CN111763719A - 用于tert基因全外显子二代测序的多重pcr引物组合物、试剂及控制系统 - Google Patents
用于tert基因全外显子二代测序的多重pcr引物组合物、试剂及控制系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及控制系统。其中用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物包括SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:50所示的引物。本发明提供的所述用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及控制系统，解决了以下现有的技术问题:1.现有技术主要检测TERT基因启动子的点突变，检测范围有限；2.实时荧光定量PCR检测、基因芯片只能检测已知位点；3.Sanger测序检验长度小于800bp的范围；4.检测多个位点时操作繁琐、费用高；5.不能检测低频突变。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及控制系统。
背景技术
TERT（telomerase reverse transcriptase,端粒酶逆转录酶）是指的端粒酶里面具有逆转录酶活性的催化亚基，是端粒酶的重要催化部分，影响着端粒的调控机理，从而维持细胞的永生化和致癌。TERT基因位于第5号染色体，其转录本NM_001193376.1具有15个外显子，外显子全长3275bp，TERT基因突变在黑色素瘤、脂肪瘤、肝细胞瘤、神经胶质瘤等恶性肿瘤中都有一定的检出率，且阳性患者的预后大多不良，是相关肿瘤的生物标记。
关于TERT基因的突变，目前已知研究较多的是能够增强TERT启动子活性的C228T和C250T两个点突变。
现有技术的TERT基因突变检测多为针对TERT基因启动子活性的C228T和C250T位点进行检测，存在以下局限性：1.实时荧光定量PCR检测和基因芯片检测，不能检测未知位点；2.Sanger测序的检测位点局限在800bp以内；3.涉及多个位点检测时，原有技术操作繁琐、费用高；4.不能检测低频突变。
发明内容
为解决现有技术的TERT基因突变检测多为针对TERT基因启动子活性的C228T和C250T位点进行检测，存在多种局限性的技术问题，本发明提供一种解决上述问题的用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及控制系统。
用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物包括SEQ ID NO：01~ SEQID NO：50所示的全部引物。
用于TERT基因全外显子二代测序的试剂包括上述的多重PCR引物组合物以及二代测序所需试剂。
引物组合物在进行多重PCR扩增前，先将SEQ ID NO：01~ SEQ ID NO：02、SEQ IDNO：05~ SEQ ID NO：06、SEQ ID NO：09~ SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：19~ SEQ ID NO：20、SEQID NO：23~ SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：41~ SEQ ID NO：48所示的引物记为A类；
将SEQ ID NO：03~ SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：07~ SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：15~ SEQID NO：18、SEQ ID NO：21~ SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：31~ SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49~SEQ ID NO：50所示的引物记为B类；
将所述A类、所述B类分别取2ul等比混合、分别补水至200ul后，再分别按相对应的体系进行多重PCR扩增，产物加于一管，进行凝胶电泳鉴定产物长度可直接用于Ion Proton后，进行后续实验。
用于TERT基因全外显子二代测序的控制系统包括：
检测模块，采用上文所述的用于TERT基因全外显子二代测序的试剂进行多重PCR二代测序；
显示模块，将检测结果转换为可视化数据，并将可视化的数据于显示设备进行展示；
分析模块：基于预设的质控程序对检测结果进行验证，并将验证结果于同一显示设备进行展示。
其中，运行所述检测模块包括以下步骤：
步骤一：将全部的引物分为两组，分别震荡混匀备用；
步骤二：两组引物分别进行多重PCR扩增；
步骤三：两组引物共同进行凝胶电泳；
步骤四：文库构件，包括PCR产物纯化、末端修复、接头连接、片段筛选、文库PCR扩增、文库扩增产物纯化；
步骤五：测定DNA产物浓度；
步骤六：将扩增子碱基数*给定的深度，按计算结果将样品混合后稀释到上机浓度；
步骤七：油包水扩增、末班序列富集；
步骤八：基于Ion Proton测序仪进行测序，获得检测结果。
所述显示模块将步骤八中的检测结果转化为包括“5号染色体概图”、“测序结果”、“参考序列”三项数据的图表。
所述分析模块直接以所述显示模块转化得到的图表为原始数据，与预设的数据进行对比，并向所述显示模块输出检测结果。
相较于现有技术，通过采用本发明提供的所述用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物，基于二代测序的平台，利用靶向扩增技术进行多重PCR，实现了对TERT基因的全外显子二代测序，具有以下优点：1.能够100%覆盖TERT基因的全外显子区域，能够全面、准确的检测待测样本TERT基因的突变情况；2.能够检测出Sanger测序、实时荧光定量PCR、基因芯片所不能检测出的低频突变，具有较高的学术价值，能更好地服务于临床。
由于本发明提供的所述用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物中引物量较大，在本发明提供的所述用于TERT基因全外显子二代测序的方法中，将引物分为两类组合，分别进行多重PCR扩增，解决了引物间相互影响，以及因GC含量不同，导致同等条件下扩增效率会不一的问题。
附图说明
图1是多重PCR法 TERT二代测序结果概图；
图2是多重PCR法 TERT二代测序结果细节图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物包括SEQ ID NO：01~ SEQ IDNO：50所示的全部引物。
