CN115976210A - 用于胃癌诊断和筛查的试剂盒、方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于胃癌诊断和筛查的试剂盒、方法及其用途，该试剂盒包括用于检测Reprimo基因和/或CABIN1基因的启动子区域CpG甲基化的试剂。本发明基于具有胃癌特异性的Reprimo、CABIN1基因甲基化检测，可在血浆样本中实现胃癌患者的特异性、灵敏性检出。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及用于胃癌诊断和筛查的试剂盒、方法及其用途。
背景技术
胃癌(gastric cancer，GC)是我国最常见且高发的消化道肿瘤之一，严重威胁人民的生命健康。近几十年来，随着我国人民生活条件的改善、良好饮食习惯的形成、幽门螺杆菌(H.pylori，Hp)的根除等因素，胃癌发病率总体有所下降，但情况仍然不容乐观。根据2016年我国癌症数据报告[1]，我国新增胃癌病例约39.65万，死亡人数约28.85万，其发病率和病死率在恶性肿瘤中均高居第3位。胃癌患者5年生存率与介入时期密切相关，中晚期胃癌5年生存率低于15％，而早期胃癌患者5年生存率超过90％；但我国早期胃癌诊治率低于10％，远低于胃癌早筛普及的日本(70％)和韩国(50％)[2]。因此提升胃癌早期诊断和筛查水平，对于控制胃癌发病率增长、延长患者生存期和提高生存质量均有重要意义。
我国胃癌在自然人群中发病率约为31.28/10万，其中男性发病率为42.93/10万，女性为19.03/10万[3]。因胃癌中约半数患者无可报警症状，早期胃癌一般无特异性症状，因此不应因无特异性症状而排除筛查对象。胃癌的病死率随年龄的增长而增加，40岁以下时处于较低水平，40岁之后快速上升，因此建议以40岁为胃癌筛查的起始年龄[2]。然而我国国内目前尚无简便、有效、依从性高的检测方法用于高危人群筛查。现阶段，我国的胃癌筛查手段主要有内镜检查和血清学检查两种方式。其中，内镜(胃镜)为主的影像学检查广泛应用于临床和体检。结合组织病理检查，胃镜检查可发现早期胃癌黏膜改变，是胃癌诊断的“金标准”。但胃镜检查仍存在IIb型早期胃癌难发现，活检准确取材成功率不稳定导致误诊风险等问题；且胃镜属于侵入性检查，依从性较差，人力及医疗资源耗费巨大，难以应用于大规模人群筛查；由于操作人员经验不足或设备清洁不当导致的上消化道损伤和交叉感染的情况也时有报道。磁控胶囊胃镜筛查属于无痛内镜筛查方式，具有较好的准确度，但费用较为昂贵，且同样存在一定的漏诊概率。常见的血清肿瘤标记物如CEA及CA19-9等，早期胃癌的检出率低于10％，对胃癌特异性较低，通常作为预后监测指标，不建议作为筛查指标。PG是胃蛋白酶原的无活性前体，分为PGI、PGII两种亚型，是反映胃体胃窦黏膜外分泌功能的良好指标，当发生胃粘膜萎缩时，上述指标水平降低。此外幽门螺旋杆菌(Hp)被认为是人类胃癌第I类致癌原，血清Hp抗体检测和尿素呼气检测(13C-UBT或14C-UBT)能够检测是否感染Hp，从而指示受检人是否有患胃癌风险。PGI、PGII和Hp联合检测可指征胃癌风险的增加，然而相对于某些胃部疾病如萎缩性胃炎等不具有显著的特异性。
胃癌的发病进展是一个多因素协同的过程，为了实现更加便捷、精准、依从性高的筛查，开发可用于胃癌早诊的兼具高灵敏度高特异性的检测技术意义重大。近年来，研究发现分离自肿瘤患者血浆的DNA中存在基因甲基化水平异常；血浆游离DNA的异常甲基化是肿瘤早期发生、发展过程中的重要分子特征。研究发现，血浆游离DNA中Reprimo基因和CABIN1基因的甲基化检测，具有胃癌体外分子诊断的潜在应用价值。
Reprimo是一种糖基化胞浆蛋白，位于人类染色体2q23.3，作为p53的下游效应器，引起细胞周期的G2/M期阻滞，具有抑制细胞增殖的作用[4]。据报道，在胃癌中，Reprimo作为抑癌基因，由于启动子区域的异常甲基化状态，其表达在部分样本中缺失。2008年，智利天主教大学在43例胃癌病人样本中发现Reprimo基因在97.7％(42/43)的组织样本和95.3％(41/43)的血浆样本中存在异常甲基化状态，而在对照组中DNA甲基化中仅有9.7％(3/31)，暗示其可作为胃癌诊断的非侵入性生物标志物[5]。2011年，武汉大学中南医院报道，Reprimo在100例胃癌病人样本中有65例表达沉默，其表达抑制同时也与肿瘤侵染、淋巴结转移程度有相关性[6]。2015年，智利天主教大学再次报道，Reprimo基因在114例胃癌病人中有71例存在表达抑制且与胃癌的侵染性呈现正相关[7]。同年，山东临沂肿瘤医院报道，Reprimo基因在50例胃癌病人血浆样本中存在62％(31/60)的异常甲基化，而该异常甲基化在30个正常人血浆样本中并没有检测到[8]。2016年，福建师范大学报道，在35例胃癌病人血浆样本中Reprimo基因存在94.3％(33/35)的异常甲基化，而在正常人血浆样本仅有2.4％(1/41)[9]。2017年，浙江宁波大学整合了过往数据，报道了Reprimo作为胃癌诊断靶标的灵敏度为82％，特异性为89％[10]。以上报道和数据提示，血浆中Reprimo基因的甲基化检测，具有胃癌体外分子诊断的潜在应用价值。
CABIN1是一种钙调神经磷酸酶结合蛋白，位于人类染色体22q11.23，据研究，CABIN1是抑癌基因p53的负调控因子，其表达下调导致某些特定p53靶向基因的激活[11]。据得克萨斯大学安德鲁癌症研究中心相关研究[12]，MINT25基因(CABIN1基因启动区域相关序列)在进展期胃癌、早期胃癌以及胃不典型增生的活检组织样本中呈现过度甲基化，同时在癌旁组织及正常人胃部粘膜组织中呈现低甲基化；MINT25甲基化在在胃癌患者和非癌症正常人的胃部灌洗液中也检测到同样的甲基化程度的区别，具有90％(18/20)的灵敏度和96％(46/48)的特异性，特别的，对早期胃癌具有83.3％(5/6)的检出率。MINT25在胃癌及其癌前病变组织中的过度甲基化同样在另一个研究[13]中得到支持，在正常或慢性胃炎的胃黏膜组织、肠化生胃黏膜组织、非癌变相关的异型增生或腺瘤组织、癌变相关的异型增生或腺瘤组织、以及T1期胃腺癌组织中，MINT25的甲基化程度分别为10-37％、41％、67-78％、81％和90％，提示其甲基化在胃癌发展过程可能是早期事件。北京大学汤富酬研究团队发现[14]，在血浆样本中，CABIN1联合DOCK10、KCNQ5的基因组甲基化测序方法对I、II、III、IV期胃癌分别具有44％、59％、78％、100％的检测灵敏度，同时确保92％的特异性，能够显著区分结直肠癌和肝癌受试者；其中CABIN1单独的检测性能表现尤为优异。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供用于胃癌诊断和筛查的试剂盒、方法及其用途，采用单重或多重实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法进行Reprimo基因和/或CABIN1基因富含CpG启动子区域基因的甲基化检测，其中采用人类重复子Alu基因共有序列(Alu-C4)或人β-肌动蛋白基因(ACTB)作为内参，用于核酸质量控制和定量参照。
