JP4106085B2 - 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、工業用酵素として有用な超耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝子および該酵素の遺伝子工学的製造方法に関する。
発明の背景
プロテアーゼは蛋白質中のペプチド結合を切断する酵素であり、動物、植物、微生物より数多くの酵素が見い出されている。その用途は研究用試薬、医薬の他、洗剤への添加、食品の加工、逆反応を利用した化学合成といった工業的分野にも及び、産業上、極めて重要な酵素と言える。工業的分野で使用されるプロテアーゼには物理的、化学的に高い安定性を要求されることから、特に耐熱性の酵素が好んで使用されている。バチルス（Bacillus）属細菌の生産するプロテアーゼは割合に高い耐熱性を示すことから、現在、産業的に利用されているプロテアーゼの主流を占めている。
しかし、さらに優れた酵素が望まれており、高温で生育する微生物、例えば、好熱性バチルス属細菌より酵素を取得しようとする試みもなされている。
一方、超好熱菌と呼ばれる一群の微生物は高温環境によく適応しており、さまざまな耐熱性酵素の供給源として期待されている。これら超好熱細菌のひとつであるピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）がプロテアーゼを生産することが知られている［アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）第５６巻、第１９９２−１９９８頁（１９９０）、エフ・イー・エム・エス・マイクロバイオロジカル・レターズ（FEMS Microbiol. Letters）第７１巻、第１７−２０頁（１９９０）、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（J. Gen. Microbiol.）第１３７巻、第１１９３−１１９９頁（１９９１）］。
また、同じく超好熱菌であるサーモコッカス（Thermococcus）属、スタフィロサーマス（Staphylothermus）属、サーモバクテロイデス（Thermobacteroides）属の細菌についてもプロテアーゼの生産が知られている［アプライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー（Applied Microbiology and Biotechnology）第３４巻、第７１５−７１９頁（１９９１）］。
発明の目的
これら超好熱菌の生産するプロテアーゼは高い耐熱性を持つことから、これまでの酵素にない用途へも応用が期待されるが、上記の文献においては無細胞抽出液、あるいは培養液上清より得られた粗酵素液中に耐熱性のプロテアーゼ活性が存在することが示されているだけであり、精製、純化された酵素の性質等については明らかにされていない。また、これら超好熱菌からの酵素の取得には高温での微生物培養操作を要するため、工業的な酵素製造方法としては問題を有している。
本発明の目的は上記の課題を解決するために、超好熱菌のプロテアーゼをコードする遺伝子を単離すること、および該遺伝子を用いる該プロテアーゼの遺伝子工学的製造方法を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を取得するため、独自にピロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８菌体および培養液上清よりプロテアーゼを精製し、酵素の部分アミノ酸配列を決定することを試みた。しかし、菌体、培養液上清のどちらの場合もプロテアーゼの精製は極めて困難であり、部分アミノ酸配列を決定し得る純度の酵素標品を得ることはできなかった。
目的とする酵素の一次構造に関する情報なしに酵素遺伝子をクローニングする方法としては発現クローニング法があり、例えば、ピロコッカス・ボウゼイ（Pyrococcus woesei）由来のプルラナーゼ遺伝子（ＷＯ９２／０２６１４）はこの方法により取得されている。一般に、発現クローニング法にはプラスミドベクターが使用されるが、この場合には目的遺伝子がその内部で切断されることなく、かつプラスミドベクターに挿入可能な程度の比較的小さなＤＮＡ断片に切断されるような制限酵素を用いなければならず、必ずしも全ての酵素遺伝子のクローニングに適用可能ではない。さらに、数多くのクローンについて酵素活性の発現を調べる必要があり、操作が繁雑である。
本発明者らはプラスミドベクターに代えて、より大きなＤＮＡ断片（３５〜５０kb）を保持できるコスミドベクターを用いてピロコッカス・フリオサスゲノムのコスミドライブラリーを作製し、該ライブラリー中にプロテアーゼ活性を発現するコスミドクローンを検索することにより、プロテアーゼ遺伝子を単離することを試みた。コスミドベクターを用いることにより酵素遺伝子内部が切断されるおそれが減るとともに、スクリーニングする形質転換体の数を減らすことができる。その反面、コスミドベクターはプラスミドベクターに比べて宿主内でのコピー数が高くないため、酵素発現量が低く活性を検出できない可能性がある。
