CN117660639A

CN117660639A - 检测分子标志物甲基化水平的试剂及尿路上皮癌检测试剂盒

Info

Publication number: CN117660639A
Application number: CN202211619114.5A
Authority: CN
Inventors: 蔡迪; 张良禄; 董兰兰; 陈艾敏; 廖旦旦
Original assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-14
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2024-03-08
Also published as: WO2024125308A1

Abstract

本申请涉及检测分子标志物甲基化水平的试剂及尿路上皮癌的检测试剂盒，通过检测受试者样本中6个分子标志物甲基化水平的改化，可以有效区分癌症患者和非癌患者，可用于诊断尿路上皮癌，具有高的灵敏度和特异性。

Description

检测分子标志物甲基化水平的试剂及尿路上皮癌检测试剂盒

技术领域

本申请涉及分子生物学领域，特别是涉及检测分子标志物甲基化水平的试剂及尿路上皮癌检测试剂盒。

背景技术

尿路上皮癌(Urothelial carcinoma,UC)是起源于尿路上皮的一类多源性恶性肿瘤，包括肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌以及尿道癌，是最常见的泌尿系统肿瘤，其中，膀胱癌占到全部尿路上皮癌的90％以上，仅约5％～10％的病例为上尿路尿路上皮癌。上尿路尿路上皮癌中有约8％-13％的病例同时合并膀胱尿路上皮癌。据统计，在2018年，全球约有55万新增的膀胱尿路上皮癌患者，约有20万的死亡病例。约有25％的患者在初次确诊膀胱癌时被诊断为肌层浸润性癌或转移性癌，另外约有30％～40％的非肌层浸润性膀胱癌会逐渐侵袭膀胱肌壁而进展为肌层浸润性癌，从而导致较差的预后和较高的死亡率，如肌层浸润性膀胱癌患者的5年生存率约为30％～50％。

目前临床上常用的诊断膀胱癌的方法包括：膀胱镜、尿液脱落细胞学、荧光原位杂交(FISH)及影像学等。膀胱镜及病理活检是诊断膀胱癌的金标准，但是其作为侵入性检查存在尿道穿孔、尿道感染等风险，导致患者的接受度较低。尿液脱落细胞学检查和荧光原位杂交法为非侵入性操作，且其诊断膀胱癌的特异性较好，但是这两种方法对于早期非肌层浸润性癌的诊断灵敏度较低。影像学如CT同为非侵入性检测方法，但是其具有一定的放射性，不适宜用于大规模筛查。因而，目前急需非侵入性的、便捷的、高灵敏度的诊断膀胱癌及上尿路尿路上皮癌的方法。

DNA的甲基化是人类基因组的一种表观修饰模式，据报导，异常的DNA甲基化通过调节基因组的转录水平而与癌症和其它疾病相关。例如，在高度重复的DNA序列中，低甲基化会导致染色体不稳定，从而激活癌基因；而基因启动子区域的高甲基化则会导致一些肿瘤抑制基因的转录沉默。已经有证据表明异常的DNA甲基化是膀胱癌的主要特征，其在膀胱肿瘤的发生和发展中都发挥了重要作用，这种甲基化模式的改变是稳定存在的且易于在血液等体液样本中检测。因此，可使用这些发生异常甲基化的基因作为膀胱癌早期诊断和预后的生物标志物。

发明内容

基于此，有必要提供一种检测分子标志物的甲基化水平的试剂及其在制备尿路上皮癌的检测产品中的应用，该产品对极早期和早期癌的诊断具有高的灵敏度和特异性。

具体技术方案如下：

一种检测分子标志物的甲基化水平的试剂，所述分子标志物包括如下定义的BM1、BM2、BM3、BM4、BM5和BM6中的至少一个：

以GRCh38.p14为参考基因组，所述BM1为Chr10:101140226-101140445的全长或部分区域、所述BM2为Chr10:116271316-116271587的全长或部分区域、所述BM3为Chr13:27929099-27929475的全长或部分区域、所述BM4为Chr6:27495249-27495644的全长或部分区域、所述BM5为Chr7:19118066-19118518的全长或部分区域、所述BM6为Chr10:17229173-17229587的全长或部分区域。

在其中一个实施例中，所述BM1包括如下定义的BM1-1、BM1-2、BM1-3、BM1-4、BM1-5和BM1-6中的至少一个，所述BM1-1为Chr10:101140255-101140395正链，所述BM1-2为Chr10:101140325-101140440正链，所述BM1-3为Chr10:101140237-101140445正链，所述BM1-4为Chr10:101140400-101140234负链，所述BM1-5为Chr10:101140385-101140254负链，所述BM1-6为Chr10:101140374-101140226负链；所述BM2包括如下定义的BM2-1、BM2-2和BM2-3中的至少一个，所述BM2-1为Chr10:116271316-116271435正链，所述BM2-2为Chr10:116271441-116271537正链，所述BM2-3为Chr10:116271440-116271587正链；所述BM3包括如下定义的BM3-1、BM3-2、BM3-3和BM3-4中的至少一个，所述BM3-1为Chr13:27929099-27929205正链，所述BM3-2为Chr13:27929219-27929389正链，所述BM3-3为Chr13:27929475-27929301负链，所述BM3-4为Chr13:27929259-27929146负链；所述BM4包括如下定义的BM4-1、BM4-2、BM4-3、BM4-4和BM4-5中的至少一个，所述BM4-1为Chr6:27495249-27495413正链，所述BM4-2为Chr6:27495394-27495503正链，所述BM4-3为Chr6:27495524-27495644正链，所述BM4-4为Chr6:27495603-27495461负链，所述BM4-5为Chr6:27495445-27495376负链；所述BM5包括如下定义的BM5-1、BM5-2和BM5-3中的至少一个，所述BM5-1为Chr7:19118066-19118214正链，所述BM5-2为Chr7:19118242-19118334正链，所述BM5-3为Chr7:19118399-19118518正链；和/或，所述BM6包括如下定义的BM6-1、BM6-2、BM6-3、BM6-4、BM6-4和BM6-6中的至少一个，所述BM6-1为Chr10:17229173-17229323正链，所述BM6-2为Chr10:17229290-17229401正链，所述BM6-3为Chr10:17229424-17229571正链，所述BM6-4为Chr10:17229587-17229450负链，所述BM6-5为Chr10:17229437-17229291负链，所述BM6-6为Chr10:17229305-17229173负链。

