 농도 대 정밀도를 나타내고 있다. 플롯(504)은 20μL 반응 부피에 대하여 농도 대 정밀도를 나타내고 있다. 플롯(506)은 200μL 반응 부피에 대하여 농도 대 정밀도를 나타내고 있다. 플롯(508)은 600μL 반응 부피에 대하여 농도 대 정밀도를 나타내고 있다. 플롯(510)은 1000μL 반응 부피에 대하여 농도 대 정밀도를 나타내고 있다.

에러 모델링

이 절은 순수 푸와송 모델에 잡음 인자를 도입한다. 검출되지 않고 가는 표적 분자를 갖는 반응 부위는 거짓 음성을 산출한다. 표적 분자를 갖지 않지만 양성 반응으로서 분류되게 된 반응 부위는 거짓 양성을 산출한다. 거짓 음성에 대한 가능한 원인은 예를 들어 증폭 실패일 수 있다. 거짓 콜에 대한 가능한 원인은, 예를 들어, 오염, 화학 효과, 소스 시료 관련 효과 및 광학 또는 시스템 잡음 효과를 포함한다. 그와 같이, 식(5)의 변량 성분은 2개의 다른 인자로부터의 변량을 포함하도록 확장될 수 있다:

거짓 양성, 거짓 음성 콜 비율

시스템 관련 바이어스

이러한 부가적 변량은 다음과 같이 추정된다: λ_거짓은 거짓 양성 및 거짓 음성 콜 때문에 관찰된 λ를 표시한다고 하자. 그것은 식(9)에 나타낸 바와 같이 참 λ와 관련된다.

관찰된 음성의 비율은 식(10)에 의해 주어진다.

(10)에 의해 주어진 음성의 비율을 식(3)에서 사용하면, 95% 신뢰 한계는 식(11)에 나타낸 바와 같이 구해질 수 있다:

샘플링 및 영-아닌 거짓 양성 및 거짓 음성 콜 비율로부터의 변량은 다음과 같이 주어진다:

시스템 잡음과 관련된 자의적 변량 소스 σ_{시스템바이어스}가 위 변량과 함께 모아져, 다음과 같은 총 변량을 준다:

이것은 식(14)에 의해 주어지는 확장된 신뢰 한계에 이른다.

식(14)는 정밀도의 더 정확한 추정을 위해 식(4)에서의 정밀도 공식에 대입된다:

거짓 콜 레이트로부터의 충격은 다음과 같이 몬테 카를로 모의 실험을 사용하여 조사된다: 영 거짓 콜 레이트의 영향 하에, 20% 음성을 내놓는 로드 농도는 최상 정밀도를 제공한다. 그러나 거짓 음성 레이트가 증가함에 따라, 최적 측정 정밀도를 위해 더 높은 백분율 음성을 목표로 하는 것이 바람직하다. 검출 하한(상한)은 거짓 양성(음성)에 의해 최대로 충격을 받는다.

도 6은 거짓 콜에 따라 정밀도가 저하함을 보여주는 그래프(600)를 예시하고 있다(거짓 양성은 검출가능한 농도의 하단에 충격을 주는 한편 거짓 음성은 상단에 충격을 준다.

도 7은 최상 측정 정밀도를 위해 여러 다른 백분율 음성을 목표로 함으로써 잡음 인자로부터 어떻게 회복할지 결정하는데 유용한 예의 등고선을 예시하고 있다. 위에서 언급된 바와 같이, 영 거짓 콜 레이트의 영향 하에, 최상 정밀도를 제공하는 백분율 음성은 20% 음성에서이다. 그렇지만, 거짓 음성 레이트가 증가함에 따라, 최적 측정 정밀도를 위해 더 높은 백분율 음성을 목표로 하는 것이 바람직하다. 등고선의 라벨은 백분율 음성에서 최상 정밀도를 위한 로드 농도 값을 제시한다.

도 8은 거짓 양성 콜을 낮추는 것이 검출 하한을 개선함을 보여주는 그래프를 예시하고 있다. 등고선의 라벨은 20% 검출 정밀도에서 최소 검출가능한 복제/반응 값을 제시하고 있다.

국한되는 것은 아니지만 먼지 또는 찌꺼기의 존재와 같은 품질 고려사항을 포함하는 각종 원인에 기인하는 반응 드롭아웃으로부터의 충격이 또한 몬테 카를로 모의 실험을 사용하여 조사된다.

도 9는 양성/음성 반응 손실을 보상할 때 최상 정밀도로 측정을 위한 소망 로드 농도를 갖는 등고선을 예시하고 있다. 이상적 시스템에 대하여, 피크 측정 정밀도는 20% 음성인 것으로 유도되었다. 그리하여, 동일한 양성 누락 레이트는 최상 측정 정밀 포인트 주위에서 누락된 음성 반응 부위 대비 누락된 양성 반응 부위에 대해 더 큰 수의 실제 반응 부위에 충격을 준다. 이것은 음성 누락 레이트에서의 증가 대비 양성 누락 레이트에서의 증가에 따라 변화 레이트가 더 빠르다는 사실로부터 증명된다. 이러한 효과로부터 회복하기 위해, 모의 실험은 양성 및 음성 반응 누락 양자에 대해 더 높은 로딩 시료 농도로 이동하는 것을 제안한다. 등고선의 라벨은 백분율 음성에서 최상 정밀도를 위한 로드 농도 값을 제시한다.

도 10은 검출 하한에 대한 충격을 감축하도록 음성 반응의 거절을 향한 하위 바이어스를 예시하고 있다. 등고선의 라벨은 20% 정밀도에서 최소 검출가능한 복제/반응 값을 제시하고 있다.

농도 추정 시 반응 부위 간 부피 측정 변량의 효과는 몬테 카를로 모의 실험으로 조사되었다. 더 큰 부피가 분자를 포함하고 있는 반응 부위의 증가된 확률에 의해 표현된다. 부피 변량의 정규 분포는 평균 부피의 백분율로서 취해진 표준 편차로 상정된다.

도 11은 반응 부피에서의 부피 측정 변량이 표적의 더 높은 농도에서 측정 능력을 저하시킴을 예시하고 있다.

도 12는 파티션 사이즈 변량을 보상하도록 최상 정밀도를 위한 백분율 음성에서의 표적 로드를 예시하고 있다.