基于上述目的，本发明的第一个方面提供了一种用于胃癌诊断和筛查的试剂盒，其包括用于检测Reprimo基因和/或CABIN1基因的启动子区域CpG甲基化的试剂。
在本发明的优选的实施方案中，所检测的Reprimo基因的核苷酸序列选自如SEQID NO.1、2、3、4和5所示的核苷酸序列；优选地，所检测的Reprimo基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
在本发明的优选的实施方案中，所检测的CABIN1基因的核苷酸序列选自如SEQ IDNO.6、7、8、9、10和11所示的核苷酸序列；优选地，所检测的CABIN1基因的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
在本发明的优选的实施方案中，上述试剂盒还包括用于检测内参基因Alu-C4或ACTB甲基化的试剂；
优选地，所检测的内参基因Alu-C4的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
优选地，所检测的内参基因ACTB的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
在本发明的优选的实施方案中，所述用于检测Reprimo基因和/或CABIN1基因的启动子区域CpG甲基化的试剂和用于检测内参基因Alu-C4或ACTB甲基化的试剂分别包括上游引物、下游引物和/或探针。
在本发明的优选的实施方案中，所述用于检测Reprimo基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.1甲基化的试剂可以是包括或者是选自如SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.16所示核苷酸序列的探针；和/或所述用于检测Reprimo基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.2甲基化的试剂可以包括或者是选自如SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.18所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的探针；和/或所述用于检测Reprimo基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.3甲基化的试剂可以包括或者是选自如SEQ IDNO.20所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.22所示核苷酸序列的探针；和/或所述用于检测Reprimo基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.4甲基化的试剂可以包括或者是选自如SEQ ID NO.23所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.24所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.25所示核苷酸序列的探针；和/或所述用于检测Reprimo基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.5甲基化的试剂可以包括或者是选自如SEQ ID NO.26所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.27所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.28所示核苷酸序列的探针。
在本发明的优选的实施方案中，所述用于检测CABIN1基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.6甲基化的试剂可以包括或者是选自如SEQ ID NO.29所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.30所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.31所示核苷酸序列的探针；和/或所述用于检测CABIN1基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.7甲基化的试剂可以包括或者是选自如SEQ ID NO.32所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.33所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.34所示核苷酸序列的探针；和/或所述用于检测CABIN1基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.8甲基化的试剂可以包括或者是选自如SEQIDNO.35所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.36所示核苷酸序列的下游引物和如SEQID NO.37所示核苷酸序列的探针；和/或所述用于检测CABIN1基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.9甲基化的试剂可以包括或者是选自如SEQ ID NO.38所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.39所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.40所示核苷酸序列的探针；和/或所述用于检测CABIN1基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.10甲基化的试剂可以包括或者是选自如SEQ ID NO.41所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.42所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.43所示核苷酸序列的探针；和/或所述用于检测CABIN1基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.11甲基化的试剂可以包括或者是选自如SEQ ID NO.44所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.45所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.46所示核苷酸序列的探针。