将50条引物按照每管100p的标准稀释，并将其中SEQ ID NO：01~ SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：05~ SEQ ID NO：06、SEQ ID NO：09~ SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：19~ SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：23~ SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：41~ SEQ ID NO：48所示的引物记为A类；
将SEQ ID NO：03~ SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：07~ SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：15~ SEQID NO：18、SEQ ID NO：21~ SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：31~ SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49~SEQ ID NO：50所示的引物记为B类。
取一个新的1.5ml离心管，将标记为A类的每种引物分别加入2ul，补水至总体积为200ul，记为A类组合物。
再另取一个新的1.5ml离心管，将标记为B类的每种引物分别加入2ul，补水至总体积为200ul，记为B类组合物。
A类组合物、B类组合物分别震荡混匀后，于-20℃保存备用。
用于TERT基因全外显子二代测序的试剂包括上述多重PCR引物组合物及二代测序所需的试剂，具体的内容在以下用于TERT基因全外显子二代测序的方法中说明。
用于TERT基因全外显子二代测序的方法为采用上述的试剂对TERT基因全外显子进行二代测序，包括以下步骤：
1、多重PCR扩增，包括：
1.1、提供多重PCR扩增体系：
A管：加入A类组合物5ul，及缓冲液等其他试剂。
B管：加入B类组合物5ul，及缓冲液等其他试剂。
1.2、A管、B管分别进行多重PCR扩增程序：
2、凝胶电泳：A管、B管产物加入一管，进行凝胶电泳。
3、PCR产物纯化：以1.8X的磁珠比例（磁珠：产物=90:50）进行混合，置于磁力架上，待吸附磁珠后用80%乙醇进行清洗，待乙醇干燥后加入40ulH20进行洗脱。
4、末端修复，包括：
4.1、提供末端修复体系：
4.2、PCR反应：
4.3、纯化：按照1.8X比例纯化，用25ul TE洗脱。
5、接头连接，包括：
5.1、提供接头连接体系：
5.2、接头连接程序：
5.3、纯化：按照1.8X比例纯化，用50ul TE洗脱。
6、片段筛选：采用Beckman A63881 AMPure XP磁珠进行筛选。以1X（磁珠：样本=50:50）的比例混合，5min后取上清加入含10u磁珠的EP管中混合，5min后去上清，加入80%的酒精清洗，用20ul TE溶液洗脱。
另在0.9X的磁珠管中加入80%的酒精清洗，用20ulTE溶液洗脱。
7、文库PCR扩增，包括：
7.1、提供文库PCR扩增体系：
7.2、文库PCR扩增程序：
8、文库扩增产物纯化：以1.8X的磁珠比例（磁珠：产物=90:50）进行混合，置于磁力架上，待吸附磁珠后用80%乙醇进行清洗，待乙醇干燥后加入50ulH20进行洗脱。
9、Qubit浓度测定，包括：
9.1、配置Qubit Mix：
分装到Qubit管中，每管199ul，标准品每管分装190ul。
9.2、测定：
每管对应加入1ul DNA产物，标准品每管分别加入10ul standard1、standard2标准品。接通Qubit® Fluorometer电源，选择dsDNA→dsDNA High Sensitivity选项，按提示顺序加入S1、S2测定管及样品管，记录数据。
10、计算和文库混合：
根据公式
ng/ul=nmol/l*650*size/1000000
故：nmol/l=(1000000*ng/ul)/(650*size)
数据量为3267（扩增子碱基数）*200（给定的深度）=653400 bp =0.623M。
按照计算结果依次将样品混合后稀释到25pmol/L的上机浓度。
11、油包水扩增，包括：
11.1、配置扩增溶液：
| 试剂 | 体积（ul） |
| 乳液PCR缓冲液Ⅰ | 2000 |
| 无核酸酶水 | 80 |
| 乳液PCR酶混合液 | 120 |
| 微珠溶液 | 100 |
| 稀释后的pooling文库 | 100 |
震荡混匀微离心后转移到反应器中。
11.2、扩增程序：
分别在回收管内加入150ul破乳液Ⅱ；
将反应器、回收管以及扩增板放到OT仪上，启动仪器；
待运行完成，离心10min后，保留约100ul溶液；
用移液器反复吹打剩余溶液，充分混匀，将两个收集管中的液体全部转移到新的1.5ml低吸附管中；
往每个收集管加入200ul无核酸酶水吹吸混匀，再次转移到上部的1.5ml低吸附管中，直到低吸附管中达到1ml；
低吸附管按照15，500g，离心8min。保留20ul溶液。再加入重悬液重悬。
12、末班序列富集，包括：
12.1、配制洗脱液：
| 试剂 | 体积（ul） |
| 吐温溶液 | 280 |
| 1M NaOH | 40 |
| 总体积 | 320 |
12.2、Beads洗涤：取100ul C1 磁珠，上磁力架静置2min, 弃上清；加1000ul清洗液混匀，上磁力架静置2min，弃上清；加入130ul C1磁珠捕获液混匀备用。
12.3、富集
按照如上表所示加入对应的溶液，运行ES仪。
12.4、ES下机处理：15500g离心5min；留10ul；加200ul NF水混匀，15500g离心5min；留10ul，加90ul NF水混匀，4℃保存。
13、上机，包括：
13.1、准备上机文库：在样本微珠溶液中加入质控、退火缓冲液和测序引物，混匀后进行退火。程序：95℃2min，37℃2min,20℃ hold。待程序完成后往样本中加入10ul 上样缓冲液，混匀离心。
13.2、配制上样试剂：
| 试剂 | 配比 |
| 50% AB | 500μl 退火缓冲液+500μl NF 水 |
| 冲洗液 | 500μl 退火缓冲液+500μl异丙 |
| 发泡液 | 49 µL 50% AB + 1µL 发泡液 |
| 酶反应液 | 60 μl50% AB+6μl 测序聚合酶 |
13.3、上样：
取出芯片，往槽内加入55ul ISP样本，离心10min；
用100ul移液枪吹打空气至发泡液中，直到出现致密的小泡；
依次匀速加入发泡液，55ul50%退火缓冲液至芯片内，吸走溢出液体。重复两次；
加入100ul冲洗液两次；
加入100ul50% AB 3次，避免产生气泡，吸走另一孔排出的液体；
加入65ul酶反应液，孵育5min后安装到Thermo的Ion Proton测序仪的芯片槽中。
14、分析数据：