희석을 사용하여 동적 범위를 확장

이전 절에서의 에러 모델링은 이론적 동적 범위가 잡음 인자에 의해 어떻게 떨어지는지 보여주었다. 디지털 PCR 실험으로부터 이러한 문제를 경감하고 동적 범위를 강화하는 하나의 방법은 하나 이상의 희석 포인트를 실행시키는 것에 의한다. 도 13은 대표적 dPCR 작업 흐름을 예시하고 있다. 시료(302)는 기질(304)에 도시된 바와 같이 복수의 반응 부위로 파티셔닝될 수 있다. 시료(302)는 적어도 한 번 희석되어 반응 부위로 파티셔닝될 수 있다. 도 13에 있어서, 시료(302)는 한 번 희석되어 기질(306) 내 일 세트의 반응 부위 내로 로딩된다. 추가적으로, 시료는 2회 희석되어 기질(308) 내 제2 세트의 반응 부위에 로딩될 수 있다. 시료(302)는 3회 희석되어 기질(310) 내 제3 세트의 반응 부위에 로딩될 수 있다. 예들에 있어서는, 본 교시의 다양한 실시예에 따라, 동적 범위 및 정밀도를 증가시키도록 시료 상에 적어도 하나의 희석이 수행된다.

도 14는 정밀도에 대한 희석의 효과를 예시하고 있다. 희석은 지원되는 범위보다 더 높은 농도의 시료를 검출하는 것을 돕지만, 시료를 지원되는 범위 밖에 검출 하한 가까이 둘 수 있다. 추가적으로, 희석의 다양한 조합에서 사용되는 희석은 희귀 표적의 검출을 보존하는 원래 시료 농도 및 풍부한 표적의 검출을 가능하게 하는 희석 포인트를 가지면서 동적 범위를 확장한다. 도 15는 반응 부위의 반이 제2 희석 포인트에 기부될 때 단일 기질에 대한 동적 범위 및 검출 하한에 대한 희석의 효과를 보여주는 플롯을 예시하고 있다.

2개의 희석 간 가용 반응의 분할에 기인하여 검출 하한에 대한 충격은 다음과 같이 예시된다:

2개의 희석 간 가용 반응의 분할에 기인하여 검출 상한에 대한 충격은 다음과 같이 예시된다:

도 17은 20K 반응 부위를 사용하여 하나의 부가적 희석으로 더 큰 동적 범위를 제공한 일례를 예시하고 있다. 이 예에 있어서, 원래 시료는 원래 농도 포인트로부터의 검출 범위 및 희석 포인트로부터의 검출 범위를 이용하기 위해, 부가적 희석 포인트로 실행되었다. 그렇지만, 식(16) 및 식(17)에 도시된 바와 같이, 희석 간 가용 반응을 분할하면, 원래 농도에서의 시료 부피에 전용인 더 적은 가용 반응 부위에 기인하여 검출 하한에서 사소한 상승이 있을 것이다. 그렇지만, 더 높은 농도가 이제 희석된 시료를 갖는 반응 세트로부터 검출가능하다. 어떠한 답에 대해서라도 시스템으로부터의 정밀도 요구 만족을 달성하려고 시행하기 위해, 원래 농도 포인트로부터의 동적 범위의 상위 x%는 희석 포인트로부터의 동적 범위의 하위 y%와 중첩되어, 요구된 정밀도에서 계속적 검출을 보장한다.

도 16a 및 도 16b는 위에서 설명된 희석 인자에 대한 한계를 예시하고 있다. 2개의 희석 포인트가 희석 포인트 1 및 2로 명명되게 하면, 이 경우 희석 포인트 1은 희석 포인트 2보다 더 큰 농도이다. 2개의 희석 포인트 간 계속적 검출 능력을 위해, 제2 희석 포인트는 제1 희석 포인트로부터의 검출 상한보다 작거나 같은 그 검출 하한을 가질 수 있다. 그렇지 않으면, 도 16a 및 도 16b에 나타낸 바와 같이 불연속 갭이 있을 수 있다. 이것은 제1 희석 포인트의 LLOD와 제2 희석 포인트의 ULOD 간 계속적으로 검출할 수 있을 필요가 있는 경우 희석할 수 있는 최저 농도에 대한 한계가 있음을 나타낸다.

요구되는 정밀도, 검출 하한, 및 동적 범위를 확장하기 위한 부가적 희석의 사용 간 절충점이 존재한다. 도 18a는 부가적 희석이 단지 2개의 희석을 사용하는 것을 넘어 시스템으로부터의 동적 범위를 어떻게 확장할 수 있는지 예시하고 있다. 이 모의 실험에서는 20K 반응 부위가 동등한 파티션으로 분할되었다. 도 18b는 부가적 희석 포인트로 분배된 초기 희석으로부터 역시 검출 하한에 대한 충격을 도시하고 있다. 5% 정밀도에서 2개보다 많은 희석 포인트는 제한된 부가적 동적 범위를 산출함을 알 수 있다. 그렇지만, 정밀도 요구가 하락됨에 따라, 더 많은 희석 포인트에 대해 동적 범위에서의 상당한 이득이 가능하다. 동적 범위에서의 이들 이득은 검출 하한에 대한 저하를 기꺼이 수락하는 것을 조건으로 한다. 또한, 희석을 수행하는 것은 부가적 변량 소스를 도입할 수 있으며, 그것은 차례로 시스템의 유효 정밀도를 제한할 수 있다. 도 18c는 예로서 5% 및 10% 정밀도 요구에 대해 4개의 희석 포인트를 도입하는 효과를 보여주고 있다.

전술한 교시를 사용하여, 방법은 본 교시의 다양한 실시예에 따라 dPCR 실험 디자이너 툴을 사용자에게 제공하는 컴퓨팅 시스템에 의해 구현될 수 있다. 사용자는 dPCR 실험 디자이너에 의해 제공된 출력에 기반하여 소망의 실험을 더 용이하게 계획하는 것이 가능할 수 있다. 추가적으로, 동적 범위 확장 관련 희석 인자 또는 표적 디지털 PCR 관련 희석 인자 양자가 추정된 후에, 저장 농도로부터 표적 dPCR 반응 혼합 희석으로 변환하기 위한 저장-대-반응 혼합 희석 인자(stock-to-reaction mix dilution factor)를 제안하도록 추가적 세트의 계산이 채용될 수 있다. 이들 계산은 이하의 절에서 설명된다.

저장-대-반응 혼합 희석 인자 - 저장 농도 대 표적 Dpcr 희석 인자

다양한 실시예에 의하면, dPCR 실험 디자이너는 dPCR 실험 디자이너에 의해 역시 계산된 표적 dPCR 희석 인자로 저장 시료를 희석하기 위한 저장-대-반응 혼합 희석 인자를 계산하도록 더 사용될 수 있다. 환언하면, dPCR 실험 디자이너는, 예를 들어, 동적 범위 및/또는 정밀도 요구에 기반하여 소망의 농도로 기지의 농도의 저장 용액을 희석하도록 사용자에게 부가적 희석 인자를 제공함으로써 소망의 실험을 수행함에 있어서 사용자를 더 도와줄 수 있다.