在本发明的优选的实施方案中，所述用于检测内参基因Alu-C4甲基化的试剂可以包括或者是选自如SEQ ID NO.47所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.48所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.49所示核苷酸序列的探针。
在本发明的优选的实施方案中，所述用于检测内参基因ACTB甲基化的试剂可以包括或者是选自如SEQ ID NO.50所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.51所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.52所示核苷酸序列的探针。
本发明的第二个方面提供了第一个方面中所述试剂在制备用于胃癌及其早期癌前病变的诊断和筛查的试剂盒中的用途。
本发明的第三个方面提供了一种用于胃癌诊断和筛查的方法，其包括以下步骤：
1)提取样本DNA；和
2)测定Reprimo基因的启动子区域中选自如SEQ ID NO.1-5所示的核苷酸序列和/或CABIN1基因的启动子区域中选自如SEQ ID NO.6-11所示的核苷酸序列的CpG甲基化情况。
在该方面进一步优选的实施方案中，还包括以下步骤：
1)将提取的样本DNA用重亚硫酸盐转化；和
2)使用上述试剂盒对步骤1)得到的样本DNA进行实时荧光定量PCR扩增，检测荧光信号并判定结果。
在第三个方面的优选实施方案中，使用第一个方面中所述的试剂，如所述的引物和/或探针，对Reprimo基因和/或CABIN1基因的启动子区域中的所述核苷酸序列进行检测。
在本发明的第一个和第二个方面中，所述Reprimo基因、CABIN1基因和/或内参基因的甲基化通过荧光PCR法(单重或多重)、如实时荧光定量PCR法来检测。
在本发明的第一个、第二个和第三个方面涉及荧光PCR法的优选实施方案中，所述探针带有荧光标记。在进一步优选的实施方案中，所述荧光标记包括但不限于FAM、TAMRA、VIC、BHQ1、CY3、CY5和MGB。
本发明的有益效果为：
本发明基于具有胃癌特异性的Reprimo、CABIN1基因、如特定核苷酸序列的甲基化检测，例如单重或多重的荧光PCR法检测，可在血浆样本中实现胃癌患者的特异性、灵敏性检出。在组群1中检测36受试者(7例胃癌患者、19例健康体检人群以及10例肠癌患者)的血浆游离DNA样本，受试者工作曲线分析显示，Reprimo基因所述核苷酸序列甲基化检测的曲线下面积(AUC)为1.00，在合适的阳性阈值下，检测的灵敏度为100.00％(95％CI：59.04％～100％)，特异性为96.43％(95％CI：81.65％～99.91％)。在组群2中检测24名受试者(8例胃癌阳性患者，14例临床阴性样本以及2例胃癌术后患者)的血浆游离DNA样本，受试者工作曲线分析，Reprimo和CABIN1基因所述核苷酸序列甲基化联合检测的曲线下面积(AUC)为0.9732，在合适的阳性阈值下，检测的灵敏度为87.50％(95％ CI:52.91％～97.76％)，特异性为100.00％(95％CI:78.47％～100.00％)。
附图说明
图1为Reprimo基因在健康人全血基因组(H1～H12)、健康人外周血单个核细胞(PBMC)、健康人自然杀伤细胞(NK)、肠癌细胞系HCT116、宫颈癌细胞系Hela、胃癌细胞系AGS、SNU1、N87等细胞基因组DNA中的甲基化程度示意，△Ct值越小表示Reprimo基因在该基因组中甲基化程度越高。
图2为CABIN1基因在健康人全血基因组(H1～H12)、健康人外周血单个核细胞(PBMC)、健康人自然杀伤细胞(NK)、肠癌细胞系HCT116、宫颈癌细胞系Hela、胃癌细胞系AGS、SNU1、N87等细胞基因组DNA中的甲基化程度示意，△Ct值越小表示CABIN1基因在该基因组中甲基化程度越高。
图3为健康人全血基因组(H3)、健康人外周血单个核细胞(PBMC)、健康人自然杀伤细胞(NK)、肠癌细胞系HCT116、宫颈癌细胞系Hela、胃癌细胞系AGS、SNU1、N87等细胞基因组DNA的三重PCR扩增曲线图。
图4为M.Sss I处理的AGS细胞基因组中Reprimo基因启动子区域CpG岛甲基化测序结果。
图5为野生型AGS细胞基因组中Reprimo基因启动子区域CpG岛甲基化测序结果。
图6为DNMT DKO HCT116细胞基因组中Reprimo基因启动子区域CpG岛甲基化测序结果。
图7为健康志愿者外周血基因组中Reprimo基因启动子区域CpG岛甲基化测序结果。
图8为36名受试者(7例胃癌阳性样本，19例健康体检人群以及10例肠癌患者)血浆样本中Reprimo基因的Ct值结果。
图9为36名受试者(7例胃癌阳性样本，19例健康体检人群以及10例肠癌患者)血浆样本中Reprimo基因的Ct值的受试者工作曲线图。
图10为24名受试者(8例胃癌阳性患者，14例临床阴性样本以及2例胃癌术后患者)血浆样本中Reprimo基因和内参Alu-C4基因的△Ct值。
图11为24名受试者(8例胃癌阳性患者，14例临床阴性样本以及2例胃癌术后患者)血浆样本中CABIN1基因和内参Alu-C4基因的△Ct值。
图12为24名受试者(8例胃癌阳性患者，14例临床阴性样本以及2例胃癌术后患者)血浆样本中Reprimo和CABIN1基因和内参Alu-C4基因的双△Ct值。
图13为24名受试者(8例胃癌阳性患者，14例临床阴性样本以及2例胃癌术后患者)血浆样本中Reprimo单基因△Ct值、CABIN1单基因△Ct值和双基因双△Ct值的受试者工作曲线图。
具体实施方式
需要说明的是，除非另外定义，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为所属领域的技术人员所理解的通常意义。
本发明的第一个方面提供了一种用于胃癌诊断和筛查的试剂盒，其包括用于检测Reprimo基因和/或CABIN1基因的启动子区域CpG甲基化的试剂。
Reprimo基因的核苷酸序列可以参见NCBI登录号(Gene ID):56475。CABIN1基因的核苷酸序列可以参见NCBI登录号(Gene ID):23523。