请同时参阅图1、图2，分别是多重PCR法 TERT二代测序结果概图和细节图。测序结果经过去除接头、重复序列、低质量序列等生物信息学处理之后，利用igv软件打开，结果如图1、图2所示。
图中由上至下表示的信息均依次为：“5号染色体概图”、“测序结果”、“参考序列”，由图示可以直观的看出本款引物有效。
实施例2：
通过用于TERT基因全外显子二代测序控制系统，控制专用设备来实施实施例1中所述的用于BRAF基因全外显子二代测序方法。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
序列表
<110> 长沙金域医学检验所有限公司
<120> 用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及控制系统
<130> 0002
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ctcttctgga acggagtctg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
atcagtccag gatggtcttg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
acccacactt gcctgtcct 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gttttccccc agggatgtc 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ccatcctctc aggtttcacg ca 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
caggcacctg cacatacctg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
tcccagagag gtttctaccg 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
cggctcacct gtacgcct 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
accatcagcc tgctcacct 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
acctgtgtct gacattcccc 20
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
gacattcagt ccctcgtaga cag 23
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
ccacagacac acggcacg 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
caggtcctac gtccagtgc 19
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
gcatcaaaag caaatcaacc cc 22
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
ggcaggagag aggtgagca 19
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
cgtctgcttt cgcagagc 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
ctcatgccct ctcctctgcc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
cagacctgct cgatgacgac 20
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
gacacgactg cattctagac acatt 25
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 20
atcaaacccc agaacacgta ct 22
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 21
cttctggacc acggcatac 19
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 22
gtgatgtctg agtttctgcg tg 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 23
cactttcctg actgtctccc a 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 24
ccaccttgac aaagtacagc 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 25
aagctgatac caaatgtggg g 21
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 26
cgtccagact ccgcttcat 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 27
gtccatgttc acaatcggc 19
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 28
gaggggctct ctattgcaga c 21
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 29
aaggggttgg ctgtgttc 18
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 30
ggatacagta cctgattcca atgc 24
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 31
aggtgtcctg cctgaagga 19
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 32
agtgcgtcgg tcaccgtgtt 20
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 33
cgaggccttc accaccagc 19
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 34
