CN105087790A - 一种适用于高通量测序的破碎dna的方法 - Google Patents

一种适用于高通量测序的破碎dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种适用于高通量测序的破碎DNA的方法，属于DNA片段制备技术领域。本发明利用超声波清洗仪对多孔PCR板内的DNA进行破碎，使每个PCR孔内待破碎DNA溶液的体积为30μl，同时保持超声波清洗仪内的双蒸水温度在14-18℃，且水面高度为4-4.5cm；根据需要获得的DNA片段的大小选择不同的超声时间。琼脂糖凝胶检测超声波清洗仪破碎后的DNA片段，发现该方法破碎DNA的效果达到国际商业化破碎DNA的效果，与后者相比，本发明方法操作简单，在实现大通量破碎DNA的同时，大大降低耗材、仪器成本，具有良好的市场应用前景和商业价值。

Description

一种适用于高通量测序的破碎DNA的方法
技术领域
本发明涉及基因高通量测序及DNA片段制备技术领域，具体地，涉及一种适用于高通量测序的破碎DNA的方法。
背景技术
在二代和三代测序技术中，构建高质量的测序文库是高通量测序的关键因素。测序文库的质量直接决定测序产出的数据质量，进而对数据分析有着莫大的关联。在测序文库构建的开始，先要对DNA样品进行片段化。目前，DNA片段化的方法有多种，如酶切法、只适应聚焦超声波(AFA，AdaptiveFocusedAcoustics)断裂法等。酶切法根据酶的选择，又可以分为两类，一类是使用特定酶切位点的限制性内切酶进行DNA片段化，另一类是通过酶组合对DNA进行随机断裂。酶切法不仅对样品纯度要求较高，而且对随机性有所限制。只适应聚焦超声波断裂法(AFA)是较为理想的DNA片段化的方法，尤其是Covaris公司出品的超声波断裂DNA的仪器，具有片段化精准，成功率高等特点。但是，Covaris相关产品价格相当高，一个样品的费用为40-60元人民币，包括仪器和耗材，且操作较为繁琐，等待时间较长。因此需要一种新的易于操作的破碎DNA的方法，既能够精准、高效率、高通量破碎片段、又能够大大降低耗材、仪器成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低廉、破碎DNA效果良好、适用于高通量测序的破碎DNA的方法。
本发明提供的一种适用于高通量测序的破碎DNA的方法，包括以下步骤：
(1)将待破碎样品的DNA或DNA的双蒸水溶液加入PCR板的PCR孔中，加入的总体积不超过30μl，盖上配套盖子；
(2)使用超声波清洗仪清洗步骤(1)得到的PCR板破碎其中的样品DNA。
本发明方法中，步骤(1)所述的PCR板为适用于标准PCR仪的PCR板，可根据实际需要选择PCR孔的数目。
进一步地，当所使用的超声波清洗仪的换能器功率为50瓦，且该清洗仪仅有1个换能器时，PCR板的PCR孔数不多于24个。
本发明的实施例中，所使用的超声波清洗仪由江苏苏美电器公司生产，型号为KQ-50E或KQ5200E，具有1个换能器，换能器的功率为50瓦。PCR板为Asygen公司PCR-96-C，PCR板中每个PCR孔的容积为200μl。使用时，从96孔PCR板上剪取4(横或纵)×5(纵或横)＝20个孔。
本发明方法中，步骤(1)中样品DNA的总量为100ng＜和＞20μg，加入的总体积为30μl。
本发明的上述方法中，步骤(2)使用超声波清洗仪时，先向其中加入清水，使水温为14-18℃，再将步骤(1)装有DNA的PCR板放入超声波清洗仪中，使其在清水中漂浮。
所述清水为双蒸水或去离子水。
优选地，超声波清洗仪中的水温为16℃。
为保证PCR板漂浮在水上，本领域技术人员可以采取任何方法实现该目的。在本发明的实施例中，是将PCR板镶嵌入泡沫板的方式使PCR板在水中漂浮。
本发明方法中，步骤(2)的超声波清洗仪破碎DNA的时间为3-15min。发明人研究发现，若破碎时间>15min，则DNA片段大小将集中在200bp，几乎不再减小，而且该样品测序后数据质量不好。
具体地，本发明方法中，超声波作用时间与PCR管内预计破碎获得的DNA片段大小对应关系为：3min对应的破碎的DNA片段主带集中在500bp、5min对应的破碎的DNA片段主带集中在300-400bp、10min对应于DNA片段主带集中在300bp、15min对应于DNA片段主带集中在200-300bp。
本发明提供了上述破碎DNA的方法在构建高通量测序文库中的应用。
本发明的适用于高通量测序的破碎DNA的方法具有以下优点及有益效果：
(1)破碎DNA片段精准，成功率高。
(2)成本低廉，所采用的仪器和耗材均为常规市售产品，较现有的Covaris公司出品的超声波断裂DNA的仪器操作成本大大降低，平均每个样品的破碎DNA成本不足2元。