저장-대-반응 혼합 희석 인자의 계산은 dPCR 반응의 소망 부피, 반응 시약의 농도, 및 시료 및 반응 시약 양자에 대한 최소 피펫 부피와 같은 파라미터에 기반한다. 더욱, 저장-대 희석 희석 인자는 저장 시료를 표적 dPCR 반응 혼합 희석으로 하기 위하여 반응 혼합에 부가할 반응 성분의 각각의 적합한 부피에 더 기반할 수 있다. 저장-대-반응 혼합 희석 인자는 시료의 표적 dPCR 반응 혼합 희석을 달성하는데 필요한 검정 또는 시료의 어떠한 초기 희석이라도 (반응 혼합으로의 그들 부가 이전에) 결정하기 위하여 최소 피펫 부피에 또한 기반할 수 있다. 최소 피펫 부피는, 피펫으로부터 정확히 분배될 부피의 제한과 같은, 피펫의 능력이 시료를 준비할 수 있는 사용자의 능력에 영향을 미칠 수 있기 때문에 고려될 필요가 있을 수 있다. 이들 인자를 고려하여, 사용자는, 예를 들어, 다양한 실시예에 따라 저장-대-반응 혼합 희석 인자를 계산하도록 dPCR 실험 디자이너에 이하의 파라미터를 입력할 필요가 있을 수 있다.

입력 파라미터

- 시료에 대한 dPCR 반응 혼합에서의 표적 dPCR 희석 인자

- 최소 시료 피펫 부피

- 최소 시약 피펫 부피

- 소망의 총 반응 부피

- 희석되지 않은 마스터 혼합 농도

- 검정 리스트

- 희석되지 않은 검정 농도

dPCR 실험 디자이너의 저장-대-반응 혼합 희석 부분의 결과는 다양한 실시예에 따라 시료의 표적 dPCR 반응 혼합 희석을 산출하는 반응 혼합에 부가될 반응 성분 부피(및 어느 필요한 사전-희석 인자)의 리스트일 수 있다. dPCR 실험 디자이너에 의해 제공된 성분 부피는 최소 피펫 부피 제약을 만족할 수 있다. 예를 들어, dPCR 실험 디자이너의 출력은, 국한되는 것은 아니지만, 다음을 포함할 수 있다:

출력

- 초기 시료 희석 인자(dPCR 반응 혼합 밖)

- 초기 검정 희석 인자(dPCR 반응 혼합 밖)

- 다음에 대한 혼합 내 부피 및 최종 농도

- 마스터 혼합

- 초기에 희석된 검정

- 초기에 희석된 시료

- 물

- 총 부피

다양한 실시예에 따라, 저장-대-반응 혼합 희석 인자를 결정하는 방법은 최종 시료 희석 인자가 가능한지 점검하는 제1 단계를 포함한다. 제2 단계는 시료 및 검정의 초기 희석 인자를 계산하는 단계를 포함할 수 있다. 제3 단계는 시험 부피를 실험을 위한 소망 부피로서 설정하는 단계를 포함할 수 있다. 제4 단계는 검정 농도가 1x와 같을 때까지 다양한 파라미터를 결정할 수 있다. 제5 단계는 사용자에게 결과를 제공하는 것을 포함하며, 다음을 포함할 수 있다: 시료의 초기 희석 인자, 검정(들)의 초기 희석 인자, 최종 마스터 혼합 부피, 최종 검정 부피(들), 최종 시료 부피, 및 최종 물 부피. 저장-대-반응 혼합 희석 인자를 결정하는 방법의 일례는 다음과 같다:

단계 1: 최종 시료 희석 인자가 가능한지 점검

a. 반응 시약이 처리된 후에 남겨진 부피를 계산

b. 최종 시료 희석 인자가 남아있는 부피의 백분율보다 더 크면, 반환

단계 2: 시료 및 검정의 초기 희석 인자를 계산

a. 시약 농도 및 시약에 대한 최소 피펫 부피에 기반하여 필요로 되는 최소 반응 부피를 계산

b. 초기 마스터 혼합 부피를 계산

c. 초기 검정 부피를 계산

d. 소망 희석에서의 시료 부피가 남아있는 부피에 맞는지 결정

i. 그러하면, 시료를 남아있는 부피에 맞추는 단순 시료 부피 계산을 수행

ii. 그러하지 않으면, 최종 시료 희석 인자를 달성하는데 필요로 되는 잉여 시료 부피를 계산

e. 2d에서 계산된 시료 부피에 기반하여 시료의 초기 희석 인자를 계산

f. 소망의 총 반응 부피, 최소 반응 부피 및 최종 시료 희석 인자에 기반하여 검정(들)의 초기 희석 인자를 계산

단계 3: 시험 부피 = 소망 부피로 설정

단계 4: 시약 농도가 1x와 같을 때까지 순환

a. 최종 마스터 혼합 부피를 계산

b. 시험 검정 부피(들)를 계산

c. 시험 시료 부피를 계산

d. 시험 물 부피를 계산

e. 시료의 초기 희석 인자를 재계산

f. 검정(들)의 초기 희석 인자를 재계산

g. 검정(들)의 재계산된 초기 희석 인자에 기반하여 최종 검정 부피(들)를 재계산

h. 최소 시료 피펫 부피 및 시료의 재계산된 초기 희석 인자에 기반하여 최종 시료 부피를 재계산

i. 최종 물 부피를 계산

j. 시험 최종 부피(시험 부피의 최대값 및 마스터 혼합, 검정, 시료 및 물 부피의 합)를 계산

k. 어느 검정 농도도 1과 같지 않으면, 시험 부피를 증분

단계 5: 시료의 초기 희석 인자, 검정(들)의 초기 희석 인자, 최종 마스터 혼합 부피, 최종 검정 부피(들), 최종 시료 부피, 및 최종 물 부피를 반환

dPCR 실험 디자이너 사용

dPCR 실험 디자이너는 디지털 PCR 실험을 위한 3개의 전형적 작업 흐름을 갖는 위 디지털 PCR 모델에 기반하여 만들어진 툴이다. 사용자가 이전의 qPCR 실험으로부터 Ct 값 또는 나노드롭 눈금값의 관점으로 대체 정보를 갖고 있으면, dPCR 실험 디자이너는 그 정보를 입력함으로써 표적 디지털 PCR 희석 인자를 계산하도록 사용될 수 있다. 추가적으로, dPCR 실험 디자이너는 디지털 PCR 실험을 위한 반응 혼합에 대해 사용자에게 권고를 발생시킬 수 있다.