在其中一个实施例中，所述分子标志物包括所述BM1、BM4和BM6中至少任意两者。

在其中一个实施例中，所述试剂包括能检测所述分子标志物的甲基化水平的引物对和/或探针。

在其中一个实施例中，所述试剂包括检测所述BM1甲基化水平的引物对，所述引物对包括SEQ IDNO.19～20所示的引物对、SEQ ID NO.22～23所示的引物对、SEQ ID NO.25～26所示的引物对、SEQ IDNO.28～29所示的引物对、SEQ ID NO.31～32所示的引物对、或SEQID NO.34～35所示的引物对中至少一组；所述试剂包括检测所述BM2的引物对，所述引物对包括SEQ ID NO.37～38所示的引物对、SEQ IDNO.40～41所示的引物对、或SEQ ID NO.43～44所示的引物对中至少一组；所述试剂包括检测所述BM3的引物对，所述引物对包括SEQ IDNO.46～47所示的引物对、SEQ ID NO.49～50所示的引物对、SEQ IDNO.52～53所示的引物对、或SEQ ID NO.55～56所示的引物对中至少一组；所述试剂包括检测所述BM4的引物对，所述引物对包括SEQ ID NO.58～59所示的引物对、SEQ ID NO.61～62所示的引物对、SEQIDNO.64～65所示的引物对、SEQ ID NO.67～68所示的引物对、或SEQ ID NO.70～71所示的引物对中至少一组；所述试剂包括检测所述BM5的引物对，所述引物对包括SEQ ID NO.73～74所示的引物对、SEQ IDNO.76～77所示的引物对、或SEQ ID NO.79～80所示的引物对中至少一组；和/或，所述试剂包括检测所述BM6的引物对，所述引物对包括SEQ ID NO.82～83所示的引物对、SEQ ID NO.85～86所示的引物对、SEQ ID NO.88～89所示的引物对、SEQ IDNO.91～92所示的引物对、SEQ ID NO.94～95所示的引物对、或SEQ IDNO.97～98所示的引物对中至少一组。

在其中一个实施例中，所述试剂包括检测所述BM1甲基化水平的探针，所述探针包括SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.33、或SEQ IDNO.36所示探针中至少一者；所述试剂包括检测所述BM2甲基化水平的探针，所述探针包括SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.42、或SEQ IDNO.45所示探针中至少一者；所述试剂包括检测所述BM3甲基化水平的探针，所述探针包括SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.54、或SEQ ID NO.57所示探针中至少一者；所述试剂包括检测所述BM4甲基化水平的探针，所述探针包括SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.69、或SEQ ID NO.72所示探针中至少一者；所述试剂包括检测所述BM5甲基化水平的探针，所述探针包括SEQIDNO.75、SEQ ID NO.78、或SEQ ID NO.81所示探针中至少一者；和/或，所述试剂包括检测所述BM6甲基化水平的探针，所述探针包括SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.96、或SEQ ID NO.99中的至少一者。

上述的试剂在制备尿路上皮癌检测产品中的应用。

在其中一个实施例中，所述尿路上皮癌包括膀胱癌和/或上尿路尿路上皮癌；可选地，所述上尿路尿路上皮癌包括输尿管癌和肾盂癌。

一种诊断尿路上皮癌的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述任一项所述的试剂。

在其中一个实施例中，所述检测试剂盒还包括DNA亚硫酸氢盐转化试剂、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、PCR扩增试剂和质控试剂中至少一种。可选地，所述检测试剂盒还包括样本采样装置。

相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：

本申请通过检测受试者样本中6个分子标志物甲基化水平的改化，可以有效区分膀胱癌患者和非膀胱癌患者。进一步，检测标志物组合的甲基化水平，其诊断膀胱癌、输尿管癌和肾盂癌的灵敏度更高，且特异性无明显下降。当以标志物的组合作为目标区域时，其对于极早期和早期尿路上皮癌也有较高的检出率，更有利于尿路上皮癌的早期诊断和早期治疗，可以提高患者的生存率和生活质量，为患者带来福音。

附图说明

图1BM1-1诊断膀胱癌患者和健康人尿液样本的ROC曲线；

图2BM2-2诊断胱癌患者和健康人尿液样本的ROC曲线；

图3BM3-4诊断胱癌患者和健康人尿液样本的ROC曲线；

图4BM4-5诊断胱癌患者和健康人尿液样本的ROC曲线；

图5BM5-2诊断胱癌患者和健康人尿液样本的ROC曲线；

图6BM6-1诊断胱癌患者和健康人尿液样本的ROC曲线。

具体实施方式

为了便于理解本申请，下面将对本申请进行更全面的描述。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本申请公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

术语解释

术语“和/或”均是指包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语“多个”指两个以上；“多种”指两种以上；“以上”与数字结合表示数量时包括本数，例如“两个以上”包括两个。

术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。

术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。

术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100％，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。

术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。

术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38)，则表明目标序列是甲基化的。

术语“甲基化特异性荧光定量PCR(q-MSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是q-MSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在q-MSP反应系统中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，q-MSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。

术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。

术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地，其是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是诊断测试的不同可能切割点的真阳性率相比于假阳性率的图。其取决于所选择切割点的灵敏度与特异性之间的权衡(灵敏度的任何增加将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大越好；最佳值是1；随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线，面积为0.5)。

发明人在研究的过程中，发现6个DNA区域可以作为诊断尿路上皮癌的分子标志物，通过检测受试者组织样本和尿液样本中上述6个分子标志物甲基化水平的改变，可以有效区分膀胱癌患者和健康人。其检测的灵敏度和特异性都较高。当同时检测BM1、BM4和BM6中的任意两个标志物组合的甲基化水平时，其诊断膀胱癌、输尿管癌和肾盂癌的灵敏度更高，且特异性无明显下降。当以BM1、BM4和BM6中的任意两个标志物的组合作为目标区域时，其对于极早期和早期尿路上皮癌也有较高的检出率，更有利于尿路上皮癌的早期诊断和早期治疗。

