CN112359101B

CN112359101B - 一种质检寡核苷酸交叉污染的方法

Info

Publication number: CN112359101B
Application number: CN202011270971.XA
Authority: CN
Inventors: 张丹丹; 李心如; 陈业; 吴昕; 廖国娟
Original assignee: Genewiz Suzhou Ltd
Current assignee: Genewiz Suzhou Ltd
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2040-11-13
Also published as: WO2022099794A1; CN112359101A

Abstract

本发明提供了一种质检寡核苷酸交叉污染的方法，所述方法包括：采用第一引物对对外源DNA进行第一轮PCR扩增，得到第一扩增产物，采用第二引物对对第一扩增产物进行第二轮PCR扩增，得到第二扩增产物；对所述第二扩增产物进行文库构建和二代测序，根据测序结果质检寡核苷酸的交叉污染率。本发明采用特殊设计的引物对与寡核苷酸同一性低的基因组DNA进行两轮PCR扩增，待寡核苷酸作为引物添加到扩增子上，进行Illumina测序，通过分析测序读长上标签序列的种类和数量，实现了快速准确分析不同寡核苷酸之间的交叉污染率的目的。

Description

一种质检寡核苷酸交叉污染的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种质检寡核苷酸交叉污染的方法。

背景技术

目前，高通量测序技术主要指LifeTech、Illumina和华大基因推出的第二代测序技术以及Nanopore和PacificBiosciences推出的单分子测序技术。高通量测序技术可以对数百万个DNA分子同时进行测序，一次平行检测几百甚至上千个样本。高通量测序技术有定量功能，样本中某条序列被测序的次数即反映了该序列在样本中的丰度。高通量测序技术的测序深度大，对于一条序列，可以读取几万甚至几十万次。

高通量测序技术对测序引物的要求高，引物的交叉污染率要求低于0.1％，任何污染都有可能造成背景噪音强或结果拼接错误。然而，目前尚没有有效的方法质控合成的寡核苷酸的交叉污染率，供应商主要采取严格的生产工艺来避免寡核苷酸间的交叉污染。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种质检寡核苷酸交叉污染的方法，根据寡核苷酸序列设计引物，采用特殊设计的引物对与寡核苷酸同一性低的基因组DNA进行两轮PCR扩增，待寡核苷酸作为引物添加到扩增子上，进行Illumina测序，分析不同寡核苷酸之间的交叉污染率。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种质检寡核苷酸交叉污染的方法，所述方法包括：

采用第一引物对对外源DNA进行第一轮PCR扩增，得到第一扩增产物，采用第二引物对对第一扩增产物进行第二轮PCR扩增，得到第二扩增产物；

对所述第二扩增产物进行文库构建和二代测序，根据测序结果质检寡核苷酸的交叉污染率；

其中，所述第一引物对包括第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物为外源DNA特异性上游引物，所述第一下游引物从5’到3’包括寡核苷酸3’序列和外源DNA特异性下游引物；

所述第二引物对包括第二上游引物和第二下游引物，所述第二上游引物为外源DNA特异性上游引物，所述第二下游引物为寡核苷酸序列；

所述外源DNA与所述寡核苷酸的同一性不高于80％。

本发明中，采用第一引物对对与寡核苷酸同一性低的外源DNA序列进行PCR扩增，得到的第一扩增产物上添加了寡核苷酸3’序列；采用第二引物对对第一扩增产物进行PCR扩增，得到的第二扩增产物整合了寡核苷酸和外源DNA序列；对第二扩增产物进行文库构建和Illumina测序，以外源DNA序列和寡核苷酸作为参考序列，利用生物信息学方法分析得到不同寡核苷酸间的交叉污染率。

优选地，所述寡核苷酸从5’到3’包括5’固定序列、可变碱基序列和3’固定序列，不同寡核苷酸间5’固定序列和3’固定序列相同，而中间可变碱基序列不同。

优选地，所述外源DNA的长度为200～500bp，例如可以是200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp或500bp。

