CN116515968B - 一种与大白猪和杜洛克猪精液品质性状相关的分子标记及应用 - Google Patents

一种与大白猪和杜洛克猪精液品质性状相关的分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与大白猪和杜洛克猪精液品质性状相关的分子标记及应用。本发明提供了检测SNP位点g.37536832C>A基因型的物质在制备具有如下至少一种功能产品中的应用：1)鉴定或辅助鉴定待测猪的精子活力或品质；2)选育精液品质高或精子活力强的猪；3)选育生育力高的公猪；4)培育繁殖力高的猪品种；5)提高猪群体繁殖力；本发明的分子标记与大白猪和杜洛克猪精子活力显著相关，CC基因型精液的精子活力显著高于CA基因型。根据该遗传标记进行大白猪和杜洛克猪精液品质的评估、种公猪的选育，可有效提高精子活力，加快公猪精液品质的遗传改良速度，缩短世代间隔。

Description

一种与大白猪和杜洛克猪精液品质性状相关的分子标记及 应用
技术领域
本发明属于猪分子标记筛选技术与应用领域，具体涉及一种与大白猪和杜洛克猪精液品质性状相关的分子标记及应用。
背景技术
公猪生育力对养猪业来说至关重要，而精液品质是评价公猪生育力的关键指标，是影响母猪的产仔数、活产仔数以及后代质量的一个重要因素。比起传统育种手段，分子标记辅助选择为种公猪遗传改良和优势选育提供重要依据。
野生型p53诱导的磷酸酶1(WIP1)是一种丝/苏氨酸磷酸酶，由PPM1D基因编码，属于PP2C磷酸酶家族成员。WIP1作为一个原癌基因，在肿瘤发生发展、DNA损伤修复、T细胞和B细胞生长发育、细胞增殖迁移、稳态调节、衰老、代谢性疾病等多个生物学过程中发挥着重要的作用。研究发现WIP1在小鼠所有组织中都有表达，尤其是在睾丸中表达量更高。WIP1敲除雄鼠睾丸通常表现为睾丸结构异常、生殖细胞数量减少，提示WIP1基因可能是影响动物雄性繁殖的关键因子。
WIP1基因在不同动物中功能可能会有差异，猪WIP1基因位于猪的12号染色体上，DNA全长为50559bp，mRNA长为2993bp，共6个外显子，编码605个氨基酸。目前，有关猪WIP1基因的研究报道很少。
发明内容
本发明的目的在于获得一种与大白猪和杜洛克猪精液品质性状精液品质性状相关的遗传标记，并提供一种利用Sequenom MassArray SNP技术检测大白猪和杜洛克猪WIP1基因型的方法。
第一方面，本发明提供了检测SNP位点g.37536832C>A基因型的物质在制备具有如下至少一种功能产品中的应用：
A1)鉴定或辅助鉴定或预测或辅助预测待测猪的精子活力或精液品质；
A2)选育精液品质高或精子活力强的猪；
A3)选育生育力高的公猪；
A4)培育繁殖力高的猪品种；
A5)提高猪群体繁殖力；
所述SNP位点g.37536832C>A为SEQ ID NO：1的第101位。
上述SNP位点基于猪基因组序列信息版本号Sscrofa11.1，位于12号染色体上第37536832位点处。
上文所述应用中，所述SNP位点g.37536832C>A的基因型为CC、AA或CA。
上文所述应用中，所述检测SNP位点g.37536832C>A基因型的物质为B1)或B2)或B3)：
B1)成套引物；
B2)含有所述的成套引物中引物1和引物2的PCR试剂或/和含有所述的成套引物中引物3的PCR试剂；
B3)含有所述成套引物或所述PCR试剂任一或组合的试剂盒；
所述成套引物包括引物1、引物2及引物3；
所述引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；
所述引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO：3；
所述引物3的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
优选的，所述引物1和引物2在对应的PCR试剂中的使用浓度均为0.45～0.55μmol/L；所述引物3在对应的PCR试剂中的使用浓度为0.6～1.3μmol/L。
第二方面，本发明提供了如下任一物质：
C1)第一方面中所述成套引物；
C2)含有第一方面中所述的成套引物中引物1和引物2的PCR试剂或/和含有第一方面中所述的成套引物中引物3的PCR试剂；
C3)含有第一方面中所述成套引物或所述PCR试剂的试剂盒；
C4)SEQ ID NO:1所示的DNA片段。
上文的所述试剂盒还包括PCR扩增所需试剂、延伸反应所需试剂、SAP酶、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱所需试剂或仪器。
第三方面，本发明提供了第一或二方面中所述成套引物、第二方面中所述PCR试剂或所述试剂盒在制备具有如下至少一种功能产品中的应用：
D1)鉴定或辅助鉴定或预测或辅助预测待测猪的精子活力或品质；
D2)选育精液品质高或精子活力强的猪；