首先，本申请一实施方式提供了一种检测分子标志物的甲基化水平的试剂，分子标志物包括如下定义的BM1、BM2、BM3、BM4、BM5和BM6中的至少一个：

BM1为Chr10:101140226-101140445的全长或部分区域、BM2为Chr10:116271316-116271587的全长或部分区域、BM3为Chr13:27929099-27929475的全长或部分区域、BM4为Chr6:27495249-27495644的全长或部分区域、BM5为Chr7:19118066-19118518的全长或部分区域、BM6为Chr10:17229173-17229587的全长或部分区域。

需要说明的是，在本文中，如未特殊说明，染色体上的位置均是以GRCh38.p14为参考；此外，因为染色体上的DNA是由正链和负链组成的双链结构，对于用染色体位置表示的区域，如果未指明是DNA的正链还是负链，则表示既可以是该区域的DNA的正链，也可以是该区域的DNA的负链，还可以是该区域的DNA的正负两条链。如BM1为Chr10:101140226-101140445，则表示BM1可以是Chr10:101140226-101140445区域内的DNA正链，也可以是Chr10:101140226-101140445区域内的DNA负链，还可以是Chr10:101140226-101140445区域内的DNA正、负两条链。

BM1的部分区域包括物理位置位于Chr10:101140226-101140445之间的DNA片段。在一个具体示例中，BM1包括如下定义的BM1-1、BM1-2、BM1-3、BM1-4、BM1-5和BM1-6中的至少一个。BM1-1为Chr10:101140255-101140395正链，BM1-2为Chr10:101140325-101140440正链，BM1-3为Chr10:101140237-101140445正链，BM1-4为Chr10:101140400-101140234负链，BM1-5为Chr10:101140385-101140254负链，BM1-6为Chr10:101140374-101140226负链。可以理解的是，BM1的部分区域还包括其它未列举的位于Chr10:101140226-101140445之间的DNA片段。

BM2的部分区域包括物理位置位于Chr10:116271316-116271587之间的DNA片段。在一个具体示例中，BM2包括如下定义的BM2-1、BM2-2和BM2-3中的至少一个，BM2-1为Chr10:116271316-116271435正链，BM2-2为Chr10:116271441-116271537正链，BM2-3为Chr10:116271440-116271587正链。可以理解的是，BM2的部分区域还包括其它未列举的位于Chr10:116271316-116271587之间的DNA片段。

BM3的部分区域包括物理位置为Chr13:27929099-27929475之间的DNA片段。在一个具体示例中，BM3包括如下定义的BM3-1、BM3-2、BM3-3和BM3-4中的至少一个，BM3-1为Chr13:27929099-27929205正链，BM3-2为Chr13:27929219-27929389正链，BM3-3为Chr13:27929475-27929301负链，BM3-4为Chr13:27929259-27929146负链。可以理解的是，BM3的部分区域还包括其它未列举的位于Chr13:27929099-27929475之间的DNA片段。

BM4的部分区域包括物理位置为Chr6:27495249-27495644之间的DNA片段。在一个具体示例中，BM4包括如下定义的BM4-1、BM4-2、BM4-3、BM4-4和BM4-5中的至少一个，BM4-1为Chr6:27495249-27495413正链，BM4-2为Chr6:27495394-27495503正链，BM4-3为Chr6:27495524-27495644正链，BM4-4为Chr6:27495603-27495461负链，BM4-5为Chr6:27495445-27495376负链。可以理解的是，BM4的部分区域还包括其它未列举的位于Chr6:27495249-27495644之间的DNA片段。

BM5的部分区域包括物理位置为Chr7:19118066-19118518之间的DNA片段。在一个具体示例中，BM5包括如下定义的BM5-1、BM5-2和BM5-3中的至少一个，BM5-1为Chr7:19118066-19118214正链，BM5-2为Chr7:19118242-19118334正链，BM5-3为Chr7:19118399-19118518正链。可以理解的是，BM5的部分区域还包括其它未列举的位于Chr7:19118066-19118518之间的DNA片段。

BM6的部分区域包括物理位置为Chr10:17229173-17229587之间的DNA片段。在一个具体示例中，BM6包括如下定义的BM6-1、BM6-2、BM6-3、BM6-4、BM6-4和BM6-6中的至少一个，BM6-1为Chr10:17229173-17229323正链，BM6-2为Chr10:17229290-17229401正链，BM6-3为Chr10:17229424-17229571正链，BM6-4为Chr10:17229587-17229450负链，BM6-5为Chr10:17229437-17229291负链和BM6-6为Chr10:17229305-17229173负链。可以理解的是，BM6的部分区域还包括其它未列举的位于Chr10:17229173-17229587之间的DNA片段。

在一个具体示例中，分子标志物包括BM1、BM2、BM3、BM4、BM5或BM6的部分区域中的至少一个区域。

在一个具体示例中，分子标志物包括部分区域BM1-1、BM1-2、BM1-3、BM1-4、BM1-5、BM1-6、BM2-1、BM2-2、BM2-3、BM3-1、BM3-2、BM3-3、BM3-4、BM4-1、BM4-2、BM4-3、BM4-4、BM4-5、BM5-1、BM5-2、BM5-3、BM6-1、BM6-2、BM6-3、BM6-4、BM6-4和BM6-6中的至少一者。

在一个具体示例中，分子标志物包括BM1、BM4和BM6中至少任意两者。

在一个具体示例中，分子标志物包括BM1、BM4和BM6中任意两个分子标志物的部分区域的组合。

在一个具体示例中，分子标志物包括部分区域BM1-1、BM4-5和BM6-1中任意两者的组合。检测上述任意两个分子标志物的甲基化水平在诊断不同临床分期、不同浸润状态或不同病理分级的患者中具有高的灵敏度，且特异性无明显下降。对早期非肌层浸润性癌的具有极高的诊断价值。

在一个具体示例中，该试剂可通过如下方法中的一种或几种实现对分子标志物的甲基化检测：甲基化特异性PCR、甲基化特异性荧光定量PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法。

在一个具体示例中，该试剂包括能检测上述分子标志物的甲基化水平的引物对和/或探针。

需要说明的，探针可为TaqMan探针，标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

在一个具体示例中，探针5’端标记有荧光报告基团FAM或ROX或VIC，3’端标记有荧光猝灭基团为MGB或BHQ-1。可以理解的是，探针上连接的荧光基团不限于上述，还可以是其他荧光基团。