优选地，所述第一上游引物和所述第二上游引物包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列；

SEQ ID NO:1：

CGAGGCGATAGGGTTAAGGGAAGGCGGACGCCTGATGGGTTAATGA。

优选地，所述第一下游引物包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列；

SEQ ID NO:2：

CAACTCCTTGGCTCACAAAATGGAGCGCAGGTTGGAA。

优选地，所述第二下游引物包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列，其中，N代表产生序列间差异的可变碱基；

SEQ ID NO:3：

AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATNNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACA。

优选地，所述外源DNA包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列，与寡核苷酸的同一性不高于80％；

SEQ ID NO:4：

CGAGGCGATAGGGTTAAGGGAAGGCGGACGCCTGATGGGTTAATGAGCAAACTGAAGTGTTTTCCATGATCTTTTTTGAGGTAGGGCTGTTTACTGTCACCACCCCTGTCGGATTTTACTTCCTAAACGTACCTGTAACTATCCACTTCTCTCCATCTCTTCTGGCACCACCCTGGTTAAAGACACCATCATGTGTCGCCAAGACAGCCGCAGTAGCTTCTTAATGGCTCTCCCTGCCTCTACTTTTGCCTCTTCCAACCTGCGCTCCATTT。

优选地，所述第一轮PCR扩增的条件为92～98℃预变性1～5min，92～98℃变性10～30s、55～65℃退火10～30s、70～75℃延伸10～30s，30～40个循环，70～75℃延伸3～5min，0～4℃保存。

优选地，所述第二轮PCR扩增的条件为92～98℃预变性1～5min，92～98℃变性10～30s、55～65℃退火10～30s、70～75℃延伸10～30s，30～40个循环，70～75℃延伸5～10min，0～4℃保存。

优选地，所述文库构建包括对第二扩增产物进行末端修复、接头连接和PCR扩增的步骤。

优选地，所述PCR扩增的条件为92～98℃预变性1～5min，92～98℃变性10～30s、55～65℃退火10～30s、70～75℃延伸10～30s，3～6个循环，70～75℃延伸5～10min，0～4℃保存。

优选地，所述根据测序结果质检寡核苷酸的交叉污染率包括：

对原始测序数据进行去除接头处理后，统计测序读长中标签序列的种类和数量，根据异常标签序列数占总标签序列数的比例，计算寡核苷酸的交叉污染率；

其中，所述标签序列为测序读长中的一段外源DNA和可变碱基序列的组合。

优选地，所述标签序列为测序读长中靠近寡核苷酸的一段外源DNA和寡核苷酸的可变碱基序列的组合。

优选地，所述标签序列中外源DNA的长度为8～12bp，例如可以是8bp、9bp、10bp、11bp或12bp，优选为10bp。

优选地，所述标签序列中可变碱基序列的长度为8～12bp，例如可以是8bp、9bp、10bp、11bp或12bp，优选为10bp。

作为优选技术方案，所述质检寡核苷酸交叉污染的方法包括以下步骤：

(1)采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的第一引物对对外源DNA SEQ ID NO:4进行第一轮PCR扩增，所述第一轮PCR扩增的条件为92～98℃预变性1～5min，92～98℃变性10～30s、55～65℃退火10～30s、70～75℃延伸10～30s，30～40个循环，70～75℃延伸3～5min，0～4℃保存，得到第一扩增产物；

(2)采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的第二引物对对第一扩增产物进行第二轮PCR扩增，所述第二轮PCR扩增的条件为92～98℃预变性1～5min，92～98℃变性10～30s、55～65℃退火10～30s、70～75℃延伸10～30s，30～40个循环，70～75℃延伸5～10min，0～4℃保存，得到第二扩增产物，所述第二扩增产物为整合有寡核苷酸和外源DNA的扩增子；

(3)对所述第二扩增产物进行末端修复、接头连接和PCR扩增，所述PCR扩增的条件为92～98℃预变性1～5min，92～98℃变性10～30s、55～65℃退火10～30s、70～75℃延伸10～30s，3～6个循环，70～75℃延伸5～10min，0～4℃保存，构建文库进行二代测序；