在本发明的优选的实施方案中，所检测的Reprimo基因启动子区域的核苷酸序列选自如SEQ ID NO.1、2、3、4和5所示的核苷酸序列；优选地，所检测的Reprimo基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的优选的实施方案中，所检测的CABIN1基因启动子区域的核苷酸序列选自如SEQ ID NO.6、7、8、9、10和11所示的核苷酸序列；优选地，所检测的CABIN1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的优选的实施方案中，上述试剂盒还包括用于检测内参基因Alu-C4或ACTB甲基化的试剂；
优选地，所检测的内参基因Alu-C4的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
优选地，所检测的内参基因ACTB的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
在测定基因的表达量(例如利用qPCR技术)时，可以分别测定目的基因和内参基因的表达量，并把内参基因的表达量作为一个标准来测出目的基因的相对表达量，最后再进行样品间相对表达量的比较。内参基因是指其表达水平不受研究条件的影响且可以在多种样本间恒定表达的已知参照基因，用这个基因的表达水平可以准确量化初始材料的载量。
在本发明的优选的实施方案中，所述用于检测Reprimo基因和/或CABIN1基因的启动子区域CpG甲基化的试剂和用于检测内参基因Alu-C4或ACTB甲基化的试剂可以分别包括上游引物、下游引物和/或探针。
在本发明的优选的实施方案中，所述用于核苷酸序列SEQ ID NO.1甲基化的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.14～16所示；和/或所述用于检测核苷酸序列SEQ ID NO.2甲基化的的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.17～19所示；和/或所述用于检测核苷酸序列SEQ ID NO.3甲基化的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20～22所示；和/或所述用于检测核苷酸序列SEQID NO.4甲基化的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.23～25所示；和/或所述用于检测核苷酸序列SEQ ID NO.5甲基化的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.26～28所示。
在本发明的优选的实施方案中，所述用于检测核苷酸序列SEQ IDNO.6甲基化的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.29～31所示；和/或所述用于检测核苷酸序列SEQ ID NO.7甲基化的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.32～34所示；和/或所述用于检测核苷酸序列SEQ ID NO.8甲基化的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.35～37所示；和/或所述用于检测核苷酸序列SEQID NO.9甲基化的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.38～40所示；和/或所述用于检测核苷酸序列SEQ ID NO.10甲基化的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.41～43所示；和/或所述用于检测核苷酸序列SEQ ID NO.11甲基化的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.44～46所示。
在本发明的优选的实施方案中，所述用于检测内参基因Alu-C4甲基化的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.47～49所示。
在本发明的优选的实施方案中，所述用于检测内参基因ACTB甲基化的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.50～52所示。
本发明的第二个方面提供了上述试剂在制备用于胃癌及其早期癌前病变的诊断和筛查的试剂盒中的用途。
本发明的序列SEQ ID NO.1～52如下表1所示。
表1
在本发明的优选的实施方案中，SEQ ID NO.14～52应用于但不仅限于普通PCR、多重荧光PCR、数字PCR、毛细管电泳、恒温扩增、测序等核酸检测平台。
本发明的第三个方面提供了一种用于胃癌诊断和筛查的方法，其包括以下步骤：
1)提取样本DNA；和
2)测定Reprimo基因的启动子区域中选自如SEQ ID NO.1-5所示的核苷酸序列和/或CABIN1基因的启动子区域中选自如SEQ ID NO.6-11所示的核苷酸序列的CpG甲基化情况。
在该方面进一步优选的实施方案中，还包括以下步骤：
1)将提取的样本DNA用重亚硫酸盐转化；
2)使用上述试剂盒对步骤1)得到的样本DNA进行实时荧光定量PCR扩增，检测荧光信号并判定结果。
在本发明的优选的实施方案中，所述样本DNA的来源包括细胞、组织切片、粪便、全血、血浆、血清和胃部灌洗液，优选为血浆。
在本发明上述方面的优选的实施方案中，所述探针带有荧光标记。在进一步优选的实施方案中，用于标记所述探针的5’端荧光基团包括但不限于FAM、VIC或CY5，3’端淬灭基团包括但不限于TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ、MGB。
本领域技术人员知晓，可以根据Reprimo基因、CABIN1基因、所述内参基因的序列以及本申请的公开内容，如实施例中所公开的Reprimo基因、CABIN1基因的启动子区域CpG在AGS胃癌细胞系中的甲基化情况，对所检测的核苷酸序列SEQ ID NO.1-11以及本发明的引物序列和探针序列作出适当调整和修改。这些经过修改的待检测序列以及引物序列和探针序列仍可以用于检测所述基因的甲基化情况。本发明也包括这些等同的技术方案。
实施例
为了进一步说明本发明相关技术内容以及具体实验操作，以下列举了部分实施例。应当理解的是，以下实施例仅用于说明，而非本发明的限定范围，所使用的引物探针组合、核酸提取方法、DNA甲基化处理方法、模板DNA样本量、试剂浓度等可考量变化的实验参数、实际操作可根据实际情况而发生变更。下述实施例中涉及到的常规实验操作若无特别说明，均按常规方法操作。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1Reprimo和CABIN1基因启动子区域CpG在不同胃癌细胞系中呈现高度甲基化
1.主要试剂和材料
1)血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司，用于提取健康人全血基因组DNA、细胞基因组DNA；