在一个具体示例中，试剂包括检测BM1甲基化水平的引物对，引物对包括SEQ IDNO.19～20所示的引物对、SEQ ID NO.22～23所示的引物对、SEQ ID NO.25～26所示的引物对、SEQ ID NO.28～29所示的引物对、SEQ ID NO.31～32所示的引物对、或SEQ ID NO.34～35所示的引物对中至少一组；试剂包括检测BM2的引物对，引物对包括SEQ ID NO.37～38所示的引物对、SEQ ID NO.40～41所示的引物对、或SEQ IDNO.43～44所示的引物对中至少一组；试剂包括检测BM3的引物对，引物对包括SEQ ID NO.46～47所示的引物对、SEQ IDNO.49～50所示的引物对、SEQ ID NO.52～53所示的引物对、或SEQ ID NO.55～56所示的引物对中至少一组；试剂包括检测BM4的引物对，引物对包括SEQ ID NO.58～59所示的引物对、SEQ IDNO.61～62所示的引物对、SEQ ID NO.64～65所示的引物对、SEQ ID NO.67～68所示的引物对、或SEQ IDNO.70～71所示的引物对中至少一组；试剂包括检测BM5的引物对，引物对包括SEQ ID NO.73～74所示的引物对、SEQ ID NO.76～77所示的引物对、或SEQ IDNO.79～80所示的引物对中至少一组；和/或，试剂包括检测BM6的引物对，引物对包括SEQID NO.82～83所示的引物对、SEQ ID NO.85～86所示的引物对、SEQ ID NO.88～89所示的引物对、SEQ ID NO.91～92所示的引物对、SEQ ID NO.94～95所示的引物对、或SEQ IDNO.97～98所示的引物对中至少一组。

在另一个具体示例中，引物对选自与上述序列至少80％(例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的引物。

在一个具体示例中，试剂包括检测BM1甲基化水平的探针，探针包括SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.33、或SEQ ID NO.36所示探针中至少一者；试剂包括检测BM2甲基化水平的探针，探针包括SEQ ID NO.39、SEQ IDNO.42、或SEQ ID NO.45所示探针中至少一者；试剂包括检测BM3甲基化水平的探针，探针包括SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.54、或SEQ ID NO.57所示探针中至少一者；试剂包括检测BM4甲基化水平的探针，探针包括SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.69、或SEQ ID NO.72所示探针中至少一者；试剂包括检测BM5甲基化水平的探针，探针包括SEQ ID NO.75、SEQ ID NO.78、或SEQ ID NO.81所示探针中至少一者；和/或试剂包括检测BM6甲基化水平的探针，探针包括SEQ ID NO.84、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.96、或SEQ ID NO.99中的至少一者。

在另一个具体示例中，探针可选自与上述序列至少80％(例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性的探针。

上述试剂在制备尿路上皮癌检测产品中的应用。

在一个具体示例中，尿路上皮癌包括膀胱癌和/或上尿路尿路上皮癌。可选地，上尿路尿路上皮癌包括输尿管癌和肾盂癌。

进一步地，本申请一实施方式提供了一种诊断尿路上皮癌的检测试剂盒，该检测试剂盒包括上述任一项的试剂。

在一个具体示例中，诊断包括辅助诊断和/或早期诊断。

在一个具体示例中，诊断尿路上皮癌可以包括诊断膀胱癌、诊断输尿管癌和诊断肾盂癌中至少一种。

在一个具体示例中，检测试剂盒还包括DNA亚硫酸氢盐转化试剂、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、PCR扩增试剂和质控试剂中至少一种。可选地，检测试剂盒还包括样本采样装置。

在一个具体示例中，检测试剂盒的检测样本可以来自血液(包括全血、血浆、血清)、组织、细胞、尿液等。当检测样本为尿液时，该检测试剂盒可适用于无创检测，减少患者采样痛苦，提升试剂盒的普及率。

本申请提供的检测试剂盒适用于尿路上皮癌如膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌的诊断或辅助诊断，可用于不同临床分期的患者，对极早期和早期癌有显著的诊断效果。同时，该试剂盒对不同病理分级的患者(包括癌前病变)和不同浸润程度的患者(包括非浸润性癌)的诊断都具有很高的灵敏度。

具体实施例

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

实施例1检测方法的建立

利用甲基化特异性荧光定量PCR法(qMSP)检测受试者组织或尿液样本中6个分子标志物的甲基化水平，进而来区分尿路上皮癌患者和健康人。该方法需要对所述6个分子标志物分别设计甲基化检测引物对和对应的检测探针。以GRCh38.p14为参考基因组，6个分子标志物BM1～BM6的DNA序列、经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列及其对应的位置如表1所示。

表1目标区域的位置及核苷酸序列

将SEQ ID NO.7～18所示的序列分别人工合成，并分别构建至pUC18质粒载体上，作为qPCR扩增过程中的甲基化模板和非甲基化模板备用。分别以表1中SEQ ID NO.7～12为模板，设计多对甲基化检测引物对并人工合成，用于甲基化特异性荧光定量PCR反应。考虑到qPCR的扩增效率，每个扩增子的长度不超过200bp。随后，以所述含甲基化目标区域和非甲基化目标区域的质粒为模板，使用SYBR荧光定量PCR体系分析针对每个分子标志物的每对甲基化检测引物的性能，要求扩增曲线具有明显的指数增长期，扩增效率在95％～105％的范围内，且无非特异性扩增。非特异性扩增是指在一个PCR扩增体系中，当同时加入一个分子标志物的甲基化的质粒模板和非甲基化的质粒模板时，要求①甲基化检测引物对仅扩增甲基化的质粒，不扩增非甲基化的质粒，②甲基化检测引物对仅扩增扩增子对应的目标区域，不会扩增其它非目标区域。得到满足上述条件的甲基化检测引物对以后，对每对引物设计相应的检测探针，检测探针均为TaqMan探针，探针5’端为荧光基团，探针3’端为荧光淬灭基团，要求检测引物对与检测探针之间、检测探针与目标区域之间无非特异性结合。最后在荧光定量PCR体系中验证甲基化检测引物对和检测探针联用的效果，保留具有指数扩增期的引物对和探针作为最终的检测试剂。通过上述方法，最终筛选得到可检测BM1的甲基化检测引物对和检测探针6对，其检测的目标区域分别命名为BM1-1～BM1-6；得到可检测BM2的甲基化检测引物对和检测探针3对，其检测的目标区域分别命名为BM2-1～BM2-3；得到可检测BM3的甲基化检测引物对和检测探针4对，其检测的目标区域分别命名为BM3-1～BM3-4；得到可检测BM4的甲基化检测引物对和检测探针5对，其检测的目标区域分别命名为BM4-1～BM4-5；得到可检测BM5的甲基化检测引物对和检测探针3对，其检测的目标区域分别命名为BM5-1～BM5-3；得到可检测BM6的甲基化检测引物对和检测探针6对，其检测的目标区域分别命名为BM6-1～BM6-6。用于检测BM1～BM6的甲基化检测引物对和检测探针的序列如表2所示，每对甲基化检测引物对和检测探针可识别的甲基化的胞嘧啶位点如表3所示，每对甲基化检测引物对扩增的目标区域及其对应的原始DNA序列如表4所示。