D3)选育生育力高的公猪；
D4)培育繁殖力高的猪品种；
D5)提高猪群体繁殖力。
第四方面，本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定或预测或辅助预测待测猪的精子活力或品质的方法，包括如下步骤：检测待测猪精液中SNP位点g.37536832C>A基因型是CC、AA或CA，判断如下：
CC基因型的待测猪精子活力或品质大于或候选大于AA或CA基因型的待测猪。
上文所述方法中，所述检测待测猪精液中SNP位点g.37536832C>A基因型是CC、AA或CA的方法包括如下步骤：
E1)以待测猪的精液基因组为模板，用第一方面中所述引物1和所述引物2进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
E2)用SAP酶消化所述PCR扩增产物，得到消化产物；
E3)以所述消化产物为模板，用第一方面中所述引物3进行延伸反应，得到延伸产物；
E4)采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测所述延伸产物，获得基因型。
第五方面，本发明提供了一种选育精液品质高或精子活力强的猪的方法，为选育第四方面中SNP位点g.37536832C>A基因型是CC的猪，为目的猪；
或一种选育生育力高的公猪的方法，为选育第四方面中SNP位点g.37536832C>A基因型是CC的猪，为目的猪；
或一种培育繁殖力高的猪品种的方法，为选育第四方面中SNP位点g.37536832C>A基因型是CC的猪，为目的猪；
或一种提高猪群体的繁殖力的方法，为选育第四方面中SNP位点g.37536832C>A基因型是CC的公猪进行繁殖，实现提高猪群体的繁殖力。
上文中，所述猪精液品质具体通过精子活力体现。
上文中，所述猪举例为大白猪或杜洛克。
本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的对大白猪和杜洛克公猪相关基因或基因型与大白猪和杜洛克公猪精子活力的关联分析中，提供了一个新的分子标记用于大白猪和杜洛克公猪精液性状的分子标记辅助选择。
本发明的实验证明，本发明提供了与大白猪和杜洛克猪精液品质性状相关的SNP分子标记，该分子标记基于猪基因组序列信息版本号Sscrofa11.1，遗传标记位于12号染色体上第37536832位点上存在C/A碱基突变，与大白猪和杜洛克猪精子活力性状显著相关。另外，本发明通过对大白猪和杜洛克猪精液WIP1基因型进行快速分型即可确定待测大白猪和杜洛克猪的精子活力，提高其精液品质，提高公猪生育力。本发明提供的检测大白猪和杜洛克猪SNP位点基因型的方法，灵敏度、准确性、稳定性好、性价比更高，可对SNP位点实现自动化检测。在大白猪和杜洛克猪生产过程中，可对CC型个体进行选留，从而提高大白猪和杜洛克猪群体的繁殖力，该位点为猪分子育种提供重要的分子标记。
附图说明
图1为利用Sequenom MassArray SNP技术对大白猪和杜洛克猪中WIP1基因g.37536832C>A位点的三种基因型。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
下述实施例中部分试剂及仪器如下：
基因扩增：ABI 9700384 Dual；
质谱点样：MassARRAY NanodispenserRS1000；
质谱分析：MassARRAY Compact System；
所有试剂和仪器均购自北京康普森生物技术有限公司(Beijing CompassBiotechnology Co.,Ltd)。
下述实施例中大白猪和杜洛克猪的精液从猪场和种公猪站获得，也可以获得精液活力。
实施例1、与猪精子活力性状相关的SNP位点的发现及检测其基因型引物与方法的设计
实验材料：158头大白猪的精液
实验发现猪第12号染色体第37536832位点的基因型与猪精子活力相关联。
一、猪精子活力的检测
采用计算机辅助精子分析法检测精液活力，具体如下：精液取出后轻轻混匀，静置于37℃的恒温水浴箱进行液化。待精液完全液化后充分混匀,严格按照仪器操作说明,取精液于37℃预热的精子质量检测系统计数板上，保温2min后开始进行精子活力(精子活力单位为％)检测和分析。158头大白猪的精子活力检测结果如下表1所示。
表1为大白猪精子活力检测结果
二、利用Sequenom MassARRAY SNP技术进行基因分型预测大白猪精子活力性状1.精液基因组DNA的提取
提取158头大白猪精液的基因组DNA，方法如下：
将冷冻的精液置于冰上解冻，按以下步骤提取精液DNA：
(1)精液提取剂的配制：量取0.5mL Tris-Hcl(1M，PH＝8)、1mL EDTA-Na(0.5M，PH＝8)、1mL NaCl(5M)、2mL SDS(10％)、400μL DTT、二硫苏糖醇(1M)、5.5mL ddH2O混合均匀，高压灭菌，室温保存。