대안으로, dPCR 실험 디자이너는 2개의 다른 농도에서 2개의 기질에 걸쳐 수행되는 디지털 PCR 실험을 위한 PCR 혼합에 대한 권고를 발생시키도록 사용될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 소망의 동적 범위에 걸친 유전자 발현 정량 작업 흐름을 지원할 것이다.

희귀 표적 검출을 위하여, dPCR 실험 디자이너는 소정 신뢰도 레벨에서 소망의 폴드 변화를 검출하는데 필요로 되는, 예정된 수의 반응 부위를 각각 포함하는, 기질의 수에 대한 권고를 제공할 수 있다. 이것은, 일례로서, 듀얼 리포터 SNP 검정을 사용하는 희귀 돌연변이 검출 작업 흐름을 지원할 것이다.

도 20a 및 도 20b는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 디지털 PCR 실험 디자이너 툴에 의해 지원되는 3개의 다른 작업 흐름의 예의 순서도(2000)를 예시하고 있다. 작업 흐름은 사용자가 dPCR을 사용하여 수행하기를 원할 수 있는 실험의 유형을 포함한다. dPCR 실험 디자이너는 사용자가 소망의 실험을 계획하는 것을 도울 수 있다.

dPCR 실험 디자이너에 포함된 작업 흐름은 희귀 돌연변이 작업 흐름(2004), 절대 정량을 위한 dPCR 실험의 검출 속성 최적화 작업 흐름(2006), 및 dPCR 실험을 위한 희석 인자를 추정하기 위해 qPCR 또는 나노드롭 데이터의 사용 작업 흐름(2008)을 포함할 수 있다. 다양한 실시예에 의하면, dPCR 실험 디자이너는 단계(2002)에서 사용자가 풀려고 하고 있는 문제의 유형을 사용자가 선택 가능하게 한다. 환언하면, 사용자는 작업 흐름을 선택할 수 있다.

일례로서, 사용자는 희귀 돌연변이 작업 흐름(2004)을 선택할 수 있다. dPCR 실험 디자이너는 그 후 실험을 설계하는데 필요한 정보를 입력하도록 사용자를 인도할 수 있다. 예를 들어, 단계(2010)에서, 사용자는 그들이 갖고 있는 야생-유형 농도의 유형을 선택하도록 요청받을 것이다. 사용자가 나노드롭 농도를 갖고 있으면, 사용자는 이배체 게놈 중량 또는 게놈 사이즈 및 배수성과 같이, 단계(2012)에서 알려져 있는 게놈에 대한 정보를 선택하도록 요청받을 것이다. 사용자가 야생-유형 농도의 소스로서 qPCR 눈금값을 갖고 있으면, 단계(2014)에서 사용자는 Ct 값이 유도된 것이 희석 계열 없이인지 있으면서인지 선택하도록 질의받을 것이다.

그 후, 단계(2016)에서, 사용자는 그들이 검출 하한을 어떻게 제약하고 싶은지 선택하도록 요청받을 것이다. 사용자는, 예를 들어, 거짓 양성 분포를 설정하거나 검출 하한을 설정하기를 원할 수 있다.

그 후 사용자는, 예를 들어, 단계(2018)에서 나노드롭 농도, 싱글 Ct 또는 사용된 희석 계열에 기반하여 필요로 되는 정보를 입력할 수 있다. 또한 사용자는, 사용된 기기의 유형, 거짓 양성 레이트 및 거짓 음성 레이트와 같이, 단계(2020)에서 다른 고급 입력을 제공할 수 있다.

그 후, 다양한 실시예에 의하면, 단계(2024)에서 사용자는, 국한되는 것은 아니지만, 야생 유형 희석 정보, dPCR 셋-업 정보, 대화형 그래프, 및/또는 저장 용액 셋업 정보를 포함하는 결과 정보를 제공받을 것이다. 그 후 사용자는 소망의 희귀 돌연변이 실험을 수행하도록 이러한 정보를 사용할 수 있다.

도 22a 내지 도 22d는 본 교시에 의해 설명되는 다양한 실시예에 따라 dPCR 실험 디자이너의 희귀 돌연변이 작업 흐름(2004)을 구현하여 사용자에게 디스플레이되는 사용자 인터페이스를 예시하고 있다. 도 22a 내지 도 22d는 아래에서 더 상세하게 설명된다.

절대 정량을 위한 dPCR 실험의 검출 속성 최적화 작업 흐름(2006)에서, 사용자는 단계(2030)에서 실험의 목적을 선택하도록 요청받는다. 예를 들어, 사용자는 동적 범위 최대화, 반응 부위의 칩의 수 최소화, 희석 인자 계산, 및/또는 검출 하한 계산을 선택할 수 있다. 사용자가 목적이 동적 범위를 최대화하는 것이라고 선택하면, 단계(2032)에서 사용자는 그들이 동적 범위를 어떻게 제약하고 싶은지 선택하도록 요청받는다. 사용자가 선택하는 목적에 따라, 단계(2034)에서 사용자는 다른 정보를 입력한다. 또한 사용자는, 사용된 기기의 유형, 특정 희석에서 사용된 칩의 수(기지의 반응 부위 수를 포함함), 거짓 양성 레이트 및 거짓 음성 레이트와 같이, 단계(2036)에서 고급 입력을 제공할 수 있다. 단계(2038)에서 사용자에게 결과가 제공된다.

도 21a 내지 도 21d는 본 교시에 의해 설명되는 실시예에 따라 검출 속성 최적화 작업 흐름(2006)을 구현하여 사용자에게 디스플레이되는 dPCR 실험 디자이너의 사용자 인터페이스를 예시하고 있다. 도 21a 내지 도 21d는 아래에서 더 상세하게 설명된다.

당신의 디지털 실험을 위한 희석 인자를 추정하기 위해 qPCR 또는 나노드롭 데이터의 사용 작업 흐름(2008)에서, 사용자는 단계(2050)에서 그들이 갖고 있는 데이터의 유형을 입력하도록 요청받을 것이다. 예를 들어, 사용자가 나노드롭 데이터를 갖고 있으면, 사용자는 단계(2052)에서 게놈 사이즈 및 배수성 및 이배체 게놈 중량의 유형을 입력하도록 요청받을 것이다. 사용자가 qPCR 데이터를 갖고 있으면, 단계(2054)에서 사용자는 유도된 Ct 값이 희석 계열이 있었는지 없었는지 선택하도록 요청받을 것이다. 다음으로, 사용자는 단계(2056)에서 실험의 유형을 선택하도록 요청받을 것이다. 실험의 유형은, 예를 들어, 싱글플렉스, 듀플렉스, SNP 검정 또는 커스텀일 수 있다. 단계(2058)에서 사용자는 이전 질의에서 선택된 정보에 따라 다른 정보를 입력하도록 요청받을 수 있다. 추가적으로, 단계(2058)에서, 사용자는 또한 저장-대-반응 혼합 희석 인자를 결정하는데 필요로 되는 파라미터를 입력하도록 요청받을 수 있다. 단계(2060)에서, 사용자는 다른 고급 입력을 제공할 수 있다. 단계(2062)에서, 사용자는, 예를 들어, 그들이 사용한 데이터의 유형, qPCR 또는 나노드롭에 기반하여 결과를 제공받을 수 있다.