本発明者らは、まず、目的とする酵素が高い耐熱性を有する点に着目し、コスミドライブラリー中の形質転換体を個別に培養し、得られた菌体から耐熱性の蛋白質のみを含むライゼートを調製する工程を組み合わせた。この一群のライゼートはコスミドプロテインライブラリーと命名され、該コスミドプロテインライブラリーを酵素活性の検出に用いることにより、形質転換体のコロニーを用いる方法よりも検出感度を上げることができる。
また、本発明者らは、活性の検出法にゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いることにより、ごく微量の酵素活性の検出を可能にした。該方法は試料中に含まれる微量のプロテアーゼ活性をゲル内で濃縮されたバンドとして検出できる非常に高感度な検出法である。
かくして、本発明者らはピロコッカス・フリオサス由来のコスミドプロテインライブラリーを検索し、プロテアーゼ活性を発現する数個のコスミドクローンを取得した。
さらに、本発明者らは、このクローン中に含まれる挿入ＤＮＡ断片より、種々の遺伝子工学的手法を駆使して、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の単離に成功し、また、該遺伝子の発現産物が界面活性剤に耐性であることも見出した。
該遺伝子の塩基配列から推定される超耐熱性プロテアーゼのアミノ酸配列と、既知の微生物由来プロテアーゼのアミノ酸配列との比較から、該遺伝子のコードするプロテアーゼの前半部分のアミノ酸配列とサブチリシンに代表される一群のアルカリ性セリンプロテアーゼとの間に相同性が存在することが示され、特に酵素の触媒活性に重要とされる４つのアミノ酸残基周辺で極めて高い相同性が認められた。このように、常温菌由来のプロテアーゼが容易に失活するような高温で活性を示すピロコッカス・フリオサスの生産するプロテアーゼに常温菌由来の酵素と類似した構造が保存されていることが示されたことより、ピロコッカス・フリオサス以外の超好熱菌においても同様のプロテアーゼが生産されていることが示唆された。
そこで、本発明者らは得られた超耐熱性プロテアーゼ遺伝子のうち、サブチリシン等と相同性の高い領域をコードする塩基配列が超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を探索するプローブとして有用である可能性に着目し、該塩基配列をもとに作製した合成ＤＮＡをプライマーに用いたＰＣＲによる超好熱菌由来のプロテアーゼ遺伝子の検出およびプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニングを試みた。その結果、超好熱菌サーモコッカス・セラー（Thermococcus celer）ＤＳＭ２４７６にプロテアーゼ遺伝子を見い出し、該遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。さらに、該ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列中に配列表の配列番号１で表される超耐熱プロテアーゼのアミノ酸配列と相同性の高い配列が含まれていることを確認し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、単離されたピロコッカス・フリオサス由来の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子、ことに、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列またはその一部であって、かつ、超耐熱性プロテアーゼ酵素活性を有する部分をコードする超耐熱性プロテアーゼ遺伝子、とりわけ、配列表の配列番号２に記載したＤＮＡ配列を有する超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を提供するものである。
また、本発明は、該超耐熱性プロテアーゼ遺伝子にハイブリダイズ可能な超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を提供する。その１例として、配列表の配列番号７に記載した塩基配列を含む超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を提供する。
さらに、本発明は、これらの本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を組み込んだ組換えプラスミドで形質転換した形質転換体を培養し、該培養物から超耐熱性プロテアーゼを採取することを特徴とする該超耐熱性プロテアーゼの製造方法も提供する。
本発明に係る超耐熱性プロテアーゼ遺伝子は、超好熱細菌の遺伝子ライブラリーのスクリーニングにより得ることができる。超好熱細菌としてはピロコッカス属に属する細菌が使用でき、ピロコッカス・フリオサスのゲノムのコスミドライブラリーより目的の遺伝子をスクリーニングし、得ることができる。