(4)对原始测序数据进行去除接头处理后，统计测序读长中标签序列的种类和数量，计算寡核苷酸的交叉污染率，其中，所述标签序列为测序读长中靠近寡核苷酸的一段8～12bp外源DNA和寡核苷酸的8～12bp可变碱基序列的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明为了对序列相似度高的化学合成寡合苷酸进行质量控制，检测寡核苷酸间的交叉污染率，根据寡核苷酸序列设计引物，采用特殊设计的引物对与寡核苷酸同一性低的外源DNA序列进行两轮PCR扩增，待寡核苷酸作为引物添加到扩增子上，进行Illumina测序；

(2)本发明对原始测序数据进行去除接头处理后，统计测序读长中标签序列的种类和数量，根据异常标签序列数占总标签序列数的比例，分析不同寡核苷酸之间的交叉污染率；

(3)本发明的质检方法操作简便、高效，准确性高，有助于有效降低合成的寡核苷酸交叉污染率，提升生产工艺和生产效率。

附图说明

图1为质检寡核苷酸交叉污染的原理示意图；

图2为Agilent2100生物片段分析仪对测序文库的检测结果；

图3为96条合成的寡核苷酸在96孔板上的交叉污染分布；

图4为96条合成的寡核苷酸的交叉污染检测热图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1质检寡核苷酸交叉污染的原理

为了对序列相似度高的化学合成寡合苷酸进行质量控制，检测寡核苷酸间的交叉污染率，本实施例构建了一种质检寡核苷酸交叉污染的方法，原理示意图如图1所示：

选取和寡核苷酸同一性低于80％的一段外源DNA序列，利用第一引物对进行PCR扩增，其中，第一上游引物为外源DNA特异性上游引物，第一下游引物的5’部分为寡核苷酸3’序列、3’部分为外源DNA特异性下游引物，得到的第一扩增产物上添加了寡核苷酸3’序列；

利用第二引物对对第一扩增产物进行PCR扩增，其中，第二上游引物为外源DNA特异性上游引物，第二下游引物为寡核苷酸序列，得到的第二扩增产物为整合了寡核苷酸和外源DNA序列的扩增子；

对所述扩增子进行文库构建和Illumina测序，将获得的原始测序数据进行去除接头、去除低质量读长处理后，选取测序读长上最靠近寡核苷酸的一段外源DNA和寡核苷酸的一段可变碱基序列，组合形成每条读长的标签序列，统计测序读长中标签序列的种类和数量，根据异常标签序列数占总标签序列数的比例，分析不同寡核苷酸间的交叉污染率。

实施例2基于PCR构建整合有寡核苷酸和外源DNA序列的扩增子

本实施例对96条化学合成寡合苷酸进行质量控制，96条寡核苷酸具有5’固定序列和3’固定序列，中间N碱基不同，示意如下：

5’-AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATNNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACA-3’；

根据待检测的96条寡核苷酸，选择同一性低于80％的外源DNA序列(SEQ ID NO:4)，设计(第一和第二)上游引物SEQ ID NO:1、第一下游引物SEQ ID NO:2和第二下游引物SEQ ID NO:3，

SEQ ID NO:1：

CGAGGCGATAGGGTTAAGGGAAGGCGGACGCCTGATGGGTTAATGA；

SEQ ID NO:2：

CAACTCCTTGGCTCACAAAATGGAGCGCAGGTTGGAA；

SEQ ID NO:3：

AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAATNNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACA；

SEQ ID NO:4：

配制表1所示的第一轮PCR反应体系，按照表2条件进行PCR扩增，得到第一扩增产物；

表1

成分	体积(μL)
		水	35
5×扩增缓冲液	10
		上游引物	1
第一下游引物	1
		外源DNA序列模板	2
DNA聚合酶	1

表2

利用磁珠法对第一扩增产物进行纯化，向50μL第一扩增产物加入35μL磁珠，震荡混匀后室温孵育5min，离心；将反应管置于磁力架上磁吸附，待溶液澄清后，移除上清液；保持反应管置于磁力架上，加入200μL新鲜配制80％乙醇进行清洗，室温孵育30s，移除上清液，重复两次后，打开管盖干燥5～10min；从磁力架上取出反应管，加入22.5μL超纯水，室温静置2min，置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取20μL上清液进行核酸浓度检测和琼脂糖凝胶电泳检测。