도 21a, 도 21b, 도 21c 및 도 21d는 dPCR 실험 디자이너를 사용하여 유전자 발현 정량 작업 흐름을 위한 단계를 포함하는 방법의 일례를 예시하고 있다. 측정 정밀도 요구 및 최소 복제/반응 입력이 디지털 PCR 모델을 사용하여 동적 범위 확장 희석 인자를 추정하는데 사용된다.

도 22a, 도 22b, 도 22c 및 도 22d는 디지털 PCR 실험 디자이너를 사용하는 희귀 돌연변이 검출 실험 설계의 단계를 예시하고 있다. 일례에 있어서, 사용자는 우선 그들의 시료에 존재하는 야생 유형 표적을 정량하기 위해 qPCR 실험 또는 나노드롭 눈금값을 실행할 수 있다. 이러한 정보는 소망의 복제/반응에서 배경의 검출을 가능하게 하기 위해 표적 디지털 PCR 희석 인자를 추정하도록 dPCR 실험 디자이너에 의해 사용될 수 있다. 부가적으로, dPCR 실험 디자이너는 사용자로 하여금 그들이 검정 및 시스템에 대한 거짓 양성 분포에 대하여 무엇을 실험적으로 결정할 수 있는지 입력 가능하게 한다. 그 후 사용자는 비-표적 제어를 실행하고 실험에서 전형적으로 보이는 거짓 양성의 수의 평균 및 표준 편차를 결정할 수 있다. 이러한 정보는, 표적 폴드 변화 및 표적 p-값과 함께, dPCR 실험 디자이너가 디지털 PCR 모델을 사용하여 배경 위 소망 신뢰도 레벨에서 희귀 이벤트를 검출하는데 필요한 칩의 수를 추정 가능하게 할 수 있다.

정량 결과

이 절은 dPCR 시스템 상에서 μl당 1 내지 1e6 복제 사이 어디에서의 정량을 실증한다. 이 예에 있어서는, 2개의 칩 2개의 희석 전략을 갖는 라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies)로부터의 QuantStudio 3D가 사용된다. 모델에 관하여, 요구는 6 로그의 동적 범위(DR)이며, 1 복제/μl에서 검출 최하한을 갖는다. 0.025% 거짓 양성 레이트 및 0.05% 거짓 음성 레이트를 사용하면, dPCR 실험 디자이너는 0.001의 희석 인자의 권고를 제공한다.

6 로그 떨어진 시료(AA 내지 GG)들은 희석되지 않은 그리고 희석된 쌍의 칩 상에서 아래 표에 주어진 농도에 있다. 하이라이트 표시된 농도가 시스템 상에서 실행되었다. 이것은 모의 실험된 예이기 때문에, 이 시스템에 의해 검출가능하지 않을 농도는 실행되지 않았다.

도 23a는, 여기에서 설명되는 실시예에 따라, 위에서 설명된 모델에 기반하는 정량 결과를 예시하고 있다. 여기에서, 시료(AA, BB, CC)는 희석한 칩 상에서 정확히 정량된 한편, 시료(EE, FF, GG)는 희석되지 않은 칩 상에서 정확히 정량되었다. 시료(DD)는 양 데이터 포인트를 사용하여 정량되었다. 도 23b는 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 따라 dPCR 실험 디자이너에서 사용된 모델링 기법 상에서의 시료를 투영하고 있다.

비 추정 결과

이하의 절은 2개 칩 2개 희석 전략으로 컴퓨터 모의 실험된 데이터를 사용하여 배경 신호 대비 희귀 표적을 검출하는 것을 실증한다. 1:1000 비는 3 로그의 동적 범위 요구로 변환된다. 검출 최하한은 마이크로 리터당 10 복제에서 설정되었다. 모델에 대한 시스템 파라미터는 라이프 테크놀로지즈 QuantStudio 12K Flex에 따라 선택되었다. .07% 거짓 양성 레이트 및 .18% 거짓 음성 레이트를 사용하면, 시스템은 30% 정밀도보다 더 양호한 각각의 표적에서의 검출을 위해 .005의 희석 인자를 권고하였다.

도 24는 1000 폴드 배경의 존재시 희귀 표적 추정을 보여주는 모델을 예시하고 있다. 시료(A)는 10000 복제/μl의 풍부한 표적 및 10 복제/μl의 희귀 표적으로 모의 실험되었다. 희석되지 않은 구성 및 희석된 구성 양자에서, 많은 수의 반복을 통하여 이 데이터로부터 서브-샘플링함으로써, 야생 유형은 6.95% 정밀도에서 희석한 포인트에서 검출된 한편, 희귀 표적은 4.49% 정밀도에서 희석되지 않은 포인트에서 검출되었다. 비는 0.001에서 정확히 예측되었다.

컴퓨터 시스템

당업자는 다양한 실시예의 동작이, 적합한 대로, 하드웨어, 소프트웨어, 펌웨어 또는 그 조합을 사용하여 구현될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 프로세스는 소프트웨어, 펌웨어 또는 하드-와이어드 로직의 제어 하에 프로세서 또는 다른 디지털 회로를 사용하여 수행될 수 있다. (용어 "로직"은 여기에서는, 나열된 기능을 수행할 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 고정 하드웨어, 프로그래밍 가능한 로직 및/또는 그 적합한 조합을 지칭한다.) 소프트웨어 및 펌웨어는 컴퓨터-판독가능한 매체 상에 저장될 수 있다. 소정 다른 프로세스는, 당업자에게 주지되어 있는 바와 같이, 아날로그 회로를 사용하여 구현될 수 있다. 부가적으로, 메모리 또는 다른 저장소와 더불어, 통신 컴포넌트가 본 발명의 실시예에서 채용될 수 있다.

도 19는, dPCR 실험 디자이너의 다양한 실시예에 따라, 프로세싱 기능성을 수행하도록 채용될 수 있는 컴퓨터 시스템(1900)을 예시하는 블록 선도이다. 컴퓨팅 시스템(1900)은 프로세서(1904)와 같은 하나 이상의 프로세서를 포함할 수 있다. 프로세서(1904)는, 예를 들어, 마이크로프로세서, 컨트롤러 또는 다른 제어 로직과 같은 범용 또는 특수 목적 프로세싱 엔진을 사용하여 구현될 수 있다. 이 예에 있어서, 프로세서(1904)는 버스(1902) 또는 다른 통신 매체에 접속되어 있다.