ピロコッカス・フリオサスとしては、例えば、ピロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８が使用でき、該菌株はドイッチェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルチュウレンＧmbＨ（Deutsch Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH）より入手可能な菌株である。
ピロコッカス・フリオサスのゲノムのコスミドライブラリーの１例としてはピロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８のゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓau３ＡＩ（宝酒造社製）で部分消化して得られたＤＮＡ断片と、トリプルヘリックスコスミドベクター（ストラタジーン社製）とをライゲーションした後、イン・ビトロ・パッケージング法によってラムダファージ粒子中にパッケージングすることによって得ることができる。ついで、該ライブラリーを適当なイー・コリ（Escherichia coli）、例えば、イー・コリＤＨ５αＭＣＲ（ＢＲＬ社製）に形質導入することによって得られる形質転換体を培養した後、菌体を集めて熱処理（１００℃、１０分間）、超音波処理、再熱処理（１００℃、１０分間）し、得られたライゼート中のプロテアーゼ活性の有無をゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアミリルアミドゲル電気泳動法を利用してスクリーニングすることができる。
これにより、上記の熱処理に耐性のプロテアーゼを発現する、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むコスミドクローンを得ることができる。
さらに、このようにして得られたコスミドクローンより調製したコスミドを適当な制限酵素で断片化し、各断片を組み込んだ組換えプラスミドを作製することができる。ついで、該プラスミドで適当な微生物を形質転換し、得られた形質転換体の発現するプロテアーゼ活性を調べることにより、目的とする超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを得ることができる。
すなわち、上記のコスミドクローンの１つから調製したコスミドをＳphＩ（宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターpＵＣ１１９（宝酒造社製）のＳphＩサイトに導入した組換えプラスミドを得ることができる。ついで、この組換えプラスミドをイー・コリＪＭ１０９（宝酒造社製）に導入し、得られた形質転換体についてコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べ、活性の認められた形質転換体よりプラスミドを調製する。
実施例に示すごとく、該組換えプラスミドの１つは、pＴＰＲ１と命名され、該プラスミドで形質転換されたイー・コリＪＭ１０９はEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１と命名されている。図１にプラスミドpＴＰＲ１の制限酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターpＵＣ１１９への挿入ＤＮＡ断片である。該組換えプラスミドには約７．０kbのＳphＩ断片が含まれている。
さらに、この組換えプラスミドより超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含まない約２．５kbのＤＮＡ断片を除くことができる。すなわち、上記プラスミドpＴＰＲ１をＸbaＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約２．５kb、約３．３kb、約４．３kbの３つのＤＮＡ断片のうち、約２．５kbのＤＮＡ断片のみを取り除いてライゲーションを行い、イー・コリＪＭ１０９に導入する。得られた形質転換体のプロテアーゼ活性をコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法で調べ、活性を示した形質転換体よりプラスミドを調製する。該プラスミドは、プラスミドpＴＰＲ９と命名され、該プラスミドで形質転換されたイー・コリＪＭ１０９はEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ９と命名されている。図２にプラスミドpＴＰＲ９の制限酵素地図を示す。図中太実線がプラスミドベクターpＵＣ１１９への挿入ＤＮＡ断片である。