表2甲基化检测引物对及探针的核苷酸序列

/>

表3检测引物对和探针可识别的甲基化的胞嘧啶位点

/>

表4扩增子及其对应的未转化的DNA序列

/>

确定了各个分子标志物特异性的甲基化检测引物对和探针以后，即可开展荧光定量PCR实验分析待测样本中各个目标区域的甲基化水平。qPCR反应的模板为从待测样本中提取的且经亚硫酸氢盐转化的核酸分子，可以为基因组DNA，也可以为游离的无细胞DNA。根据检测的目标区域，在PCR反应体系中加入目标区域特异的甲基化检测引物对和探针，若在一个PCR反应中同时检测大于1个的目标区域，则需同时加入多个目标区域对应的检测引物对和探针。此外，在每个PCR反应体系中，还需加入内参基因ACTB的检测引物对和探针，用以对ACTB定量从而可以监测样本质量和对结果进行判读。本发明中用到的扩增ACTB基因片段的上游引物序列为：5’-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3’SEQ ID NO.154，下游引物序列为：5’-AATAACACCCCCACCCTGC-3’SEQ ID NO.155，与之对应的检测探针序列为：5’-GGAGTGGTTTTTGGGTTTG-3’SEQ ID NO.156，该检测探针的5’端荧光基团为VIC，3’端荧光淬灭基团为BHQ1。若在每个PCR体系中仅检测一个目标区域的甲基化水平，则目标区域检测探针5’端荧光基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为MGB；若在每个PCR反应体系中同时检测2个或3个目标区域的甲基化水平，则针对各个目标区域的检测探针5’端荧光基团是不同的，如分别为FAM、ROX和CY5中的2种或3种，而所述检测探针3’端荧光淬灭基团则可以是相同的，如同为MGB。PCR反应体系中用到的DNA聚合酶及缓冲液等成分均购自Invitrogen(Cat:14966005)。

在检测待测样本中目标区域的甲基化水平时，需要同时设置质控实验，即需要设置阳性对照PCR管和阴性对照PCR管。阳性对照PCR管的设置：其配置体系与实验管相同，但是模板为10³拷贝/微升的含转化后目标区域的质粒和10³拷贝/微升的含转化后ACTB基因的质粒等体积混合而成。阴性对照PCR管的设置：其配置体系与实验管相同，但是模板为超纯水。qPCR反应结束后，调整基线，并设置阈值，阈值必须位于指数扩增期内，穿越阈值与X轴平行的直线称为阈值线，阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。分析qPCR反应的结果，要求①阴性对照PCR管无扩增(即不起线)；②阳性对照PCR管有明显的指数增长期，且阳性对照PCR管目标基因的Ct值在26～30之间；③待测样本的内参基因的Ct值小于等于33。若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求，则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读，否则，当次实验无效，必须重新进行检测。

实施例2利用qMSP法检测组织样本中目标区域的甲基化水平进而诊断膀胱癌的效果

1.样本收集

收集98例经病理组织检测确诊为膀胱癌患者的癌组织样本和对应的98例癌旁组织样本，所有的样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有组织样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有组织样本均采用匿名化处理。

2.样本DNA提取

使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本的DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。

3.样本DNA的转化和纯化

使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)对样本DNA进行转化和纯化，具体操作步骤见试剂盒说明书。

4.qMSP反应

以经历转化和纯化的样本DNA为模板，分别使用表2中提供的检测引物对和探针进行甲基化荧光定量PCR反应来扩增各个子目标区域。具体地，按照实施例1提供的方法配置实验PCR管、阳性对照和阴性对照PCR管以后，按照表5提供的配方配置PCR扩增体系，按照表6提供的程序进行PCR扩增。

表5qPCR反应体系

组分	规格	体积(μL)
			Platinum II PCR缓冲液	5×	5
dNTPs	各2.5mM	3
			目标区域上游引物	10μM	0.5
目标区域下游引物	10μM	0.5
			目标区域检测探针	10μM	0.5
ACTB基因上游引物	10μM	0.5
			ACTB基因下游引物	10μM	0.5
ACTB基因检测探针	10μM	0.5
			DNA聚合酶	/	0.5
待测样本DNA	/	5
			纯化水	/	补至25

表6qPCR反应程序

5.结果判读

若阳性对照管、阴性对照管和实验管的内参基因均满足实施例1中质量控制的要求，则进行结果判读。对于组织样本，若其在某一目标区域的Ct值≤38，认为该样本在此区域为甲基化阳性，该样本为膀胱癌阳性样本；若待测样本在某一目标区域的Ct值>38，认为该样本在此区域为甲基化阴性，该样本为膀胱癌阴性样本。通过分子标志物BM1-1～BM6-6的甲基化水平诊断膀胱癌组织样本的灵敏度和特异性如表7所示。其中灵敏度为组织病理检测为阳性的样本中该方法判定为阳性的比例，特异性为组织病理检测为阴性的样本中该方法判定为阴性的比例。

表7qMSP法诊断膀胱癌组织样本的性能

由表7可以看出，分子标志物BM1～BM6诊断膀胱癌组织样本的性能优异，且对于每个分子标志物来说，其DNA区域内的各个部分区域诊断膀胱癌的性能类似，如BM1-1、BM1-2、BM1-3、BM1-4、BM1-5和BM1-6的诊断效果之间没有很大的差异。另外，分子标志物BM1～BM6检测膀胱癌组织样本的灵敏度均较高，其中BM1、BM2、BM4和BM6检测膀胱癌组织样本的灵敏度略高于BM3和BM5，而BM4和BM6检测癌旁正常组织的特异性略高于BM1、BM2、BM3和BM5。