추가적으로, 도 19의 컴퓨팅 시스템(1900)은, 랙-마운트 컴퓨터, 메인프레임, 슈퍼컴퓨터, 서버, 클라이언트, 데스크톱 컴퓨터, 랩톱 컴퓨터, 태블릿 컴퓨터, 핸드-헬드 컴퓨팅 디바이스(예를 들어, PDA, 셀 폰, 스마트 폰, 팜톱 등), 클러스터 그리드, 넷북, 내장 시스템, 또는 주어진 애플리케이션 또는 환경에 적합하거나 바람직할 수 있는 바와 같은 어느 다른 유형의 특수 또는 범용 컴퓨팅 디바이스와 같은, 여러 형태 중 어느 것으로라도 구체화될 수 있음을 인식하여야 한다. 부가적으로, 컴퓨팅 시스템(1900)은 클라이언트/서버 환경 및 하나 이상의 데이터베이스 서버, 또는 LIS/LIMS 기반구조와의 통합을 포함하는 관용적 네트워크 시스템을 포함할 수 있다. 근거리 통신망(LAN) 또는 광역 통신망(WAN)을 포함하는 그리고 무선 및/또는 유선 컴포넌트를 포함하는 여러 관용적 네트워크 시스템이 당업계에 주지되어 있다. 부가적으로, 클라이언트/서버 환경, 데이터베이스 서버 및 네트워크는 당업계에 문서가 충분히 있다.

컴퓨팅 시스템(1900)은 정보를 통신하기 위해 버스(1902) 또는 다른 통신 메커니즘, 및 정보를 프로세싱하기 위해 버스(1902)와 결합된 프로세서(1904)를 포함할 수 있다.

또한 컴퓨팅 시스템(1900)은 프로세서(1904)에 의해 실행될 명령어를 저장하기 위해 버스(1902)에 결합된, 램(RAM) 또는 다른 동적 메모리일 수 있는, 메모리(1906)를 포함한다. 메모리(1906)는 또한 프로세서(1904)에 의해 실행될 명령어의 실행 동안 임시 변수 또는 다른 중간 정보를 저장하도록 사용될 수 있다. 컴퓨팅 시스템(1900)은 프로세서(1904)를 위한 정적 정보 및 명령어를 저장하기 위해 버스(1902)에 결합된 롬(ROM)(1908) 또는 다른 정적 저장 디바이스를 더 포함한다.

또한 컴퓨팅 시스템(1900)은 정보 및 명령어를 저장하기 위해 제공되어 버스(1902)에 결합된 자기 디스크, 광학 디스크 또는 솔리드 스테이트 드라이브(SSD)와 같은 저장 디바이스(1910)를 포함할 수 있다. 저장 디바이스(1910)는 매체 드라이브 및 착탈식 저장 인터페이스를 포함할 수 있다. 매체 드라이브는, 하드 디스크 드라이브, 플로피 디스크 드라이브, 자기 테이프 드라이브, 광학 디스크 드라이브, CD 또는 DVD 드라이브(R 또는 RW), 플래시 드라이브, 또는 다른 착탈식 또는 고정식 매체 드라이브와 같은, 고정식 또는 착탈식 저장 매체를 지원하는 드라이브 또는 다른 메커니즘을 포함할 수 있다. 이들 예들이 예시하는 바와 같이, 저장 매체는 특정 컴퓨터 소프트웨어, 명령어 또는 데이터를 내부에 저장한 컴퓨터-판독가능한 저장 매체를 포함할 수 있다.

대안의 실시예에 있어서, 저장 디바이스(1910)는 컴퓨터 프로그램 또는 다른 명령어 또는 데이터가 컴퓨팅 시스템(1900) 내에 로딩될 수 있게 하도록 다른 유사한 수단을 포함할 수 있다. 그러한 수단은, 예를 들어, 프로그램 카트리지 및 카트리지 인터페이스, 착탈식 메모리(예를 들어, 플래시 메모리 또는 다른 착탈식 메모리 모듈) 및 메모리 슬롯과 같은 착탈식 저장 유닛 및 인터페이스, 및 소프트웨어 및 데이터가 저장 디바이스(1910)로부터 컴퓨팅 시스템(1900)으로 전송될 수 있게 하는 다른 착탈식 저장 유닛 및 인터페이스를 포함할 수 있다.

컴퓨팅 시스템(1900)은 또한 통신 인터페이스(1918)를 포함할 수 있다. 통신 인터페이스(1918)는 소프트웨어 및 데이터가 컴퓨팅 시스템(1900)과 외부 디바이스 간 전송될 수 있게 하도록 사용될 수 있다. 통신 인터페이스(1918)의 예는 모뎀, (이더넷 또는 다른 NIC 카드와 같은) 네트워크 인터페이스, (예를 들어, USB 포트, RS-232C 직렬 포트와 같은) 통신 포트, PCMCIA 슬롯 및 카드, 블루투스 등을 포함할 수 있다. 통신 인터페이스(1918)를 통하여 전송되는 소프트웨어 및 데이터는 통신 인터페이스(1918)에 의해 수신될 수 있는 전자, 전자기, 광학 또는 다른 신호일 수 있는 신호의 형태이다. 이들 신호는 무선 매체, 와이어 또는 케이블, 광섬유, 또는 다른 통신 매체와 같은 채널을 통하여 통신 인터페이스(1918)에 의해 송신 및 수신될 수 있다. 채널의 일부 예는 전화 회선, 셀룰러 폰 링크, RF 링크, 네트워크 인터페이스, 근거리 또는 광역 통신망, 및 다른 통신 채널을 포함한다.