上記プラスミドpＴＰＲ１およびプラスミドpＴＰＲ９の発現するプロテアーゼ活性はともに高い耐熱性を示すが、ゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアミリルアミドゲル上においてコスミドクローンの発現するプロテアーゼ活性とは異なる泳動位置に活性を示すことから、これらのプラスミドはコスミドＤＮＡ上のプロテアーゼ遺伝子の一部を欠いていることが予想される。プロテアーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片は、例えば、上記プラスミドpＴＰＲ９の挿入ＤＮＡ断片の一部をプローブに用いることにより、コスミドＤＮＡから得ることができる。すなわち、プラスミドpＴＰＲ１の調製に用いたコスミドＤＮＡを、ＮotＩ（宝酒造社製）およびプラスミドpＴＰＲ１の挿入ＤＮＡ断片中を切断しない幾つかの制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後に、ゲル内のＤＮＡ断片をナイロンメンブレン上にブロッティングする。こうして得られたメンブレンについて、プラスミドpＴＰＲ９の挿入ＤＮＡ断片より得られる約０．７kbのＰstＩ−ＸbaＩ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションを行い、ＰstＩ−ＸbaＩ断片と同一の配列を含むＤＮＡ断片を検出することができる。
ＮotＩおよびＰvuＩＩ（宝酒造社製）の２つの酵素で消化したコスミドＤＮＡでは約７．５kbのＤＮＡ断片が該ＰstＩ−ＸbaＩ断片とハイブリダイズしており、この約７．５kb断片を単離して、あらかじめＨincＩＩサイトにＮotＩリンカー（宝酒造社製）を導入したプラスミドベクターpＵＣ１９（宝酒造社製）のＮotＩおよびＳmaＩサイト間に挿入することができる。該プラスミドは、プラスミドpＴＰＲ１２と命名され、また、該プラスミドで形質転換されたイー・コリＪＭ１０９は、Escherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１２と命名、表示され、平成６年５月２４日（原寄託日）より、ブタペスト条約の下、通産省工業技術院生命工学研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５１０３として寄託されている。
該Escherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１２のライゼートは、ゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上においてコスミドクローンと同様のプロテアーゼ活性を示す。図３にプラスミドpＴＰＲ１２の制限酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターpＵＣ１９への挿入ＤＮＡ断片である。
図４に、プラスミドpＴＰＲ１、pＴＰＲ９およびpＴＰＲ１２にそれぞれ導入されたピロコッカス・フリオサス由来のＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。この図をもとに、プラスミドpＴＰＲ１２の挿入ＤＮＡ断片より超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含まない約１kbのＤＮＡ断片を除くことができる。すなわち、プラスミドpＴＰＲ１２をＸbaＩおよびＫpnＩ（宝酒造社製）消化し、得られる約３．３kbのＸbaＩ−ＸbaＩ断片および約３．２kbのＸbaＩ−ＫpnＩ断片を単離した後、まず、約３．２kbのＸbaＩ−ＫpnＩ断片をプラスミドベクターpＵＣ１９のＸbaＩおよびＫpnＩサイト間に導入した組換えプラスミドを作製する。該プラスミドはプラスミドpＴＰＲ１４と命名され、図５にその制限酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターpＵＣ１９への挿入ＤＮＡ断片である。
つぎに、上記約３．３kbのＸbaＩ−ＸbaＩ断片をプラスミドpＴＰＲ１４のＸbaＩサイトに導入した後、イー・コリＪＭ１０９に導入する。得られた形質転換体について、コスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べ、活性の認められた形質転換体からプラスミドを調製する。該プラスミドはpＴＰＲ１５と命名され、該プラスミドで形質転換されたイー・コリＪＭ１０９はEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１５と命名されている。図６にプラスミドpＴＰＲ１５の制限酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターpＵＣ１９への挿入ＤＮＡ断片である。
