CN105755162B - 一种对大菱鲆随机群体进行个体育种值评估的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种对大菱鲆随机群体进行个体育种值评估的方法，从而在没有物理系谱的条件下，推算出个体亲缘系数从而进行遗传参数评估。本发明无需记录谱系，而传统选育时，需对选育群体进行物理标记，记录谱系以评价个体间的遗传关系，这项工作耗费大量人力。本发明的方法可以直接利用分子对个体间遗传关系进行评价省去系谱记录环节。而且，本发明的方法对个体间的遗传关系评价更为准确。

Description

一种对大菱鲆随机群体进行个体育种值评估的方法

技术领域

本发明属于海水动物遗传育种技术领域，具体涉及一种对大菱鲆随机群体进行个体育种值评估的方法。

背景技术

大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)是原产于欧洲的底栖海水鱼类，具有生长迅速、耐低温、风味独特、性格温顺、宜于集约化养殖等优点，是欧洲等地的优良海水养殖品种之一。自1999年突破生产性育苗技术以来，大菱鲆养殖产业在我国得到迅速发展，已经成为我国北方沿海重要的鱼类养殖品种。由于我国不是大菱鲆的原产地，养殖生产中长期依赖于欧洲大菱鲆原产国提供、补充种源。同时，由于累代养殖和近亲交配比较严重，国内大菱鲆产业普遍出现了种质退化现象。主要表现为生长速度降低、白化率增高、出苗率降低等现象。良种选育已经成为我国大菱鲆养殖产业可持续发展的重要课题之一。基于完整物理系谱记录的良种选育模式是开展菱鲆良种选育的重要途径之一。完整、准确的系谱信息不仅可以有效指导亲本选留，避免近交衰退；同时利用系谱信息推算出的个体亲缘系数也是用来进行遗传参数评估的重要数据。但是由于大菱鲆性成熟周期长(2-3年)，目前绝大多数良种场亲鱼保有数量有限，更不用说完整的物理系谱记录信息；同时，大菱鲆属于引进物种，群体的遗传背景不清，这也为开展大菱鲆良种选育造成了很大的困难。虽然利用分子标记可以实现系谱重建，但是这种重建是很有限的，比如只能重建到父母本一代，只能推算出父母本的基因型组合，而无法推算出具体的父本、母本的基因型。良种选育过程中，最重要的遗传参数评估就是个体/家系育种值的评估。因此，目前迫切需要一种无需物理系谱记录就能够对家系进行育种值评估的技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种对大菱鲆随机群体进行个体育种值评估的方法，从而在没有物理系谱的条件下，推算出个体亲缘系数从而进行遗传参数评估。

本发明的利用随机群体进行大菱鲆个体育种值评估的方法，包括如下步骤：

1)首先利用要检测的随机群体中来构建大菱鲆家系；

2)个体表型数据采集和基因组DNA提取：

对于所构建家系群体，在12月龄时，挑选体重排名靠前的1000个体，测量体长、体重等表型数据，同时在不影响个体生长的情况下提取DNA；

所述的不影响个体生长的情况下提取DNA，是剪取其鳍条末端组织来提取DNA；

3)微卫星位点基因分型；

利用20个SSR位点进行SSR-PCR扩增，20对引物正相序列5′端分别标记6-FAM，HEX，TAMRA及ROX荧光标记；利用ABI3130型全自动基因分析仪进行20个位点的微卫星位点基因分型；

所述的SSR位点的扩增引物信息如下：

4)数据处理计算

将获得的SSR位点数据按照Coancestry软件的要求输入到软件中处理，得到分型个体两两之间的分子遗传相关度(r_XY)；

再利用R-project软件将得到的分子遗传相关度(r_XY)结果转化为遗传相关矩阵(Numerator Matrix)的形式；再利用R-project软件中matrix程序包的nearPD函数将遗传相关矩阵进行正定(Bending)，使其特征值均大于零，正定后再用is.positive.definite函数验证，获得遗传相关矩阵；将正定过的遗传相关矩阵转化为ASReml软件认可的三列式“.grm”文件。将“.grm”文件连同表型数据文件(记录个体的编号、表型值、固定效应分组)一起输入到ASReml软件，使用AI-REML算法，利用动物模型估计育种值；

y＝Xb+Zu+e

其中y为表型值向量，即研究群体内个体的性状测量值，包括体重、体长等。X和Z分别为b和u的设计矩阵，b,u和e分别为固定效应，随机效应及残差的向；

按照混合方程组(如下)求解动物模型。

其中X’和Z’分别为X和Z矩阵的转置；A^-1是A矩阵的逆矩阵，A矩阵为加性遗传矩阵，即“.grm”文件；和分别是固定效应和随机效应的估计值；

本发明与现有技术相比的有益效果如下：第一，无需记录谱系。传统选育时，需对选育群体进行物理标记，记录谱系以评价个体间的遗传关系，这项工作耗费大量人力。本专利所发明的分子方法可以直接利用分子对个体间遗传关系进行评价省去系谱记录环节。第二，对个体间的遗传关系评价更为准确。大菱鲆繁殖力较高，子代众多，管理及其他不可避免的失误造成的系谱记录错误经常发生。作为引进物种，一代亲本的遗传背景往往不明。这些因素导致系谱推断的遗传相关系数不够准确的。而分子方法不涉及它们的亲本信息，使结果更为准确。第三，更为准确的个体间亲缘关系使得估计育种值更为准确，可进一步加速选育进程。