结果发现，纯化后的第一扩增产物纯度高，片段约290bp，将检测合格的第一扩增产物分装后冻存于-80℃中。

配制表3所示的第二轮PCR反应体系，按照表4条件进行PCR扩增，得到第二扩增产物；

表3

表4

利用磁珠法对第二扩增产物进行纯化，向50μL第二扩增产物加入30μL磁珠，震荡混匀后室温孵育5min，离心；将反应管置于磁力架上磁吸附，待溶液澄清后，移除上清液；保持反应管置于磁力架上，加入200μL新鲜配制80％乙醇进行清洗，室温孵育30s，移除上清液，重复两次后，打开管盖干燥5～10min；从磁力架上取出反应管，加入22.5μL超纯水，室温静置2min，置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取20μL上清液进行核酸浓度检测和琼脂糖凝胶电泳检测。

结果发现，纯化后的第二扩增产物纯度高，片段约330bp。

实施例3文库构建和Illumina测序

将7μL含有纯化的第二扩增产物的缓冲液和3μL酶混合物混匀，置于PCR仪中37℃孵育30min、70℃孵育15min，降温至4℃并保持，进行末端修复；

将10μL末端修复产物、5μL测序接头、23μL连接缓冲液和2μL连接酶混合后，23℃连接60min，得到接头连接产物；

利用磁珠法对接头连接产物进行纯化，向接头连接产物加入40μL磁珠，震荡混匀后室温孵育5min，离心；将反应管置于磁力架上磁吸附，待溶液澄清后，移除上清液；保持反应管置于磁力架上，加入200μL新鲜配制80％乙醇进行清洗，室温孵育30s，移除上清液，重复两次后，打开管盖干燥5～10min；从磁力架上取出反应管，加入22.5μL超纯水，室温静置2min，置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取20μL上清液进行PCR扩增；

将PCR引物(2.5μL)和扩增缓冲液(12.5μL)解冻后混匀，和纯化产物(10μL)混合，配制25μL反应体系，按照表5条件进行PCR扩增，构建测序文库；

表5

利用磁珠法对测序文库进行纯化，向测序文库加入30μL磁珠，震荡混匀后室温孵育5min，离心；将反应管置于磁力架上磁吸附，待溶液澄清后，移除上清液；保持反应管置于磁力架上，加入200μL新鲜配制80％乙醇进行清洗，室温孵育30s，移除上清液，重复两次后，打开管盖干燥5～10min；从磁力架上取出反应管，加入22.5μL超纯水，室温静置2min，置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取20μL上清液进行Nanodrop核酸浓度检测和Agilent2100生物片段分析仪检测，如图2所示，文库2100质检片段约450bp。

将检测合格的文库进行Illumina测序，并对测序读长进行分析。

针对reads1和reads2序列，每条文库都含有一段外源DNA，截取靠近寡核苷酸的外源DNA序列的10个碱基和寡核苷酸中间的10个N可变碱基，组成10+10bp碱基(两个10bp碱基之间有其他碱基)作为标签序列；对每个样本的原始测序文件进行质控去接头，读取文件中的每一条读长(read)，根据读长中存在的标签序列的类型和数量，统计每个样本中含有各条标签序列的读长数量，并计算占比，最终获得统计结果。

如图3所示为96条合成的寡核苷酸在96孔板上的交叉污染分布，样本4C的交叉污染率约为0.03％；如图4所示为96条合成的寡核苷酸的交叉污染检测热图，横坐标为某一寡核苷酸样本，纵坐标为同一批次合成的96条寡核苷酸，颜色越深代表污染率越高，其中，样本10G的正确率小于99.5％，其他样本的正确率大于99.5％。

综上所述，本发明采用特殊设计的引物对与寡核苷酸同一性低的基因组DNA进行两轮PCR扩增，待寡核苷酸作为引物添加到扩增子上，进行Illumina测序，通过分析测序读长上标签序列的种类和数量，实现了快速准确分析不同寡核苷酸之间的交叉污染率的目的。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州金唯智生物科技有限公司

<120> 一种质检寡核苷酸交叉污染的方法

<130> 20201113

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgaggcgata gggttaaggg aaggcggacg cctgatgggt taatga 46