さらに、該プラスミドpＴＰＲ１５に挿入されたピロコッカス・フリオサス由来のＤＮＡ断片の塩基配列のうち、２つのＤraサイトにはさまれた約４．８kb部分の配列を配列表の配列番号８に示す。すなわち、配列表の配列番号８は、本発明によって得られる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の一例の塩基配列である。また、配列表の配列番号９に、配列番号８に示される塩基配列より推定される遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。すなわち、配列表の配列番号９は、本発明によって得られる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を用いて生産される酵素蛋白質の一例のアミノ酸配列である。
本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子が上記プラスミドpＴＰＲ１５の挿入ＤＮＡ断片中の約４．８kbのＤraＩ断片上に含まれることが示されたことから、このＤraＩ断片のみを含む組換えプラスミドを作製することができる。
すなわち、上記プラスミドpＴＰＲ１５をＤraＩ（宝酒造社製）で消化し、得られる約４．８kbのＤＮＡ断片を単離した後、プラスミドベクターpＵＣ１９のＳmaＩサイトに導入した組換えプラスミドを作製することができる。該プラスミドは該プラスミドpＴＰＲ１３と命名され、また、該プラスミドで形質転換されたイー・コリＪＭ１０９はEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１３と命名されている。
該Escherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１３のライゼートはゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上においてコスミドクローンと同様のプロテアーゼ活性を示す。図７にプラスミドpＴＰＲ１３の制限酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターpＵＣ１９への挿入ＤＮＡ断片である。
また、本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子をバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）において発現させることができる。バチルス・サブチリスとしてはバチルス・サブチリスＤＢ１０４が使用でき、該菌株はジーン［Gene］第８３巻、第２１５−２３３頁（１９８９）記載の公知の菌株である。クローニングベクターとしてはプラスミドpＵＢ１８−Ｐ４３が使用でき、該プラスミドはカルガリー大学、スイ−ラム・ウォン（Sui-Lam Wong）博士より恵与されたプラスミドである。また、該プラスミドは選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる。
上記プラスミドpＴＰＲ１３をＫpnＩ（宝酒造社製）およびＢamＨＩ（宝酒造社製）で消化し、得られた約４．８kbのＤＮＡ断片を単離した後、プラスミドpＵＢ１８−Ｐ４３のＫpnＩ−ＢamＨＩサイト間にライゲーションして組換えプラスミドを作製することができる。該プラスミドはプラスミドpＵＢＰ１３と命名され、該プラスミドで形質転換されたバチルス・サブチリスＤＢ１０４はBacillus subtilis ＤＢ１０４／pＵＢＰ１３と命名されている。該Bacillus subtilis ＤＢ１０４／pＵＢＰ１３のライゼートはゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でコスミドクローンと同様のプロテアーゼ活性を示す。図８にプラスミドpＵＢＰ１３の制限酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターpＵＢ１８−Ｐ４３への挿入ＤＮＡ断片である。
配列表の配列番号９に示したアミノ酸配列を、既知の微生物由来プロテアーゼのアミノ酸配列と比較することにより、本発明の超耐熱性プロテアーゼの前半部分の配列とサブチリシンに代表される一群のアルカリ性セリンプロテアーゼ［プロテイン エンジニアリング（Protein Engineering）第４巻、第７１９−７３７頁（１９９１）］との間に相同性が存在し、特にプロテアーゼの活性に重要とされる４つのアミノ酸残基周辺に極めて高い相同性が存在することがわかる。一方、後半部分のアミノ酸配列にはそのような相同性はなく、この部分がプロテアーゼ活性に必須でない可能性が考えられることから、後半部分の適当なペプチド鎖を除いた変異型プロテアーゼが酵素活性を示すことが期待される。変異型プロテアーゼの１例としては、配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列のうち９０４番目のＳer以降の配列を除いたプロテアーゼがあり、これは、つぎのような方法で作製することができる。