具体实施方式

本方法用到的软件包括Coancestry、R-project和ASReml。Coancestry是一款根据微卫星分型数据计算个体间亲缘关系的软件。R-project是一种用于统计计算的编程语言，由奥克兰大学的Ross Ihaka和Robert Gentleman发明。如今被广泛地使用于统计分析、数据挖掘等方向。ASReml是由VSN公司开发的拟合线性混合模型的数据分析软件，适合分析大数据和复杂统计模型吗，被广泛的应用于动植物遗传育种学科。

下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1

1)大菱鲆家系构建

2013年初(1月份)对候选大菱鲆亲鱼通过控温控光进行生殖调控。4月末水温适合时，从候选亲鱼中挑选性腺发育成熟，体型完整，体色正常，摄食积极，健康活泼，无伤残，体重2千克以上的个体进行人工受精，构建大菱鲆家系。具体为：受精卵放置在80×60×60cm孵化网箱内充气孵化，海水温度维持在14～15℃，。孵化3天后吸取上浮卵并按照20ml/m²(350粒/ml)的标准，由孵化池移入提前调好水温、盐度、PH及溶解氧的圆形玻璃钢缸中(0.5m²，容积0.5m³)微充气，静水孵化至出苗，各家系均单独培育；按照大菱鲆家系常规养殖方法，最后共培育大菱鲆家系78个。

2)实验个体表型数据采集：

本发明不需要物理系谱信息，但为了将本发明所得到的结果与传统方法相比较，仍然采用了传统的分家系培养，记录了家系信息的方法。待家系个体生长至3月龄时，每个家系挑选挑选体重排名前40的个体作为核心选育群体进行标记并随机分配到三个性状测试池，继续生长到15月龄时对所有个体测量体长、体重数据，记录其所在家系，池号，剪取其鳍条末端组织(类似于取动物的毛发组织，不会对个体造成任何伤害)备个体基因组DNA提取。-75℃低温保存。

3)基因组DNA提取：

基因组DNA提取方法如下：

1、取鳍条50mg放入300μl组织裂解液(100mmol/LTris-HCl pH8.0，50mmol/LEDTApH8.0，0.5％SDS)中，用剪刀破碎组织；

2、加入6μl蛋白酶K(20mg/ml)，56℃水浴至组织溶液澄清透明为止(一般3-4h)，自然冷却组织消化液至室温；

3、加7M醋酸铵100μl，混匀后放置冰上大约5min

4、然后，4℃，12000rmp/min离心约10min；

5、吸取上清液，加300μl预冷异丙醇(-20℃)混匀；

6、混合物20℃放置30min，使DNA充分沉淀析出；

7、12000rmp/min，4℃离心10min；

8、DNA沉淀用70％无水乙醇洗涤2次，自然干燥至产物半透明为止，加适量双蒸水定浓度至50ng/μl。

4)微卫星位点基因分型：选用大菱鲆已经公布的20个SSR位点进行SSR-PCR扩增，位点详细信息见表1，20对引物正相序列5’端分别标记6-FAM，HEX，TAMRA及ROX荧光标记。PCR反应体系包括：总体积25μl，其中基因组DNA2μl(50ng/μl)，TaqDNA聚合酶0.2μl(5U/μl)，10×PCR Buffer 2.5μl，Mg²⁺2μl(2.5mmol/L)，dNTP 2μl(2.5mmol/L),引物各0.5μl(10μmol/L)，ddH₂O15.3μl。PCR扩增条件为：95℃预变性5min后进入25个PCR循环：95℃变性40s，退火1min(各引物的退火温度见表1)，72℃延伸1min，最后于72℃延伸5min，4℃保存。

表1 微卫星引物的基本特征

利用ABI 3130型全自动基因分析仪进行20个位点的微卫星分型。在96孔板的每个加样孔里分别加2μlSSR-PCR扩增产物与8μl内标体系(去离子甲酰胺：GeneScanTM-500LIZSize Standard＝7.9:0.1)充分混合后，95℃变性5min，结束后迅速将96孔板置于冰水混合物中冷却。将处理好的样品置于Applied Biosystems的3130基因分析仪中，进行荧光数据收集和基因分型。最后利用GeneMapper 3.7(Applied Biosystems)准确读取并记录每一个体的各个等位基因峰值。本实施例个体微卫星分型数据见表1。

表1：微卫星个体的分型数据

4)数据处理：

1.微卫星分型数据按照Coancestry软件的要求的格式输入到软件中处理，得到分型个体两两之间的分子遗传相关度(r_XY)。

2.利用R-project软件得到的分子遗传相关度构建成遗传相关矩阵，并利用matrix程序包中nearPD函数对构建矩阵进行正定(Bending)即其特征值均大于零，正定后再用is.positive.definite函数验证。将正定过的遗传相关矩阵转化为ASReml软件认可的三列式“.grm”文件；