(2)将精液从-20℃冰箱拿出后取1mL精液12000rpm离心2min，取100μL样品沉淀于1.5mL离心管。
(3)加入400μL ddH2O，100μL精液提取剂，30μL蛋白酶K，混匀。
(4)放水浴锅中设置温度为60℃过夜消化(12h)，直至样品呈透明状。
(5)加入相同体积Tris饱和酚，颠倒混匀8min，4℃，10000rpm离心7min，吸取上清(约400μL)于新的离心管中；之后再重复一遍。
(6)将比例为Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1的液体等量加入反应，重复上述萃取步骤。
(7)将比例为氯仿：异戊醇＝24：1的液体相同量加入反应，重复上述萃取步骤，吸上清移于新的2mL离心管中。
(8)向上清中加入1/10体积的3M乙酸钠溶液及2倍量的无水乙醇(-20℃预冷)，缓慢颠倒离心管，发现有白色团状DNA析出。轻柔摇晃混匀，使DNA聚集成团，4℃，10000rpm转速下2min，吸取上清丢弃。
(9)配置比例为75％的乙醇(提前放入-20℃)，加入DNA沉淀中反应10min，然后4℃，10000rpm转速下2min，离心吸弃废液，再洗两次。
(10)4℃，12000rpm转速下2min，去掉上清，吸弃管壁多余液体。
(11)开盖自然晾干DNA，等白色沉淀变透明，之后加50μL ddH2O。
(12)DNA的检测：用微量分光光度计和电泳测试DNA质量(主要是浓度和完整性)。电泳检测DNA完整性的具体条件为：琼脂糖凝胶量为0.8％，电压为120V，DNA上样量为100ng，电泳30min。
(13)测完浓度的DNA放于-80℃保存，切勿反复冻融，稀释液可暂放4℃备用。
2.检测引物的设计合成
针对大白猪第12号染色体37536832bp位点(WIP1基因)，基于猪基因组序列信息版本号Sscrofa11.1设计引物组。
PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
ACGTTGGATGGTAGTACTTTCCCCGATGAG(SEQ ID NO：2)
ACGTTGGATGGGTCTGTTCAAGTGATTCCG(SEQ ID NO：3)
CGCCGAAGGACTAAAAT(SEQ ID NO：4)
上述引物由北京康普森生物技术有限公司合成。
3.利用Sequenom MassARRAY SNP技术进行基因分型
检测流程如下：
(1)分别以待测158头大白猪精液的基因组DNA为模板，利用上述正向引物SEQ IDNO：2和反向引物SEQ ID NO：3进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
上述PCR扩增反应使用的反应体系为(5μL)：10ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液(碧云天，D7205)0.5μL，25mmol/L MgCl2 0.4μL，25μmol/L dNTPs0.1μL，正向引物和反向引物的终浓度均为0.5μmol/L，5U/μL Taq DNA聚合酶(碧云天，D7205)反应终浓度为0.025U/μL，去离子水1.8μL；
上述PCR扩增反应的扩增程序为：95℃2min；95℃20s，58℃30s，72℃60s，40个循环；72℃5min；4℃保存。
(2)用SAP酶对上述(1)得到的PCR扩增产物进行消化，得到消化产物；
上述用SAP酶消化的体系为(7μL)：10×SAP Buffer 0.17μL，1.0U/μL SAP Enzyme(Thermo Scientific，EF0654)0.51μL，5μL PCR扩增产物，去离子水1.32μL；
上述用SAP酶消化的反应条件为：37℃40min，85℃5min，4℃保存。
(3)以消化产物为模板，利用延伸引物SEQ ID NO：4进行延伸反应，得到延伸产物；
上述延伸反应体系为(9μL)：10×iplex Buffer Plus 0.2μL，iplexTerminator0.2μL，延伸引物0.94μL(在反应体系中的浓度为1μmol/L)，iplex Enzyme0.041μL，7μL消化产物，去离子水0.619μL；
上述延伸反应的条件为：95℃30s；[95℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，40个循环]；72℃3min；4℃保存。
将延伸产物进行树脂纯化，纯化步骤如下：
将含有9μL上述延伸产物的384孔板2000rpm离心2min，每孔加入16uL水；同时取一个6MG 384孔板，加入纯化树脂(Thermo ScientificTM，87780)压实，使每孔含量均匀，并置于含有9μL上述延伸产物的384孔板上面，敲打6MG 384孔板背面，使树脂落入含有延伸产物的384孔板中，封口膜封好含有树脂和延伸产物的384孔板，2000rpm离心3min,上下颠倒板子，使树脂在水中分散好，充分纯合。之后点样前2000rpm离心3min。