ttcgcatccc agacgcctt 19
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 35
ctctttgtgc tggtggctc 19
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 36
cagacttcgg ctggcactg 19
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 37
gaaccatagc gtcagggag 19
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 38
cacggatggg tgggagtg 18
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 39
gtggtttctg tgtggtgtca 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 40
tggaacccag aaagatggtc t 21
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 41
cagcctgact ggcgctcgga 20
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 42
acagacaccg gctgctgggg t 21
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 43
tgctcctcaa gacgcactgc 20
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 44
ggcgttcgtt gtgcctgga 19
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 45
aggtgtacgg cttcgtgc 18
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 46
tcctcacctg ggctcct 17
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 47
agtttcaggc agcgctgcgt cct 23
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 48
agggcacgca caccaggcac t 21
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 49
gctggccacg ttcgtgc 17
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 50
tctccgcatg tcgctggtt 19
Claims (7)
1.一种用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物，其特征在于：包括SEQID NO:01至SEQ ID NO:50所示的引物。
2.一种用于TERT基因全外显子二代测序的试剂，其特征在于：包括权利要求1所述的用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物及二代测序所需试剂。
3.根据权利要求1或2所述的用于TERT基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物，其特征在于：
所述多重PCR引物组合物通过如下处理方法获得：
将SEQ ID NO：01~ SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：05~ SEQ ID NO：06、SEQ ID NO：09~ SEQID NO：14、SEQ ID NO：19~ SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23~ SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：41~SEQ ID NO：48所示的引物记为A类；
将SEQ ID NO：03~ SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：07~ SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：15~ SEQID NO：18、SEQ ID NO：21~ SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：31~ SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49~SEQ ID NO：50所示的引物记为B类；
将所述A类、所述B类分别混合，分别进行多重PCR扩增处理后，产物加于一管，共同进行凝胶电泳鉴定多重PCR的产物长度可直接用于测序仪后，进行后续实验。
4.一种用于TERT基因全外显子二代测序的控制系统，其特征在于，包括：
检测模块，采用权利要求2所述的用于TERT基因全外显子二代测序的试剂进行多重PCR二代测序；
显示模块，将检测结果转换为可视化数据，并将可视化的数据于显示设备进行展示；
分析模块：基于预设的质控程序对检测结果进行验证，并将验证结果于同一显示设备进行展示。
5.根据权利要求4所述的用于TERT基因全外显子二代测序的控制系统，其特征在于：
运行所述检测模块，包括以下步骤：
步骤一：将全部的引物分为两组，分别震荡混匀备用；
步骤二：两组引物分别进行多重PCR扩增；
步骤三：两组引物共同进行凝胶电泳；
步骤四：文库构件，包括PCR产物纯化、末端修复、接头连接、片段筛选、文库PCR扩增、文库扩增产物纯化；
步骤五：测定DNA产物浓度；
步骤六：将扩增子碱基数*给定的深度，按计算结果将样品混合后稀释到上机浓度；
步骤七：油包水扩增、末班序列富集；
步骤八：置于测序仪进行测序，获得检测结果。
6.根据权利要求5所述的用于TERT基因全外显子二代测序的控制系统，其特征在于：
所述显示模块将步骤八中的检测结果转化为包括“5号染色体概图”、“测序结果”、“参考序列”三项数据的图表。
7.根据权利要求6所述的用于TERT基因全外显子二代测序的控制系统，其特征在于：
所述分析模块直接以所述显示模块转化得到的图表为原始数据，与预设的数据进行对比，并向所述显示模块输出检测结果。
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2019
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