まず、上記プラスミドpＴＰＲ１３よりＥcoＲＩサイトを平滑化した約２．８kbのＫpnＩ−ＥcoＲＩ断片を調製し、プラスミドベクターpＵＣ１１９のＫpnＩサイトと平滑化したＸbaＩサイトの間にライゲーションする。こうして得られた組換えプラスミドに含まれるプロテアーゼ遺伝子は、配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列中の９０４番目のＳerをコードする塩基配列ＴＣＡが停止コドンＴＡＧに置きかわり、それ以降の塩基配列を失っている。該プラスミドはプラスミドpＴＰＲ３６と命名され、該プラスミドで形質転換されたイー・コリＪＭ１０９はEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ３６と命名されている。該Escherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ３６のライゼートはゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でプロテアーゼ活性を示す。図９にプラスミドpＴＰＲ３６の制限酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターpＵＣ１１９への挿入ＤＮＡ断片である。また、プラスミドpＴＰＲ３６の挿入ＤＮＡ断片に含まれるオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。すなわち、配列表の配列番号２は、本発明によって得られる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の１例の塩基配列である。さらに、配列表の配列番号１に、配列番号２に示される塩基配列より推定される遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。すなわち、配列表の配列番号１は、本発明によって得られる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を用いて生産される酵素タンパク質の１例のアミノ酸配列である。
上記のように、超好熱菌ピロコッカス・フリオサスの生産する超耐熱性プロテアーゼのアミノ酸配列中に、常温菌由来のアルカリ性セリンプロテアーゼに共通して存在する領域が保存されていることが明らかとなったことより、ピロコッカス・フリオサス以外の超好熱菌の生産する同種のプロテアーゼにもこの領域が存在していることが期待できる。すなわち、配列表の配列番号２に示した塩基配列のうち、サブチリシン等と相同性の高い領域のアミノ酸配列をコードする部分の配列をもとに、適当な合成ＤＮＡを作製し、これをプローブ、あるいはプライマーに用いて本酵素類似の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を得ることが可能である。
図１０、１１および１２に、本発明の超耐熱性プロテアーゼのアミノ酸配列のうちサブチリシン等と高い相同性を示す領域の配列、その部分をコードする本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列およびそれをもとに合成したオリゴヌクレオチドＰＲＯ−１Ｆ、ＰＲＯ−２Ｆ、ＰＲＯ−２ＲおよびＰＲＯ−４Ｒの塩基配列の関係を示す。さらに、配列表の配列番号３、４、５および６にオリゴヌクレオチドＰＲＯ−１Ｆ、ＰＲＯ−２Ｆ，ＰＲＯ−２ＲおよびＰＲＯ−４Ｒの塩基配列を示す。すなわち、配列表の配列番号３、４、５および６は本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子のハイブリダイゼーションによる検出に用いられるオリゴヌクレオチドの１例の塩基配列である。
該オリゴヌクレオチドを組み合わせてプライマーに用い、各種の超好熱菌の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、超好熱菌に存在するプロテアーゼ遺伝子を検出することができる。超好熱菌としてはピロコッカス属、サーモコッカス属、スタフィロサーマス属、サーモバクテロイデス属等に属する細菌が使用でき、サーモコッカス属に属する細菌としては例えばサーモコッカス・セラー（Thermococcus celer）ＤＳＭ２４７６が使用でき、該菌株はドイッチェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルチュウレンＧmbＨ（Deutsch Summlung von Microorganismen unt Zellkulturen GmbH）より入手可能な菌株である。サーモコッカス・セラーＤＳＭ２４７６染色体ＤＮＡを鋳型とし、上記のオリゴヌクレオチドＰＲＯ−１ＦとＰＲＯ−２Ｒの組み合わせ、あるいはＰＲＯ−２ＦとＰＲＯ−４Ｒの組み合わせをプライマーに用いてＰＣＲを行った場合には、特異的なＤＮＡ断片の増幅が認められ、プロテアーゼ遺伝子の存在を知ることができる。また、これらの断片を適当なプラスミドベクターにライゲーションした組換えプラスミドを作製した後、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法を用いて調べることにより、該断片にコードされるアミノ酸配列を推定することができる。