(3)本发明方法操作简单，仅需添加样品、调节水温水位，控制超声波作用时间即能短时间内完成20个样品的DNA片段的破碎，且可以多个20孔PCR板连续进行超声波破碎DNA实验，较大幅度地提高了高通量测序过程中建库实验的高通量化。
附图说明
图1为本发明实施例1对水稻DNA样品片段化实验(项目号G87，片段大小为500bp)电泳图，图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司G87项目的20个水稻样品，Marker为Takara公司100bpDNALadder，最亮的条带为500bp。图中弥散DNA条带主要集中在500bp。
图2为本发明实施例2对海棠叶片DNA样品片段化实验(片段大小为300-400bp)电泳图，图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司实验员提取的海棠叶片DNA样品，所有电泳泳道均为同一样品，相同用量。Marker为Takara公司100bpDNALadder，最亮的条带为500bp。图中弥散DNA条带主要集中在300-400bp。
图3为本发明实施例2对海棠叶片DNA样品片段化实验(片段大小为200-300bp)电泳图，图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司实验员提取的海棠叶片DNA样品，所有电泳泳道均为同一样品，相同用量。Marker为Takara公司100bpDNALadder，最亮的条带为500bp。图中弥散DNA条带主要集中在200-300bp。
图4为Covaris超声波打断DNA片段大小结果电泳图。，图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司实验员提取的海棠叶片DNA样品，所有电泳泳道均为同一样品，相同用量。Marker为Takara公司100bpDNALadder，最亮的条带为500bp。图中180bp泳道样品弥散DNA条带主要集中在200-300bp，300bp泳道样品弥散DNA条带主要集中在300-400bp，500bp泳道样品弥散DNA条带主要集中在500bp。
图5A和图5B为本发明实施例2对海棠叶片DNA样品在不同体积条件下进行片段化实验电泳图。图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司实验员提取的海棠叶片DNA样品，所有电泳泳道均为同一样品，相同用量。Marker为Takara公司100bpDNALadder，最亮的条带为500bp。图中显示，在30μl体系时，各孔内DNA破碎程度较为均一。
图6为本发明实施例2对海棠叶片DNA样品在不同温度条件下进行片段化实验电泳图。图中所使用样品为北京百迈客生物科技有限公司实验员提取的海棠叶片DNA样品，所有电泳泳道均为同一样品，相同用量。Marker为Takara公司100bpDNALadder，最亮的条带为500bp。图中显示，在16℃时，DNA破碎后弥散条带最接近500bp。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。超声波清洗仪由江苏苏美电器公司生产，型号为KQ-50E或KQ5200E，具有1个换能器，换能器的功率为50瓦。PCR板为Asygen公司PCR-96-C，PCR板中每个PCR孔的容积为200μl。
实施例1本发明的适用于高通量测序的破碎DNA的方法(1)
1.从标准96孔PCR板上剪取4×5＝20孔；
2.根据样品检测浓度，依次取5μg(NanoDrop2000检测)水稻DNA加入到20孔PCR板内；
3.使用无菌ddH2O补充至每孔总体积30ul，并扣上配套盖子；
4.向KQ-50E内加入常温ddH2O，并用冰块调节水温为16℃，使KQ-50E内水面高度至4-4.5cm；
5.把含有DNA样品的20孔PCR板插入泡沫浮漂，放入KQ-50E超声波清洗仪，左上方紧靠清洗仪内壁；
6.超声波作用3min；
7.取出超声波作用后样品各3μl，用1.8％琼脂糖凝胶电泳检测，120V，35min，凝胶成像仪下成像观察，并保存图片(图1)；
8.电泳结果与图4进行比较，打断效果一致。由于破碎的DNA是一个弥散区域，判断标准是找出弥散区域的中心集中位置，也叫主带集中位置。使用过程中，需要的目的片段大小的不同，会导致弥散范围大小不同。目的片段越小，弥散范围相对较小；反之，弥散范围较大，图4中，180bp泳道弥散范围小于500bp泳道。
实施例2本发明的适用于高通量测序的破碎DNA的方法(2)
1.从标准96孔PCR板上剪取4×5＝20孔，制备两块该规格的PCR板；
2.根据样品检测浓度，依次取2.5μg(NanoDrop2000检测)海棠叶片DNA加入到20孔PCR板内；
3.使用无菌ddH2O补充至总体积30μl，并扣上配套盖子；
4.向KQ-50E内加入常温ddH2O，并用冰块调节水位至16℃，使KQ-50E内水面高度至4-4.5cm；