(4)分析延伸产物，从而判定待测猪的WIP1基因型。
将上述(3)得到的上清液移至384孔Spectro CHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用Typer 4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。
经质谱分析得到延伸产物大小为88bp，延伸产物的质谱检测结果如图1所示，可以看出，该方法对大白猪第12号染色体第37536832位点的基因分型效果好。
158头大白猪第12号染色体第37536832位点不同个体基因型结果见表2。
表2为大白猪第12号染色体第37536832位点不同基因型统计原始数据
利用JMP 10.0软件和Excel 2021对第12号染色体第37536832位点在大白猪群体中基因型的分布情况进行了分析和统计，计算该位点在群体中的基因型频率、等位基因频率、多肽信息含量、杂合度和有效等位基因数，并用卡方检验检测该位点在各群体中的平衡状态，结果见表3。
表3为12号染色体第37536832位点在大白猪中的群体遗传学分析
注：P>0.05表示位点在此品种中符合遗传平衡定律。
从表3可知，第12号染色体第37536832位点在大白猪品种中CC基因型占优势，该位点在大白猪中处于中度多态性；卡方检验表明，该位点在该公猪种群中均处于哈代温伯格平衡状态。
利用JMP 10.0软件检验大白猪第12号染色体第37536832位点不同基因型与精子活力进行关联分析，结果如表4所示，可以看出，在大白猪中该位点与精子活力显著关联，CC基因型精液的精子活力显著高于CA基因型或高于AA基因型，该位点可以预测大白猪的精子活力。
表4为大白猪第12号染色体第37536832位点不同基因型与精子活力关联分析
注：对于每一品种同一列中右上角显示不同字母表示差异显著
将猪基因组序列信息版本号Sscrofa11.1，位于12号染色体上第37536832位点(登录号为NC_010454.4)的SNP位点命名为g.37536832C>A位点，该位点为SEQ ID NO:1第101位，该位点的碱基N为C或A,该位点的基因型为CC、AA或CA。
上述结果表明，猪基因组中g.37536832C>A位点的基因型与猪精液的精子活力相关，可以通过检测猪基因组中g.37536832C>A位点的基因型是否为CC，判断或预测或辅助判断或辅助预测该猪精液的精子活力或品质：CC基因型待测猪的精子品质或精子活力高于或候选高于CA或AA基因型待测猪。
上述检测猪基因组中g.37536832C>A位点的基因型是否为CC的方法为如下：
1)以待测猪的精液基因组为模板，用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
2)用SAP酶消化PCR扩增产物，得到消化产物；
3)以消化产物为模板，用SEQ ID NO：4进行延伸反应，得到延伸产物；
4)采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测延伸产物，获得基因型。
实施例2、与猪精子活力性状相关的SNP位点g.37536832C>A的应用
实验材料：276头杜洛克猪的精液
一、猪精子活力的检测
与实施例1的方法相同，276头杜洛克猪的精子活力检测结果如下表5所示。
表5为276头杜洛克猪的精液活力检测结果
二、SNP位点g.37536832C>A在预测杜洛克猪精子活力性状中的应用
1.精液基因组DNA的提取
与实施例1的方法相同，提取276头杜洛克猪精液的基因组DNA。
2.检测引物的设计合成
与实施例1的方法相同。
3.利用Sequenom MassARRAY SNP技术进行基因分型。
与实施例1的方法相同，延伸产物的质谱检测结果也一起在图1中显示，可以看出，该方法对杜洛克猪第12号染色体第37536832位点的基因分型效果好。
276头杜洛克猪g.37536832C>A位点不同基因型分析统计结果如表6所示。
表6为杜洛克猪g.37536832C>A位点不同基因型分析统计结果
利用JMP 10.0软件和Excel 2021对g.37536832C>A位点在杜洛克猪群体中基因型的分布情况进行了分析和统计，计算该位点在群体中的基因型频率、等位基因频率、多肽信息含量、杂合度和有效等位基因数，并用卡方检验检测该位点在各群体中的平衡状态，结果见表7。
表7为g.37536832C>A位点在杜洛克猪中的群体遗传学分析
注：P>0.05表示位点在此品种中符合遗传平衡定律。
从表7可知，g.37536832C>A位点在杜洛克品种中CC基因型占优势，该位点在杜洛克中处于低度多态性；卡方检验表明，该位点在该公猪种群中均处于哈代温伯格平衡状态。