컴퓨팅 시스템(1900)은 컴퓨터 사용자에게 정보를 디스플레이하기 위해 캐소드 레이 튜브(CRT) 또는 액정 디스플레이(LCD)와 같은 디스플레이(1912)에 버스(1902)를 통하여 결합될 수 있다. 영숫자 및 다른 키를 포함하는 입력 디바이스(1914)는, 예를 들어, 정보 및 커맨드 선택을 프로세서(1904)에 통신하기 위해 버스(1902)에 결합되어 있다. 입력 디바이스는 또한 터치스크린 입력 능력으로 구성된 LCD 디스플레이와 같은 디스플레이일 수 있다. 또 다른 유형의 사용자 입력 디바이스는 지시 정보 및 커맨드 선택을 프로세서(1904)에 통신하기 위한 그리고 디스플레이(1912) 상의 커서 움직임을 제어하기 위한 마우스, 트랙볼 또는 커서 지시 키와 같은 커서 컨트롤(1916)이다. 이러한 입력 디바이스는 전형적으로는, 디바이스가 평면 내 위치를 특정할 수 있게 하는, 2개 축, 제1 축(예를 들어, x) 및 제2 축(예를 들어, y)으로의 2개의 자유도를 갖는다. 컴퓨팅 시스템(1900)은 데이터 프로세싱을 제공하고 그러한 데이터에 대해 소정 레벨의 신뢰도를 제공한다. 본 교시의 실시예의 특정 구현과 일관되게, 데이터 프로세싱 및 신뢰도 값은 메모리(1906)에 들어있는 하나 이상의 명령어의 하나 이상의 시퀀스를 실행하는 프로세서(1904)에 응답하여 컴퓨팅 시스템(1900)에 의해 제공된다. 그러한 명령어는 저장 디바이스(1910)와 같은 다른 컴퓨터-판독가능한 매체로부터 메모리(1906) 내로 판독될 수 있다. 메모리(1906)에 들어있는 명령어의 시퀀스의 실행은 프로세서(1904)가 여기에서 설명된 프로세스 상태를 수행하게 한다. 대안으로 하드-와이어드 회로가 본 교시의 실시예를 구현하도록 소프트웨어 명령어와 조합하여 또는 그 대신에 사용될 수 있다. 그리하여, 본 교시의 실시예의 구현은 하드웨어 회로 및 소프트웨어의 어떠한 특정 조합으로도 한정되지 않는다.

여기에서 사용되는 바와 같은 용어 "컴퓨터-판독가능한 매체" 및 "컴퓨터 프로그램 제품"은 일반적으로는 실행을 위해 프로세서(1904)에 하나 이상의 시퀀스 또는 하나 이상의 명령어를 제공하는 것에 관여되는 어떠한 매체라도 지칭한다. (컴퓨터 프로그램 또는 다른 그룹화의 형태로 그룹화될 수 있는) "컴퓨터 프로그램 코드"라고 일반적으로 지칭되는 그러한 명령어는, 실행될 때, 컴퓨팅 시스템(1900)이 본 발명의 실시예의 기능 또는 특징을 수행 가능하게 한다. 이들 및 다른 형태의 컴퓨터-판독가능한 매체는, 국한되는 것은 아니지만, 비-휘발성 매체, 휘발성 매체 및 전송 매체를 포함하여 여러 형태를 취할 수 있다. 비-휘발성 매체는, 예를 들어, 저장 디바이스(1910)와 같이 솔리드 스테이트, 광학 또는 자기 디스크를 포함한다. 휘발성 매체는 메모리(1906)와 같이 동적 메모리를 포함한다. 전송 매체는 버스(1902)를 포함하는 와이어를 포함하여 동축 케이블, 구리선 및 광섬유를 포함한다.

컴퓨터-판독가능한 매체의 흔한 형태는, 예를 들어, 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 또는 어떠한 다른 자기 매체, CD-ROM, 어떠한 다른 광학 매체, 펀치 카드, 페이퍼 테이프, 홀 패턴을 갖는 어떠한 다른 물리적 매체, RAM, PROM, 및 EPROM, 플래시-EPROM, 어떠한 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 이후 설명되는 바와 같은 반송파, 또는 컴퓨터가 판독해 낼 수 있는 어떠한 다른 매체라도 포함한다.

다양한 형태의 컴퓨터 판독가능한 매체가 실행을 위해 프로세서(1904)에 하나 이상의 명령어의 하나 이상의 시퀀스를 반송하는데 관여될 수 있다. 예를 들어, 초기에는 원격 컴퓨터의 자기 디스크 상의 명령어가 반송될 수 있다. 원격 컴퓨터는 명령어를 그 동적 메모리 내로 로딩하고 그 명령어를 모뎀을 사용하여 전화 회선을 통해 보낼 수 있다. 컴퓨팅 시스템(1900)의 로컬 모뎀은 전화 회선 상에서 데이터를 수신하고 적외선 송신기를 사용하여 데이터를 적외선 신호로 변환할 수 있다. 버스(1902)에 결합된 적외선 검출기는 적외선 신호 내 반송된 데이터를 수신하고 그 데이터를 버스(1902) 상에 놓을 수 있다. 버스(1902)는 데이터를 메모리(1906)에 반송하고, 그로부터 프로세서(1904)는 명령어를 검색하여 실행한다. 선택사항으로서 메모리(1906)에 의해 수신된 명령어는 프로세서(1904)에 의한 실행 전이든 후이든 저장 디바이스(1910) 상에 저장될 수 있다.

위 설명은, 명확성 목적으로, 여러 다른 기능적 유닛 및 프로세서를 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였음을 인식할 것이다. 그렇지만, 여러 다른 기능적 유닛, 프로세서 또는 도메인 간 기능성의 어떠한 적합한 분산이라도 본 발명으로부터 격하됨이 없이 사용될 수 있음은 분명할 것이다. 예를 들어, 별개의 프로세서 또는 컨트롤러에 의해 수행되도록 예시된 기능성은 동일 프로세서 또는 컨트롤러에 의해 수행될 수도 있다. 그러므로, 특정 기능적 유닛에 대한 지칭은, 엄격한 논리적 또는 물리적 구조 또는 조직을 나타낸다기보다는, 설명된 기능성을 제공하기에 적합한 수단에 대한 지칭으로서 보여져야 할 뿐인 것이다.

본 발명이 특정 대표적 실시예, 예 및 애플리케이션을 참조하여 설명되었기는 하지만, 본 발명으로부터 벗어남이 없이 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음은 당업자에게 분명할 것이다.