5.把含有DNA样品的20孔PCR板插入泡沫浮漂，放入KQ-50E超声波清洗仪，左上方紧靠清洗仪内壁；
6.第一块PCR板超声波作用10min、第二块PCR板超声波作用15min。
7.取出超声波作用后样品各3μl，用1.8％琼脂糖凝胶电泳检测，120V，35min，凝胶成像仪下成像观察，并保存图片，见图2、3；
8.电泳结果与图4进行比较，打断效果一致。
实施例3PCR孔内不同添加量对结果的影响
1.从标准96孔PCR板上剪取4×5＝20孔，制备四块该规格的PCR板；
2.根据样品检测浓度，依次取2.5μg(NanoDrop2000检测)海棠叶片DNA加入到20孔PCR板内；
3.使用无菌ddH2O将上述20孔PCR板依次补充至总体积16、22、30、44、55μl，并扣上配套盖子；
4.向KQ-50E内加入常温ddH2O，并用冰块调节水位至16℃，使KQ-50E内水面高度至4-4.5cm；
5.把含有DNA样品的20孔PCR板插入泡沫浮漂，放入KQ-50E超声波清洗仪，左上方紧靠清洗仪内壁；
6.超声波作用3min；
7.取出超声波作用后样品各3μl，用1.8％琼脂糖凝胶电泳检测，120V，35min，凝胶成像仪下成像观察，见图5A和图5B；
图中显示在PCR孔中加入样品的总体积为30μl时，20个样品打断后片段集中位置较为均一，较其它体积的样品间一致性好。
实施例4超声清洗仪内不同水温对结果的影响
1.从标准96孔PCR板上剪取4×5＝20孔，制备四块该规格的PCR板；
2.根据样品检测浓度，依次取2.5μg(NanoDrop2000检测)海棠叶片DNA加入到20孔PCR板内指定的同一位置的孔；
3.使用无菌ddH2O补充至总体积30μl，并扣上配套盖子；
4.向KQ-50E内加入常温ddH2O，使KQ-50E内水面高度至4-4.5cm；第一块用常温条件下打断，第二块在水温为10℃条件下打断，第三块在16℃条件下打断，第四块在冰水混合物条件下打断；
5.把含有DNA样品的20孔PCR板插入泡沫浮漂，放入KQ-50E超声波清洗仪，左上方紧靠清洗仪内壁；
6.超声波作用3min；
7.取出超声波作用后样品各3μl，用1.8％琼脂糖凝胶电泳检测，120V，35min，凝胶成像仪下成像观察，并保存图片(图6)；图中显示，水温过低，导致DNA片段不容易破碎，电泳结果呈现集中带较大的弥散区域；水温过高，DNA易破碎，同样时间内，DNA破碎成小的片段，电泳图显示弥散区域偏小，只有当水温在16℃左右时，电泳显示的弥散区域最集中。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种适用于高通量测序的破碎DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待破碎样品的DNA或DNA的双蒸水溶液加入PCR板的PCR孔中，加入的总体积不超过30μl，盖上配套盖子；
(2)使用超声波清洗仪清洗步骤(1)得到的PCR板破碎其中的样品DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的PCR板为适用于标准PCR仪的PCR板，可根据实际需要选择PCR孔的数目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当超声波清洗仪的换能器功率为50瓦，且该清洗仪仅有1个换能器时，PCR板的PCR孔数不多于24个。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中样品DNA的质量为＞100ng，加入的总体积为30μl。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)使用超声波清洗仪时，先向其中加入清水，使水温为14-18℃，再将步骤(1)装有DNA的PCR板放入超声波清洗仪中，使其在清水中漂浮。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述清水为双蒸水或去离子水。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，可以将PCR板镶嵌入泡沫板的方式使PCR板在水中漂浮。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，超声波清洗仪中的水温为16℃。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)的超声波清洗仪破碎DNA的时间为3-15min。
10.权利要求1-9任一所述的方法在构建高通量测序文库中的应用。
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