2)EZ DNA MethylationTM Kit(Zymo Research)用于DNA的重亚硫酸盐转化；
3)TaKaRa Ex Hot Start Version用于荧光PCR扩增。
2.具体实施步骤
1)使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒按照说明书分别提取200μL健康人全血基因组或约500万细胞基因组；
2)取500ng健康人全血基因组或细胞基因组，使用EZ DNA MethylationtM Kit按照说明书进行非甲基化CpG的C/T转化处理，洗脱至20μL洗脱液；
3)使用Reprimo、CABIN1基因和Alu-C4内参基因的特异性上下游引物和探针(SEQID NO.14～16、SEQ ID NO.29～31、SEQ ID NO.47～49)，其中探针SEQ ID NO.16用5’-VIC荧光基团和3’-BHQ1标记，探针SEQ ID NO.31用5’-CY5荧光基团和3’-BHQ1标记，探针SEQID NO.49用5’-FAM荧光基团和3’-MGB标记)，以及TaKaRa Ex Hot Start Version按照说明书配制三重PCR反应，各引物浓度为200～400nM，探针浓度为200nM，酶浓度为0.05U/μL，PCR buffer浓度为1×，取2μL上述20倍稀释后的洗脱液作为扩增模板，进行荧光PCR反应，扩增程序为95℃预变性2min，95℃变性8s，60℃退火及延伸30s，共45个循环。
3.结果分析
Reprimo、CABIN1和Alu-C4内参基因的三重PCR(荧光PCR法)检测结果显示，Reprimo和CABIN1启动子区域CpG在健康人全血基因组(H1～H12)、健康人自然杀伤细胞(NK)、肠癌细胞系HCT116基因组中均呈现非甲基化状态；在胃癌细胞系AGS、SNU1、N87基因组中呈现高度甲基化；Reprimo基因启动子区域CpG在一名健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)和宫颈癌细胞系Hela基因组中呈现部分甲基化，CABIN1基因在宫颈癌细胞系Hela基因组中呈现部分甲基化，在一名健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)基因组中呈现非甲基化。结果详见图1～图3。
上述结果显示Reprimo和CABIN1基因在胃癌相关细胞系处于高度甲基化状态，在健康人血液或外周血细胞样本或肠癌、宫颈癌细胞系中呈现非甲基化或部分甲基化，提示它们在胃癌诊断和筛查方面极具特异性的潜力，这对于基于血浆游离核酸样本的检测形式具有重要的价值。
实施例2Reprimo基因启动子区域CpG在AGS胃癌细胞系中的甲基化一代测序研究
1.主要试剂和材料
1)血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司，用于提取健康人全血基因组DNA、细胞基因组DNA；
2)CpG Methyltransferase(M.Sss I)，NEW ENGLAND inc.，用于DNA的CpG位点甲基化修饰；
3)TaKaRa Ex Hot Start Version用于PCR扩增；
4)pMD 18-T vector(TaKaRa)用于PCR产物的质粒连接和测序。
2.具体实施步骤
1)使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒按照说明书分别提取200μL健康人全血基因组或约500万细胞基因组；
2)使用CpG Methyltransferase(M.Sss I)按照说明书处理1000ng野生型AGS细胞DNA，获得CpG位点甲基化的阳性对照样本；
3)使用TaKaRa Ex Hot Start Version和下述Reprimo基因甲基化/非甲基化通用测序上游和下游引物扩增CpG甲基化的AGS细胞DNA、野生型AGS细胞DNA、DNMT DKOHCT116细胞DNA和健康人外周血DNA，获得Reprimo基因甲基化或非甲基化目的片段，
Reprimo基因上游测序引物：AGTGAGGTTTTTGGGAAATTTTTA(SEQ ID NO.53)，
Reprimo基因下游测序引物：GTGAAAGCTTAATAAACAAATTACAAC(SEQ ID NO.54)；
4)使用80％冰乙醇和胶回收试剂盒回收PCR产物，并将各PCR产物连接至pMD 18-Tvector，转入大肠杆菌感受态细胞，涂布平板(含氨苄青霉素)后得到阳性菌落，进行一代测序分析。
3.结果分析
在M.Sss I处理的AGS基因组(阳性对照组)中，Reprimo基因启动子区域约400bp的CpG岛甲基化测序结果显示，42个CpG位点甲基化率为100％，5个CpG位点甲基化率为90％，2个CpG位点甲基化率为80％。总体甲基化率为98.16％。
在野生型AGS细胞基因组中，Reprimo基因启动子区域约400bp的CpG岛甲基化测序结果显示，28个CpG位点甲基化率为100％，14个CpG位点甲基化率为90％，4个CpG位点甲基化率为80％，2个CpG位点甲基化率为77.7％，1个CpG位点甲基化率为70％。总体甲基化率为93.99％。
在甲基化酶双敲除的细胞系DNMT DKO HCT116基因组DNA(阴性对照组)中，Reprimo基因启动子区域约400bp的CpG岛甲基化测序结果显示，35个CpG位点甲基化率为0％，9个CpG位点甲基化率为9.09％，2个CpG位点甲基化率为10％，2个CpG位点甲基化率为18.18％，1个CpG位点甲基化率为27.27％。总体甲基化率为3.38％。
在健康人志愿者外周血DNA中，Reprimo基因启动子区域约400bp的CpG岛甲基化测序结果显示，29个CpG位点甲基化率为0％，16个CpG位点甲基化率为16.67％，4个CpG位点甲基化率为33.3％。总体甲基化率为8.16％。
Reprimo是一种糖基化胞浆蛋白，引起细胞周期的G2/M期阻滞，具有抑制细胞增殖的作用。在健康细胞中，Reprimo启动子区域为低甲基化状态，Reprimo基因能够正常表达并作为抑癌基因调控正常的生理活动；当其启动子区域呈现高度甲基化状态时，Reprimo基因表达受阻，不能够起到抑制细胞异常增殖左右，促使正常细胞向癌细胞发展，进一步发展成为胃癌。
上述测序结果显示Reprimo基因启动子区域内约400bp的序列，在胃癌AGS细胞系DNA中呈现高度甲基化状态，甲基化率高达93.99％，而在健康志愿者的外周血DNA中显示，Reprimo基因该区域甲基化率仅8.16％，处于低甲基化状态，提示Reprimo基因启动子甲基化与胃癌致病的相关性，以及其作为胃癌诊断和筛查标志物的潜力。
实施例3Reprimo基因在血浆样本中实现对胃癌的特异性、灵敏性检测