实施例3利用qMSP法检测尿液样本中目标区域的甲基化水平进而诊断膀胱癌的效果

1.样本收集

收集经病理组织检测确诊的膀胱癌及癌前病变患者的尿液样本140例，经病理组织检测确诊的输尿管癌患者的尿液样本20例，经病理组织检测确诊的肾盂癌患者的尿液样本35例，收集进行常规体检的健康人的尿液样本40例。此外，还收集了常见的泌尿系统良性疾病(包括腺性膀胱炎、泌尿道感染、前列腺增生、肾结石、肾积水等)患者的尿液样本86例，泌尿系统其他恶性肿瘤(肾癌、前列腺癌等)患者的尿液样本6例，收集到的每份尿液样本的体积大于50mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。

2.样本DNA的提取

利用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。

3.样本DNA的转化和纯化

尿液样本中DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤见试剂盒说明书。

4.qMSP反应

按照实施例2中提供的方法进行甲基化特异性荧光定量PCR检测。

5.结果判读

根据qPCR的结果计算每个样本中目标区域的Ct值与内参基因ACTB的Ct值的差值即ΔCt，然后使用IBM SPSS Version 22软件对所有尿液样本进行ROC(receiveroperating characteristic curve)分析，记录约登指数(Youden’s index)最大时的灵敏度、特异性和AUC值，此时的ΔCt即为截断值。若待测样本的ΔCt值小于等于截断值，则该样本在所检测的目标区域为甲基化阳性，其为膀胱癌阳性样本，若待测样本的ΔCt值大于截断值，则该样本在所检测的目标区域为甲基化阴性，其为膀胱癌阴性样本。利用qMSP法检测各个分子标志物的甲基化水平进而诊断膀胱癌患者和健康人的尿液样本的性能如表8所示。

表8qMSP法诊断膀胱癌尿液样本的性能

由表8和图1-图6可以看出，分子标志物BM1～BM6诊断膀胱癌患者尿液样本的性能良好，所有标志物的AUC值都大于0.78。同组织样本相似，对于每个分子标志物来说，其DNA区域内的各个部分区域诊断尿液样本的AUC值(ROC曲线下面积)相差不大，因而其诊断效果基本是一致的。总体看来，分子标志物BM1～BM6诊断膀胱癌患者尿液样本的灵敏度比组织样本有所下降，但是其诊断健康人尿液样本的特异性比检测癌旁正常组织样本有所提高。另外，分子标志物BM1、BM2、BM4和BM6的AUC值高于BM3和BM5，表明BM1、BM2、BM4和BM6的诊断性能优于BM3和BM5。在临床应用中，要尽量减少假阳性结果，因而对诊断试剂和诊断试剂盒的特异性要求较高。所述6个分子标志物中，BM1、BM4和BM6用于尿液样本检测膀胱癌的特异性更优。

实施例4利用qMSP法检测尿液样本中分子标志物组合的甲基化水平进而诊断膀胱癌的效果

为了进一步提高分子标志物BM1、BM4和BM6诊断性能，本实施例分析了2个标志物的组合联合诊断膀胱癌患者、其它泌尿系统恶性肿瘤患者、泌尿系统良性疾病患者和健康人尿液样本的效果。在实施例4～6中选择BM1-1、BM4-5和BM6-1分别代表BM1、BM4和BM6。

尿液样本的收集、样本DNA的提取、转化和纯化、甲基化特异性荧光定量PCR检测等方法同实施例3。当使用2个标志物作为目标区域时，结果判读方法为：比较待测样本在所检测的目标区域的ΔCt值与该区域的截断值的大小，若待测样本的ΔCt值小于等于截断值，则该样本在所检测的目标区域为甲基化阳性；若待测样本的ΔCt值大于截断值，则该样本在所检测的目标区域为甲基化阴性。若待测样本在所述2个目标区域中的至少一个区域为甲基化阳性，则该样本为膀胱癌阳性样本，若待测样本在所述2个目标区域都为甲基化阴性，则该样本为膀胱癌阴性样本。

基于上述判读方法，整理膀胱癌患者的病理信息，根据不同的临床病理分期、组织学分级和病理类型统计BM1+BM6组合诊断膀胱癌尿液样本的效果，结果如表9～表12所示。

表9BM1+BM6诊断不同临床分期的膀胱癌患者尿液样本的灵敏度

表10BM1+BM6诊断不同病理分级的膀胱癌患者尿液样本的灵敏度

表11BM1+BM6诊断不同浸润状态的膀胱癌患者尿液样本的灵敏度

表12BM1+BM6检测其它泌尿系统恶性肿瘤、良性疾病和健康人尿液样本的特异性

由表9～表12可以看出，分子标志物BM1+BM6的组合诊断膀胱癌患者、健康人、泌尿系统其它恶性肿瘤患者和泌尿系统良性疾病患者尿液样本的效果非常好。具体地，对于不同病理分期的膀胱癌患者的尿液样本，BM1+BM6的组合对膀胱癌癌前病变的检出率为42.9％，其对于0a期、0is期等早期癌变的检出率高达100％，其诊断的总灵敏度为96.3％；若将尿液样本按照膀胱癌患者的不同病理分级来分类，BM1+BM6的组合对所有病理分级样本的诊断灵敏度都很高，其诊断的总灵敏度为99.2％；若将尿液样本按照膀胱癌患者的不同浸润状态来分类，BM1+BM6的组合对所有样本的检测灵敏度接近100％。另外，BM1+BM6的组合检测健康人、泌尿系统其它恶性肿瘤患者样本的特异性均为100％，其检测泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性为92.7％。