Claims

디지털 PCR(dPCR) 실험을 설계하기 위한 방법으로서, 상기 방법은,
최적화 유형의 선택을, 사용자로부터, 수신하는 단계;
실험을 위한 정밀도 척도를, 상기 사용자로부터, 수신하는 단계;
상기 실험을 위한 반응 부위 내 표적의 최소 농도를, 상기 사용자로부터, 수신하는 단계;
상기 최적화 유형에 기반하여 상기 실험을 위한 일 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 단계; 및
상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 상기 사용자에게 디스플레이하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 최적화 유형은 동적 범위를 최대화하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 최적화 유형은 기질의 수를 최소화하는 것이되, 각각의 기질은 예정된 수의 반응 부위를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 최적화 유형은 희석 인자를 계산하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 최적화 유형은 검출 하한을 계산하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 사용자로부터 상기 실험에서 사용될 저장 용액 정보를 수신하는 단계를 더 포함하는 방법.
제6항에 있어서,
저장-대-반응 혼합 희석 인자(stock-to-reaction mix dilution factor)를 결정하는 단계; 및
상기 저장-대-반응 혼합 희석 인자를 상기 사용자에게 디스플레이하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 단일 희석 동적 범위를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 최소 및 최대 단일 희석 검출 범위를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 다수의 희석 동적 범위를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 최소 및 최대 다수의 희석 검출 범위를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 실험을 위한 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 단계는 부피 측정 변량에 기반하여 계산하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 실험을 위한 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 단계는 거짓 양성 및 거짓 음성 모델에 기반하여 계산하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 실험을 위한 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 단계는 예상된 반응 드롭아웃(reaction dropout)에 기반하여 계산하는 단계를 포함하는 방법.
프로세서에 의해 실행가능한 명령어로 인코딩된 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체로서, 상기 명령어는,
최적화 유형의 선택을, 사용자로부터, 수신하기 위한 명령어;
실험을 위한 정밀도 척도를, 상기 사용자로부터, 수신하기 위한 명령어;
상기 실험을 위한 반응 부위 내 표적의 최소 농도를, 상기 사용자로부터, 수신하기 위한 명령어;
상기 최적화 유형에 기반하여 상기 실험을 위한 일 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하기 위한 명령어; 및
상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 상기 사용자에게 디스플레이하기 위한 명령어를 포함하는, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제15항에 있어서, 상기 최적화 유형은 동적 범위를 최대화하는 것인, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제15항에 있어서, 상기 최적화 유형은 기질의 수를 최소화하는 것이되, 각각의 기질은 예정된 수의 반응 부위를 포함하는, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제15항에 있어서, 상기 최적화 유형은 희석 인자를 계산하는 것인, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제15항에 있어서, 상기 최적화 유형은 검출 하한을 계산하는 것인, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제15항에 있어서,
상기 사용자로부터 상기 실험에서 사용될 저장 용액 정보를 수신하기 위한 명령어를 더 포함하는, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제20항에 있어서,
저장-대-반응 혼합 희석 인자를 결정하는 것; 및
상기 저장-대-반응 혼합 희석 인자를 상기 사용자에게 디스플레이하는 것을 더 포함하는, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제15항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 단일 희석 동적 범위를 포함하는 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제15항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 최소 및 최대 단일 희석 검출 범위를 포함하는, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제15항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 다수의 희석 동적 범위를 포함하는, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제15항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 최소 및 최대 다수의 희석 검출 범위를 포함하는, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제15항에 있어서, 상기 실험을 위한 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 것은 부피 측정 변량에 기반하여 계산하는 것을 포함하는, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제15항에 있어서, 상기 실험을 위한 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 것은 거짓 양성 및 거짓 음성 모델에 기반하여 계산하는 것은 포함하는, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
제15항에 있어서, 상기 실험을 위한 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 것은 예상된 반응 드롭아웃에 기반하여 계산하는 것을 포함하는, 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체.
디지털 PCR 시스템을 설계하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은,
프로세서; 및
상기 프로세서에 의해 실행가능한 명령어로 인코딩된 메모리를 포함하되,
상기 명령어는,
최적화 유형의 선택을, 사용자로부터, 수신하기 위한 명령어;
실험을 위한 정밀도 척도를, 상기 사용자로부터, 수신하기 위한 명령어;
상기 실험을 위한 반응 부위 내 표적의 최소 농도를, 상기 사용자로부터, 수신하기 위한 명령어;
상기 최적화 유형에 기반하여 상기 실험을 위한 일 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하기 위한 명령어; 및
상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 상기 사용자에게 디스플레이하기 위한 명령어를 포함하는 시스템.
제29항에 있어서, 상기 최적화 유형은 동적 범위를 최대화하는 것인 시스템.
제29항에 있어서, 상기 최적화 유형은 기질의 수를 최소화하는 것이되, 각각의 기질은 예정된 수의 반응 부위를 포함하는 시스템.
제29항에 있어서, 상기 최적화 유형은 희석 인자를 계산하는 것인 시스템.
제29항에 있어서, 상기 최적화 유형은 검출 하한을 계산하는 것인 시스템.
제29항에 있어서,
상기 사용자로부터 상기 실험에서 사용될 저장 용액 정보를 수신하기 위한 명령어를 더 포함하는 시스템.
제34항에 있어서,
저장-대-반응 혼합 희석 인자를 결정하는 것; 및
상기 저장-대-반응 혼합 희석 인자를 상기 사용자에게 디스플레이하는 것을 더 포함하는 시스템.
제29항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 단일 희석 동적 범위를 포함하는 시스템.
제29항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 최소 및 최대 단일 희석 검출 범위를 포함하는 시스템.
제29항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 다수의 희석 동적 범위를 포함하는 시스템.
제29항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 최소 및 최대 다수의 희석 검출 범위를 포함하는 시스템.
제29항에 있어서, 상기 실험을 위한 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 것은 부피 측정 변량에 기반하여 계산하는 것을 포함하는 시스템.
제29항에 있어서, 상기 실험을 위한 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 것은 거짓 양성 및 거짓 음성 모델에 기반하여 계산하는 것을 포함하는 시스템.
제29항에 있어서, 상기 실험을 위한 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 것은 예상된 반응 드롭아웃에 기반하여 계산하는 것을 포함하는 시스템.
디지털 PCR(dPCR) 실험을 설계하기 위한 방법으로서, 상기 방법은,
농도 데이터 유형의 선택을, 사용자로부터, 수신하는 단계;
실험을 위한 게놈 정보를, 상기 사용자로부터, 수신하는 단계;
상기 실험을 위한 검출 하한 척도를, 상기 사용자로부터, 수신하는 단계;
상기 실험을 위한 소망 폴드 변화를, 상기 사용자로부터, 수신하는 단계;
상기 농도 데이터 유형에 기반하여 상기 실험을 위한 일 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 결정하는 단계; 및
상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자를 상기 사용자에게 디스플레이하는 단계를 포함하는 방법.
제43항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 상기 실험을 위한 야생 유형 희석 정보를 포함하는 방법.
제43항에 있어서, 상기 세트의 dPCR 실험 설계 인자는 상기 사용자가 상기 실험을 위해 사용할 수 있는 기질의 수를 포함하되, 각각의 기질은 기지의 수의 반응 부위를 갖는 방법.
제43항에 있어서,
상기 사용자로부터 상기 실험에서 사용될 저장 용액 정보를 수신하는 단계를 더 포함하는 방법.
제46항에 있어서,
저장-대-반응 혼합 희석 인자를 결정하는 단계; 및
상기 저장-대-반응 혼합 희석 인자를 상기 사용자에게 디스플레이하는 단계를 더 포함하는 방법.