1.主要试剂和材料
1)磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司，用于提取游离血浆DNA样本；
2)EZ DNA MethylationTM Kit(Zymo Research)用于血浆游离DNA样本的重亚硫酸盐转化；
3)TaKaRa Ex Hot Start Version用于荧光PCR扩增。
2.具体实施步骤
血浆游离DNA提取
1)在15mL离心管中加入2mL血浆，依次加入3mL裂解液(GHH)、200μL蛋白酶K和25μL磁珠。
2)涡旋振荡混匀后室温孵育20min，期间每3-5min上下颠倒混匀10sec。孵育结束后简短离心。
3)将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心倾倒液体，倾倒完后用移液枪小心移除剩余的液体。
4)加入750μL缓冲液GDF(确保已加乙醇)吹打混匀，转移至新的1.5ml离心管，涡旋振荡混匀。置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附后小心倾倒液体，倾倒完后用移液枪小心移除剩余的液体。
5)加入750μL漂洗液PWG(确保已加乙醇)吹打混匀后，涡旋振荡混匀。
6)置于磁力架上1min后，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
7)重复步骤5、6，再洗一次，并尽量小心的移除所有的液体。
8)磁力架上开盖室温晾干5min。
9)加入50μL洗脱缓冲液TBC，用移液枪吹打使磁珠重新悬浮，放置在56℃的金属块中，加热5min使磁珠上的DNA充分洗脱，每隔2两分钟振荡一次。便携式离心机离心样本后置于磁力架上，静置2min。
10)待磁珠完全吸附后转移液体至新的2mL离心管，用于后续实验或-20℃保存。
游离DNA的甲基化转化
11)配制CT试剂：700μL Water，300μL M-Dilution Buffer，50μLM-Dissolving，涡旋振荡混匀，置于振荡器上振荡10min。
12)在0.2mL离心管内，依次加入40μL DNA和110μL CT试剂，吹打混匀瞬离后，置于PCR仪开始转化(最好分装到2个PCR管反应)。98℃，10min。64℃，150min。4℃，保存。
13)将过滤柱置于收集管内，加入600μL M-Binding Buffer后，再将转化结束的混合物全部加入过滤柱中，吹打混匀，14000rpm离心30秒，去废液。
14)向过滤柱加入100μL M-Wash Buffer，14000rmp离心30秒。
15)加入200μL M-Desulphonation Buffer，室温静置孵育20min。孵育结束后，14000rpm离心30秒。
16)向过滤柱加入200μL M-Wash Buffer，14000rpm离心30秒，去废液。
17)重复步骤16，再洗一次。
18)将过滤柱放入一个干净的1.5ml的离心管内。加入20μLM-Elution Buffer，静置5min，14000rpm离心30秒，洗脱的DNA用于后续实验。
荧光PCR扩增
19)使用Reprimo基因和Alu-C4内参基因的特异性上下游引物和探针(SEQ IDNO.20～22、SEQ ID NO.47～49)，其中探针SEQ ID NO.22用5’-VIC荧光基团和3’-BHQ1标记，探针SEQ ID NO.49用5’-FAM荧光基团和3’-MGB标记)，以及TaKaRa Ex HotStart Version按照说明书配制双重PCR反应，各引物浓度为200～400nM，探针浓度为200nM，酶浓度为0.025U/μL，PCR buffer终浓度为1×，取2μL上述步骤18)的洗脱液作为扩增模板，进行荧光PCR反应，扩增程序为95℃预变性2min，95℃变性8s，60℃退火及延伸30s，共50个循环。
3.结果分析
上述36例受试者血浆样本检测结果显示，本试剂盒对7例胃癌患者有100％的检出率，同时能够特异性区分10肠癌患者和19例健康体检人群，实现胃癌的特异性、灵敏性检测。受试者工作曲线分析(软件：GraphPad Prism7.0)显示，曲线下面积(AUC)为1.00，在合适的阳性阈值下，检测的灵敏度(Sensitivity)为100.00％(95％CI：59.04％～100％)，特异性(Specificity)为96.43％(95％CI：81.65％～99.91％)。详见图8～9。
实施例4Reprimo和CABIN1双基因联合分析或CABIN1单基因分析相较于Reprimo单基因分析可实现对胃癌更灵敏的检出
1.主要试剂和材料
1)磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司，用于提取0.9～2mL的血浆游离DNA样本；
2)甲基化检测样本前处理试剂盒(离心柱法)(中山市百慧生物有限公司)用于血浆游离DNA样本的亚硫酸氢盐转化；
3)无水乙醇；
4)TaKaRa Ex Hot Start Version用于荧光PCR扩增。
2.具体实施步骤
血浆游离DNA提取
1)在15mL离心管中加入0.9～2mL血浆，依次加入1.5倍血浆体积的裂解液(GHH)、0.1倍血浆体积的蛋白酶K和25～30μL磁珠。
2)涡旋振荡混匀后室温孵育20min，期间每3-5min上下颠倒混匀10sec。孵育结束后简短离心。
3)将离心管置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心倾倒液体，倾倒完后用移液枪小心移除剩余的液体。
4)加入750μl缓冲液GDF(确保已加乙醇)吹打混匀，转移至新的1.5ml离心管，涡旋振荡混匀。置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附后小心倾倒液体，倾倒完后用移液枪小心移除剩余的液体。
5)加入750μl漂洗液PWG(确保已加乙醇)吹打混匀后，涡旋振荡混匀。
6)置于磁力架上1min后，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
7)重复步骤5、6，再洗一次，并尽量小心的移除所有的液体。
8)磁力架上开盖室温晾干5min。
9)加入50μl洗脱缓冲液TBC，用移液枪吹打使磁珠重新悬浮，放置在56℃的金属块中，加热5min使磁珠上的DNA充分洗脱，每隔2两分钟振荡一次。便携式离心机离心样本后置于磁力架上，静置2min。
10)待磁珠完全吸附后转移液体至新的2ml离心管，用于后续实验或-20℃保存。
游离DNA的甲基化转化
11)配制亚硫酸氢盐转化液：取750μL的水、190μL亚硫酸氢盐转化液B到亚硫酸氢盐转化液A的棕色管内，涡旋振荡混匀充分溶解待用。