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caactccttg gctcacaaaa tggagcgcag gttggaa 37

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(42)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

agtcggaggc caagcggtct taggaagaca atnnnnnnnn nncaactcct tggctcaca 59

<210> 4

<211> 272

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgaggcgata gggttaaggg aaggcggacg cctgatgggt taatgagcaa actgaagtgt 60

tttccatgat cttttttgag gtagggctgt ttactgtcac cacccctgtc ggattttact 120

tcctaaacgt acctgtaact atccacttct ctccatctct tctggcacca ccctggttaa 180

agacaccatc atgtgtcgcc aagacagccg cagtagcttc ttaatggctc tccctgcctc 240

tacttttgcc tcttccaacc tgcgctccat tt 272

Claims

1.一种质检寡核苷酸交叉污染的方法，其特征在于，所述方法包括：

对所述第二扩增产物进行文库构建和二代测序，根据测序结果质检寡核苷酸的交叉污染率；所述根据测序结果质检寡核苷酸的交叉污染率包括：

对原始测序数据进行去除接头处理后，统计测序读长中标签序列的种类和数量，计算寡核苷酸的交叉污染率；

其中，所述标签序列为测序读长中的一段外源DNA和可变碱基序列的组合；

所述外源DNA与所述寡核苷酸的同一性不高于80%；

所述寡核苷酸从5’到3’包括5’固定序列、可变碱基序列和3’固定序列；

所述外源DNA为SEQ ID NO: 4所示的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一上游引物和所述第二上游引物为SEQ ID NO: 1所示的核酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一下游引物为SEQ ID NO: 2所示的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二下游引物为SEQ ID NO: 3所示的核酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增的条件为92~98℃预变性1~5 min，92~98℃变性10~30 s、55~65℃退火10~30 s、70~75℃延伸10~30 s，30~40个循环，70~75℃延伸3~5 min，0~4℃保存。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二轮PCR扩增的条件为92~98℃预变性1~5 min，92~98℃变性10~30 s、55~65℃退火10~30 s、70~75℃延伸10~30 s，30~40个循环，70~75℃延伸5~10 min，0~4℃保存。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述文库构建包括对第二扩增产物进行末端修复、接头连接和PCR扩增的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为92~98℃预变性1~5min，92~98℃变性10~30 s、55~65℃退火10~30 s、70~75℃延伸10~30 s，3~6个循环，70~75℃延伸5~10 min，0~4℃保存。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标签序列为测序读长中靠近寡核苷酸的一段外源DNA和寡核苷酸的可变碱基序列的组合。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述标签序列中外源DNA的长度为8~12bp。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述标签序列中可变碱基序列的长度为8~12 bp。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）采用SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的第一引物对对外源DNA SEQ ID NO: 4进行第一轮PCR扩增，所述第一轮PCR扩增的条件为92~98℃预变性1~5 min，92~98℃变性10~30 s、55~65℃退火10~30 s、70~75℃延伸10~30 s，30~40个循环，70~75℃延伸3~5 min，0~4℃保存，得到第一扩增产物；

（2）采用SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3所示的第二引物对对第一扩增产物进行第二轮PCR扩增，所述第二轮PCR扩增的条件为92~98℃预变性1~5 min，92~98℃变性10~30 s、55~65℃退火10~30 s、70~75℃延伸10~30 s，30~40个循环，70~75℃延伸5~10 min，0~4℃保存，得到第二扩增产物，所述第二扩增产物为整合有寡核苷酸和外源DNA的扩增子；

（3）对所述第二扩增产物进行末端修复、接头连接和PCR扩增，所述PCR扩增的条件为92~98℃预变性1~5 min，92~98℃变性10~30 s、55~65℃退火10~30 s、70~75℃延伸10~30 s，3~6个循环，70~75℃延伸5~10 min，0~4℃保存，构建文库进行二代测序；

（4）对原始测序数据进行去除接头处理后，统计测序读长中标签序列的种类和数量，计算寡核苷酸的交叉污染率，其中，所述标签序列为测序读长中靠近寡核苷酸的一段8~12 bp外源DNA和寡核苷酸的8~12 bp可变碱基序列的组合。