3、将“.grm”文件，连同表型数据文件(记录所有个体的编号、体重、体长、池号)及相应的系谱文件一起输入到ASReml软件，使用AI-REML算法，利用动物模型(如下)估计育种值。

y＝Xb+Zu+e

其中y为表型值向量，即表型数据文件当中所有个体的体重体长性状测量值。X和Z分别为b和u的设计矩阵，b,u和e分别为固定效应，个体随机效应及残差的向量。本实施例中固定效应指测试池效应，由表行数据文件提供。

按照Henderson(1959)混合方程组(如下)求解动物模型。

其中X’和Z’分别为X和Z矩阵的转置；A^-1是A矩阵的逆矩阵，A矩阵由“.grm”文件提供；和分别是固定效应和随机效应的估计值；

4.估算的育种值及其标准误从运算完成后生成的.sln结果文件中提取；本实施例个体的育种值见表2。

表2：个体的体重、体长表型值及其育种值表

为了证明本发明方法的有效性，比较了传统系谱法和本发明提供的分子相关法的育种值准确度差异。

1.系谱法遗传力和育种值的估计。对于利用传统系谱法估算育种值的过程，直接将表型数据文件及系谱记录文件导入ASReml软件利用相同动物模型估算育种值即可。系谱法估算的遗传力及育种值也可从运算完成后生成的.pvc和.sln结果文件中提取，系谱法估计得遗传力为0.33±0.15。

2.利用交叉验证(cross-validation)比较系谱与分子相关相在育种值准确度。利用R-project软件将测得的表型数据随机分为均等的10份，其中9份作为训练集(trainingset)，剩下一份作为验证集(validation set)。根据训练集数据，分别利用系谱法和分子相关法在ASReml中用动物模型来预测验证集表型值。根据如下公式来计算育种值准确度

其中表示育种值准确度；表示验证集的预测值与观察值之间的皮尔逊相关度；h²表示根据系谱相关度估算的遗传力。交叉验证重复5000次，对育种值准确度取平均值。结果显示，利用本发明得到的验证集的预测值与观察值之间的平均皮尔逊相关度为0.63，对育种值的估计准确度为0.9214，而传统系谱方法得到的验证集的预测值与观察值之间的平均皮尔逊相关度为0.58，对育种值的估计准确度为0.8513。两者间存在极显著差异(P<0.01)。说明本专利中的方法在育种值估计准确度方面优于传统系谱法。

Claims (3)

1.一种对大菱鲆随机群体进行个体育种值评估的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

1)首先利用要检测的随机群体中来构建大菱鲆家系；

2)个体表型数据采集和基因组DNA提取：

对于所构建家系群体，在12月龄时，挑选体重排名靠前的个体，测量个体表型数据，同时在不影响个体生长的情况下提取DNA；

3)微卫星位点基因分型；

利用20个SSR位点进行SSR-PCR扩增，20对引物正相序列5′端分别标记6-FAM，HEX，TAMRA及ROX荧光标记；利用ABI3130型全自动基因分析仪进行20个位点的微卫星位点基因分型；

4)数据处理计算

将获得的SSR位点数据按照Coancestry软件的要求输入到软件中处理，得到分型个体两两之间的分子遗传相关度r_XY；

再利用R-project软件将得到的分子遗传相关度r_XY结果转化为遗传相关矩阵Numerator Matrix的形式；再利用R-project软件中matrix程序包的nearPD函数将遗传相关矩阵进行正定Bending，使其特征值均大于零，正定后再用is.positive.definite函数验证，获得遗传相关矩阵；将正定过的遗传相关矩阵转化为ASReml软件认可的三列式“.grm”文件；将“.grm”文件连同记录个体的编号、表型值、固定效应分组的表型数据文件一起输入到ASReml软件，使用AI-REML算法，利用动物模型估计育种值；

y＝Xb+Zu+e

其中y为表型值向量，即研究群体内个体的表型数据；X和Z分别为b和u的设计矩阵，b,u和e分别为固定效应，随机效应及残差的向；

按照如下混合方程组求解动物模型；

$\left[\begin{array}{cc}{X}^{\&prime;}X& X^{\&prime;}Z\\ Z^{\&prime;}X& Z^{\&prime;}Z+A^{-1}\mathrm{\&lambda;}\end{array}\right]\left[\begin{array}{c}\hat{b}\\ \hat{a}\end{array}\right]=\left[\begin{array}{c}{X}^{\&prime;}y\\ Z^{\&prime;}y\end{array}\right]$

其中X’和Z’分别为X和Z矩阵的转置；A^-1是A矩阵的逆矩阵，A矩阵为加性遗传矩阵，即“.grm”文件；和分别是固定效应和随机效应的估计值；

$\mathrm{\&lambda;}={\mathrm{\&sigma;}}_e^2/{\mathrm{\&sigma;}}_a^2;$

所述的SSR位点的扩增引物信息如下：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的不影响个体生长的情况下提取DNA，是剪取其鳍条末端组织来提取DNA。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表型数据为体长、体重数据。