整理膀胱癌患者的病理信息，根据不同的临床病理分期、组织学分级和病理类型统计BM4+BM6组合诊断膀胱癌尿液样本的效果如表13～表16所示。

表13BM4+BM6诊断不同临床分期的膀胱癌患者尿液样本的灵敏度

表14BM4+BM6诊断不同病理分级的膀胱癌患者尿液样本的灵敏度

表15BM4+BM6诊断不同浸润状态的膀胱癌患者尿液样本的灵敏度

表16BM4+BM6检测其它泌尿系统恶性肿瘤、良性疾病和健康人尿液样本的特异性

由表13～表16可以看出，分子标志物BM4+BM6的组合诊断膀胱癌患者、健康人、泌尿系统其它恶性肿瘤患者和泌尿系统良性疾病患者尿液样本的效果也非常好。对于不同病理分期的膀胱癌患者的尿液样本，BM4+BM6的组合对膀胱癌癌前病变的检出率高达83.3％，其对于0a期、0is期等早期癌变的检出率为100％，其诊断的总灵敏度为94.6％；若将尿液样本按照膀胱癌患者的不同病理分级来分类，BM4+BM6的组合对所有病理分级样本的诊断灵敏度都大于等于94％，其诊断的总灵敏度为95.1％；若将尿液样本按照膀胱癌患者的不同浸润状态来分类，BM4和BM6的组合诊断浸润性癌的灵敏度(88.9％)略低于其诊断非浸润性癌(95.8％)的灵敏度，其诊断的总灵敏度为95.1％。另外，BM4+BM6的组合检测健康人、泌尿系统其它恶性肿瘤患者样本的特异性均为100％，其检测泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性为94.9％。

整理膀胱癌患者的病理信息，根据不同的临床病理分期、组织学分级和病理类型统计BM1+BM4组合诊断膀胱癌尿液样本的效果如表17～表20所示。

表17BM1+BM4诊断不同临床分期的膀胱癌患者尿液样本的灵敏度

表18BM1+BM4诊断不同病理分级的膀胱癌患者尿液样本的灵敏度

表19BM1+BM4诊断不同浸润状态的膀胱癌患者尿液样本的灵敏度

表20BM1+BM4检测其它泌尿系统恶性肿瘤、良性疾病和健康人尿液样本的特异性

由表17～表20可以看出，分子标志物BM1+BM4的组合诊断膀胱癌患者、健康人、泌尿系统其它恶性肿瘤患者和泌尿系统良性疾病患者尿液样本的效果也十分出色。对于不同病理分期的膀胱癌患者的尿液样本，BM1+BM4的组合对膀胱癌癌前病变的检出率为71.4％，其对于0a期、0is期等早期癌变的检出率分别为90.9％和100％，其对Ⅰ期和Ⅱ期膀胱癌患者的检出率均高于93％，其诊断的总灵敏度为95.4％；若将尿液样本按照膀胱癌患者的不同病理分级来分类，BM1+BM4的组合对所有病理分级的诊断灵敏度都大于96％，其诊断的总灵敏度为96.2％；若将尿液样本按照膀胱癌患者的不同浸润状态来分类，BM1+BM4的组合诊断非浸润性癌的灵敏度为97.9％，其诊断浸润性癌的灵敏度为100％，其诊断的总灵敏度为98.4％。另外，BM1+BM4的组合检测健康人、泌尿系统其它恶性肿瘤患者样本的特异性均为100％，其检测泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性为90.7％，其在对照样本和干扰样本中的总体特异性为93.9％。

综上，以标志物BM1、BM4和BM6中任意两种组合作为目标区域，通过qMSP法检测其甲基化水平，都可以有效区分膀胱癌患者和非膀胱癌患者，其诊断的灵敏度和特异性都很高，且其对极早期和早期膀胱癌有显著的诊断效果。

实施例5利用qMSP法检测尿液样本中分子标志物组合的甲基化水平进而诊断输尿管癌的效果。

尿液样本的收集、样本DNA的提取、转化和纯化、甲基化特异性荧光定量PCR检测方法同实施例3，结果判读方法同实施例4。分子标志物BM1+BM6组合、BM4+BM6组合、BM1+BM4组合诊断20例不同病理分期的输尿管癌的患者尿液样本的灵敏度分别如表21、表22、表23所示。

表21BM1+BM6诊断不同临床分期的输尿管癌患者尿液样本的灵敏度

表22BM4+BM6诊断不同临床分期的的输尿管癌患者尿液样本的灵敏度

表23BM1+BM4诊断不同临床分期的输尿管癌患者尿液样本的灵敏度

由表21～表23可以看出，除了膀胱癌，分子标志物BM1、BM4和BM6中任意两个的组合对输尿管癌患者的尿液样本有较高的检测灵敏度，任意2个标志物的组合对输尿管癌的总体检测灵敏度大于等于90％。BM1+BM6的组合以及BM4+BM6的组合对早期(Ⅰ期和Ⅱ期)输尿管癌患者的尿液样本的检出率均为100％，BM1+BM4的组合对Ⅰ期和Ⅱ期输尿管癌患者的尿液样本的检出率分别为83.3％和87.5％。以上结果表明，通过检测分子标志物BM1、BM4和BM6中任意两个的组合的甲基化水平，有利于提高其诊断输尿管癌患者特别是早期患者的灵敏度。

实施例6利用qMSP法检测尿液样本中分子标志物组合的甲基化水平进而诊断肾盂癌的效果。

尿液样本的收集、样本DNA的提取、转化和纯化、甲基化特异性荧光定量PCR检测方法同实施例3，结果判读方法同实施例4。分子标志物BM1+BM6组合、BM4+BM6组合、BM1+BM4组合诊断35例不同病理分期的肾盂癌患者的尿液样本的灵敏度分别如表24、表25、表26所示。

表24BM1+BM6诊断不同临床分期的肾盂癌患者尿液样本的灵敏度

表25BM4+BM6诊断不同临床分期的的肾盂癌患者尿液样本的灵敏度

表26BM1+BM4诊断不同临床分期的肾盂癌患者尿液样本的灵敏度

/>

由表24～表26可以看出，除了膀胱癌和输尿管癌，分子标志物BM1、BM4和BM6中任意两个的组合对肾盂癌患者的尿液样本也有较高的检测灵敏度，任意2个标志物的组合对肾盂癌的总体检测灵敏度大于85％，其中BM4+BM6的组合诊断肾盂癌的总灵敏度高达94.3％。BM1+BM6的组合以及BM1+BM4的组合对早期肾盂癌(Ⅰ期和Ⅱ期)患者的尿液样本的检出率均为83.3％，BM4+BM6的组合对Ⅰ期和Ⅱ期肾盂癌患者的尿液样本的检出率分别为91.7％和100％。以上结果表明，通过检测分子标志物BM1、BM4和BM6中任意两个的组合的甲基化水平，有利于提高其诊断肾盂癌患者特别是早期患者的灵敏度。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.一种检测分子标志物的甲基化水平的试剂，其特征在于，所述分子标志物包括如下定义的BM1、BM2、BM3、BM4、BM5和BM6中的至少一个：