12)在0.2ml离心管内，依次加入40μL步骤10)提取的游离DNA和步骤11)的110μL亚硫酸氢盐转化液，吹打混匀瞬离后，置于PCR仪开始转化。98℃孵育5min使DNA变性；98℃孵育5min，64℃孵育30min共计3个循环；结束后4℃保持。
13)在吸附柱内加入600μL结合液，进一步将步骤12)转化完成的150μL样本转移到吸附柱内，上下颠倒混匀，13000rcf离心30秒，去废液。
14)向吸附柱加入200μL洗涤液(确保已加乙醇)，13000rcf离心30秒。
15)加入200μL处理液(确保已加乙醇)，室温静置孵育20min。孵育结束后，13000rcf离心30秒。
16)向吸附柱加入200μL洗涤液，13000rcf离心30秒。
17)重复步骤16，再洗一次。去除废液。
18)将吸附柱内的核酸结合柱放入一个干净的1.5ml的离心管内，开盖静置2min以去除可能的乙醇残留。加入20μL T洗脱液，静置5min，13000rcf离心30秒，洗脱的DNA用于后续实验。
荧光PCR扩增
19)使用Reprimo基因、CABIN1基因和Alu-C4内参基因的特异性上下游引物和探针(SEQ ID NO.14～16、SEQ ID NO.29～31、SEQ IDNO.47～49，其中探针SEQ ID NO.16用5’-VIC荧光基团和3’-BHQ1标记，探针SEQ ID NO.31用5’-CY5荧光基团和3’-BHQ1标记，探针SEQ ID NO.49用5’-FAM荧光基团和3’-MGB标记)，以及TaKaRa Ex Hot StartVersion按照说明书配制三重PCR反应，各引物终浓度为200～500nM，各探针终浓度为150～200nM，酶终浓度为0.05U/μL，PCR buffer终浓度为1×，取2μL上述步骤18)的洗脱后DNA作为扩增模板，进行荧光PCR反应。扩增程序为95℃变性8s，60℃退火30s，72℃延伸10s，共45个循环。
3.结果分析
本实施例中检测了8例胃癌患者、2例胃癌术后患者和14例临床阴性受试者的血浆样本。
在三重荧光PCR反应体系中，基于单基因的△Ct值(△Ct值＝Reprimo或CABIN1 Ct值-Alu-C4 Ct值)或双基因双△Ct值(双△Ct值＝Reprimo Ct值+CABIN1 Ct值-2*Alu-C4Ct值)，受试者工作曲线分析(分析软件：GraphPad Prism7.0)显示，Reprimo单基因分析、CABIN1单基因分析和双基因联合分析方法，曲线下面积(AUC)分别为0.7679、1.000、0.9732。在合适的阳性阈值下，Reprimo单基因分析、CABIN1单基因分析和双基因联合分析检测的灵敏度分别为62.50％(95％CI:30.57％～86.32％)、100.00％(95％ CI:67.56％～100.00％)、87.50％(95％CI:52.91％～97.76％)，特异性分别为100.00％(95％ CI:78.47％～100.00％)、92.86％(95％ CI:68.53％～98.73％)、100.00％(95％ CI:78.47％～100.00％)。由此可见，CABIN1单基因或Reprimo和CABIN1基因联合的性能优于Reprimo单基因的分析性能。详见图10～13。(上述95％置信区间上下限为Wilson置信区间法计算)
需要注意的是，受限于样本人群和数量，上述检测结果的阳性阈值可能发生变化。但是可以预见的是在Reprimo单基因的基础上，加入CABIN1靶标可以可以显著提高胃癌人群的阳性检出率，同时保证足够的特异性，进一步提示了本发明所选择双靶标的优势。
此外，对于2例胃癌术后患者的检测，Reprimo单基因、CABIN1单基因各自有50％的检出率，提示本发明在胃癌患者术后疗效监测方面的可能应用。
根据本公开内容，不需要过度实验就可以制备和使用本文中所公开和要求保护的所有试剂、试剂盒和方法。尽管已经就优选实施方案描述了试剂如引物、探针、试剂盒和方法，但本领域技术人员应显而易见，可在不背离本发明的理念、精神和范围的情况下对本文中所描述的试剂、试剂盒和方法以及方法中的步骤或步骤顺序施加变化。例如，可以根据Reprimo基因、CABIN1基因、所述内参基因的序列以及本申请的公开内容，如实施例中所公开的Reprimo基因、CABIN1基因的启动子区域CpG在AGS胃癌细胞系中的甲基化情况，对所检测的核苷酸序列SEQ ID NO.1-11以及本发明的引物序列和探针序列作出适当调整和修改。这些经过修改的待检测序列以及引物序列和探针序列仍可以用于检测所述基因的甲基化情况。认为对本领域技术人员显而易见的所有此类相似的取代和修改都在如由所附权利要求所限定的本发明精神、范围和理念之内。
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Claims (10)
1.一种用于胃癌诊断和筛查的试剂盒，其包括用于检测Reprimo基因和/或CABIN1基因的启动子区域CpG甲基化的试剂；
优选地，所检测的Reprimo基因的核苷酸序列选自如SEQ ID NO.1、2、3、4和5所示的核苷酸序列；更优选地，所检测的Reprimo基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所检测的CABIN1基因的核苷酸序列选自如SEQ ID NO.6、7、8、9、10和11所示的核苷酸序列；更优选地，所检测的CABIN1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于检测内参基因Alu-C4或ACTB甲基化的试剂；
优选地，所检测的内参基因Alu-C4的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
优选地，所检测的内参基因ACTB的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述试剂包括上游引物、下游引物和/或探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中：
所述用于检测Reprimo基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.1甲基化的试剂包括或者是选自如SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.16所示核苷酸序列的探针；和/或
所述用于检测Reprimo基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.2甲基化的试剂包括或者是选自如SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.18所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的探针；和/或