利用JMP 10.0软件检验待测杜洛克猪g.37536832C>A位点不同基因型分析统计结果及不同基因型与精子活力关联分析如表8所示。
表8为杜洛克猪第12号染色体第37536832位点不同基因型与精子活力关联分析
注：对于每一品种同一列中右上角显示不同字母表示差异显著
从表8的结果可以看出，CC基因型精液的精子活力显著高于CA基因型或高于AA基因型，该位点的基因型可以预测杜洛克猪精子活力或品质。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.检测SNP位点g.37536832C>A基因型的物质在制备具有如下至少一种功能产品中的应用：
A1）鉴定或辅助鉴定或预测或辅助预测待测猪的精子活力或精液品质；
A2）选育精液品质高或精子活力强的猪；
A3）选育生育力高的公猪；
A4）培育繁殖力高的猪品种；
A5）提高猪群体繁殖力；
所述SNP位点g.37536832C>A为SEQ ID NO：1的第101位；
所述猪为大白猪或杜洛克猪。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述SNP位点g.37536832C>A的基因型为CC、AA或CA。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述检测SNP位点g.37536832C>A基因型的物质为B1）或B2）或B3）：
B1）成套引物；
B2）含有所述成套引物中引物1和引物2的PCR试剂和含有所述的成套引物中引物3的PCR试剂；
B3）含有所述成套引物试剂盒；
或含有包含所述引物1和所述引物2的PCR试剂和包含所述引物3的PCR试剂的试剂盒；
所述成套引物包括引物1、引物2及引物3；
所述引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；
所述引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO：3；
所述引物3的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
4.权利要求3中所述成套引物在制备具有如下至少一种功能产品中的应用：
D1）鉴定或辅助鉴定或预测或辅助预测待测猪的精子活力或品质；
D2）选育精液品质高或精子活力强的猪；
D3）选育生育力高的公猪；
D4）培育繁殖力高的猪品种；
D5）提高猪群体繁殖力；
所述猪为大白猪或杜洛克猪。
5.一种鉴定或辅助鉴定或预测或辅助预测待测猪的精子活力或品质的方法，包括如下步骤：检测待测猪精液中SNP位点g.37536832C>A基因型是CC、AA或CA，判断如下：
CC基因型的待测猪精子活力或品质大于或候选大于AA或CA基因型的待测猪；
所述猪为大白猪或杜洛克猪；
所述SNP位点g.37536832C>A为SEQ ID NO：1的第101位。
6.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于：
所述检测待测猪精液中SNP位点g.37536832C>A基因型是CC、AA或CA的方法包括如下步骤：
E1）以待测猪的精液基因组为模板，用权利要求3中所述引物1和所述引物2进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
E2）用SAP酶消化所述PCR扩增产物，得到消化产物；
E3）以所述消化产物为模板，用权利要求3中所述引物3进行延伸反应，得到延伸产物；
E4）采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测所述延伸产物，获得基因型。
7.一种选育精液品质高或精子活力强的猪的方法，为选育权利要求5或6中SNP位点g.37536832C>A基因型是CC的猪，为目的猪；
所述猪为大白猪或杜洛克猪；
所述SNP位点g.37536832C>A为SEQ ID NO：1的第101位。
8.一种选育生育力高的公猪的方法，为选育权利要求5或6中SNP位点g.37536832C>A基因型是CC的猪，为目的猪；
所述猪为大白猪或杜洛克猪；
所述SNP位点g.37536832C>A为SEQ ID NO：1的第101位。
9.一种培育繁殖力高的猪品种的方法，为选育权利要求5或6中SNP位点g.37536832C>A基因型是CC的猪，为目的猪；
所述猪为大白猪或杜洛克猪；
所述SNP位点g.37536832C>A为SEQ ID NO：1的第101位。
10.一种提高猪群体的繁殖力的方法，为选育权利要求5或6中SNP位点g.37536832C>A基因型是CC的公猪进行繁殖，实现提高猪群体的繁殖力；
所述猪为大白猪或杜洛克猪；
所述SNP位点g.37536832C>A为SEQ ID NO：1的第101位。
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