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述BM1包括如下定义的BM1-1、BM1-2、BM1-3、BM1-4、BM1-5和BM1-6中的至少一个，所述BM1-1为Chr10:101140255-101140395正链，所述BM1-2为Chr10:101140325-101140440正链，所述BM1-3为Chr10:101140237-101140445正链，所述BM1-4为Chr10:101140400-101140234负链，所述BM1-5为Chr10:101140385-101140254负链，所述BM1-6为Chr10:101140374-101140226负链；

所述BM2包括如下定义的BM2-1、BM2-2和BM2-3中的至少一个，所述BM2-1为Chr10:116271316-116271435正链，所述BM2-2为Chr10:116271441-116271537正链，所述BM2-3为Chr10:116271440-116271587正链；

所述BM3包括如下定义的BM3-1、BM3-2、BM3-3和BM3-4中的至少一个，所述BM3-1为Chr13:27929099-27929205正链，所述BM3-2为Chr13:27929219-27929389正链，所述BM3-3为Chr13:27929475-27929301负链，所述BM3-4为Chr13:27929259-27929146负链；

所述BM4包括如下定义的BM4-1、BM4-2、BM4-3、BM4-4和BM4-5中的至少一个，所述BM4-1为Chr6:27495249-27495413正链，所述BM4-2为Chr6:27495394-27495503正链，所述BM4-3为Chr6:27495524-27495644正链，所述BM4-4为Chr6:27495603-27495461负链，所述BM4-5为Chr6:27495445-27495376负链；

所述BM5包括如下定义的BM5-1、BM5-2和BM5-3中的至少一个，所述BM5-1为Chr7:19118066-19118214正链，所述BM5-2为Chr7:19118242-19118334正链，所述BM5-3为Chr7:19118399-19118518正链；和/或

所述BM6包括如下定义的BM6-1、BM6-2、BM6-3、BM6-4、BM6-4和BM6-6中的至少一个，所述BM6-1为Chr10:17229173-17229323正链，所述BM6-2为Chr10:17229290-17229401正链，所述BM6-3为Chr10:17229424-17229571正链，所述BM6-4为Chr10:17229587-17229450负链，所述BM6-5为Chr10:17229437-17229291负链，所述BM6-6为Chr10:17229305-17229173负链。

3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，所述分子标志物包括所述BM1、BM4和BM6中至少任意两者。

4.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括能检测所述分子标志物的甲基化水平的引物对和/或探针。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括检测所述BM1甲基化水平的引物对，所述引物对包括SEQ ID NO.19～20所示的引物对、SEQ ID NO.22～23所示的引物对、SEQ ID NO.25～26所示的引物对、SEQ ID NO.28～29所示的引物对、SEQ ID NO.31～32所示的引物对、或SEQ ID NO.34～35所示的引物对中至少一组；

所述试剂包括检测所述BM2的引物对，所述引物对包括SEQ ID NO.37～38所示的引物对、SEQ IDNO.40～41所示的引物对、或SEQ ID NO.43～44所示的引物对中至少一组；

所述试剂包括检测所述BM3的引物对，所述引物对包括SEQ ID NO.46～47所示的引物对、SEQ IDNO.49～50所示的引物对、SEQ ID NO.52～53所示的引物对、或SEQ ID NO.55～56所示的引物对中至少一组；

所述试剂包括检测所述BM4的引物对，所述引物对包括SEQ ID NO.58～59所示的引物对、SEQ IDNO.61～62所示的引物对、SEQ ID NO.64～65所示的引物对、SEQ ID NO.67～68所示的引物对、或SEQ IDNO.70～71所示的引物对中至少一组；

所述试剂包括检测所述BM5的引物对，所述引物对包括SEQ ID NO.73～74所示的引物对、SEQ IDNO.76～77所示的引物对、或SEQ ID NO.79～80所示的引物对中至少一组；和/或

所述试剂包括检测所述BM6的引物对，所述引物对包括SEQ ID NO.82～83所示的引物对、SEQ IDNO.85～86所示的引物对、SEQ ID NO.88～89所示的引物对、SEQ ID NO.91～92所示的引物对、SEQ IDNO.94～95所示的引物对、或SEQ ID NO.97～98所示的引物对中至少一组。

6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括检测所述BM1甲基化水平的探针，所述探针包括SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.33、或SEQ ID NO.36所示探针中至少一者；

所述试剂包括检测所述BM2甲基化水平的探针，所述探针包括SEQ ID NO.39、SEQ IDNO.42、或SEQ ID NO.45所示探针中至少一者；

所述试剂包括检测所述BM3甲基化水平的探针，所述探针包括SEQ ID NO.48、SEQ IDNO.51、SEQ ID NO.54、或SEQ ID NO.57所示探针中至少一者；

所述试剂包括检测所述BM4甲基化水平的探针，所述探针包括SEQ ID NO.60、SEQ IDNO.63、SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.69、或SEQ ID NO.72所示探针中至少一者；

所述试剂包括检测所述BM5甲基化水平的探针，所述探针包括SEQ ID NO.75、SEQ IDNO.78、或SEQ ID NO.81所示探针中至少一者；和/或

所述试剂包括检测所述BM6甲基化水平的探针，所述探针包括SEQ ID NO.84、SEQ IDNO.87、SEQ ID NO.90、SEQ ID NO.93、SEQ ID NO.96、或SEQ ID NO.99中的至少一者。

7.权利要求1-6任一项所述的试剂在制备尿路上皮癌检测产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述尿路上皮癌包括膀胱癌和/或上尿路尿路上皮癌；可选地，所述上尿路尿路上皮癌包括输尿管癌和肾盂癌。

9.一种诊断尿路上皮癌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1-6任一项所述的试剂。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括DNA亚硫酸氢盐转化试剂、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、PCR扩增试剂和质控试剂中至少一种；可选地，所述检测试剂盒还包括样本采样装置。