所述用于检测Reprimo基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.3甲基化的试剂包括或者是选自如SEQ ID NO.20所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.22所示核苷酸序列的探针；和/或
所述用于检测Reprimo基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.4甲基化的试剂包括或者是选自如SEQ ID NO.23所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.24所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.25所示核苷酸序列的探针；和/或
所述用于检测Reprimo基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.5甲基化的试剂包括或者是选自如SEQ ID NO.26所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.27所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.28所示核苷酸序列的探针；和/或
所述用于检测CABIN1基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.6甲基化的试剂包括或者是选自如SEQ ID NO.29所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.30所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.31所示核苷酸序列的探针；和/或
所述用于检测CABIN1基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.7甲基化的试剂包括或者是选自如SEQ ID NO.32所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.33所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.34所示核苷酸序列的探针；和/或
所述用于检测CABIN1基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.8甲基化的试剂包括或者是选自如SEQ ID NO.35所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.36所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.37所示核苷酸序列的探针；和/或
所述用于检测CABIN1基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.9甲基化的试剂包括或者是选自如SEQ ID NO.38所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.39所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.40所示核苷酸序列的探针；和/或
所述用于检测CABIN1基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.10甲基化的试剂包括或者是选自如SEQ ID NO.41所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.42所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.43所示核苷酸序列的探针；和/或
所述用于检测CABIN1基因的启动子区域核苷酸序列SEQ ID NO.11甲基化的试剂包括或者是选自如SEQ ID NO.44所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.45所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.46所示核苷酸序列的探针；和/或
所述用于检测内参基因Alu-C4甲基化的试剂包括或者是选自如SEQID NO.47所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.48所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.49所示核苷酸序列的探针；和/或
所述用于检测内参基因ACTB甲基化的试剂包括或者是选自如SEQID NO.50所示核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.51所示核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.52所示核苷酸序列的探针。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的试剂在制备用于胃癌及其早期癌前病变的诊断和筛查的试剂盒中的用途。
6.一种用于胃癌诊断和筛查的方法，其包括以下步骤：
1)提取样本DNA；和
2)测定Reprimo基因的启动子区域中选自如SEQ ID NO.1-5所示的核苷酸序列和/或CABIN1基因的启动子区域中选自如SEQ ID NO.6-11所示的核苷酸序列的CpG甲基化情况。
7.根据权利要求6所述的方法，还包括以下步骤：
1)将提取的样本DNA用重亚硫酸盐转化；和
2)使用权利要求1-4中任一项所述的试剂盒对步骤1)得到的样本DNA进行实时荧光定量PCR扩增，检测荧光信号并判定结果。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中使用权利要求1-4中任一项所述的试剂，对Reprimo基因和/或CABIN1基因的启动子区域中的所述核苷酸序列进行检测。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的试剂盒、用途或方法，其中所述Reprimo基因、CABIN1基因和/或内参基因的甲基化通过荧光PCR法来检测。
10.根据权利要求9所述的试剂盒、用途或方法，其中所述探针带有荧光标记；优选地所述荧光标记选自FAM、TAMRA、VIC、BHQ1、CY3、CY5和MGB。
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