オリゴヌクレオチドＰＲＯ−１ＦとＰＲＯ−２Ｒとを用いて増幅された約１５０bpのＤＮＡ断片、あるいはオリゴヌクレオチドＰＲＯ−２ＦとＰＲＯ−４Ｒを用いて増幅された約５５０bpのＤＮＡ断片をプラスミドベクターpＵＣ１８のＨincIIサイトにライゲーションして作製された組換えプラスミドはそれぞれプラスミドp１Ｆ−２Ｒ（２）、プラスミドp２Ｆ−４Ｒと命名されている。配列表の配列番号１０にプラスミドp１Ｆ−２Ｒ（２）の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列とそれから推定されるアミノ酸配列を、また、配列表の配列番号１１にプラスミドp２Ｆ−４Ｒの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列とそれから推定されるアミノ酸配列をそれぞれ示す。配列表の配列番号１０に示された塩基配列のうち１番目から２１番目にかけてと、１１３番目から１４５番目にかけての配列、および配列表の配列番号１１に示された塩基配列のうち１番目から３２番目にかけてと、５３２番目から５６４番目にかけての配列は、ＰＣＲにプライマーとして用いたオリゴヌクレオチド（それぞれオリゴヌクレオチドＰＲＯ−１Ｆ、ＰＲＯ−２Ｒ、ＰＲＯ−２ＦおよびＰＲＯ−４Ｒに相当する）由来の塩基配列である。配列表の配列番号１０および１１に示されたアミノ酸配列中には本発明のピロコッカス・フリオサス由来の超耐熱性プロテアーゼおよび各種微生物由来のアルカリ性セリンプロテアーゼのアミノ酸配列と相同性のある配列が存在しており、上記のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片がプロテアーゼ遺伝子を鋳型として増幅されたものであることを示している。
プラスミドp２Ｆ−４Ｒの制限酵素地図を図１３に示す。図中太実線がプラスミドベクターpＵＣ１８への挿入ＤＮＡ断片である。
一方、サーモバクテロイデス・プロテオリティカス（Thermobacteroides proteoliticus）ＤＳＭ５２６５およびスタフィロサーマス・マリナス（Staphylothermus marinus）ＤＳＭ３６３９の染色体ＤＮＡを鋳型に用いた場合には、サーモコッカス・セラーで見られたようなＤＮＡ断片の増幅は認められなかった。
なお、ＰＣＲによる遺伝子増幅の効率は、プライマーの３′−末端部分と鋳型ＤＮＡのアニーリングの効率に影響されることが知られている。上記のＰＣＲによってＤＮＡの増幅が見られない場合には、今回用いたオリゴヌクレオチドと配列は異なるが同じアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成してプライマーに用いることにより、プロテアーゼ遺伝子を検出することができる。また、これらのオリゴヌクレオチドをプローブに用いて、各種超好熱菌染色体ＤＮＡとのサザン・ハイブリダイゼーションを行うことによっても、プロテアーゼ遺伝子を検出することができる。
つぎに、上記のオリゴヌクレオチドあるいは上記のＰＣＲにより得られる増幅ＤＮＡ断片をプローブに用いて超好熱菌のゲノムＤＮＡのライブラリーをスクリーニングすることにより、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子、例えば、サーモコッカス・セラーの生産する超耐熱性プロテアーゼの遺伝子を得ることができる。
サーモコッカス・セラーのゲノムＤＮＡライブラリーの１例としては、サーモコッカス・セラーＤＳＭ２４７６のゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓau３ＡＩで部分消化して得られるＤＮＡ断片をラムダＧＥＭ−１１ベクター（プロメガ社製）とライゲーションした後、インビトロパッケージング法によってラムダファージ粒子中にパッケージングすることによって作製されたライブラリーがある。ついで、該ライブラリーを適当なイー・コリ、例えば、イー・コリＬＥ３９２（プロメガ社製）に形質導入してプレート上でプラークを形成させた後、上記のＰＣＲにより得られる増幅ＤＮＡ断片をプローブに用いたプラークハイブリダイゼーションを行い、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むファージクローンを得ることができる。
さらに、このようにして得られたファージクローンより調製したファージＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後に、ゲル内のＤＮＡ断片をナイロンメンブレン上にブロッティングする。こうして得られたメンブレンについて、上記のＰＣＲにより得られる増幅ＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションを行い、プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を検出することができる。
上記のファージクローンをＫpnＩで消化した場合には約９kbのＤＮＡ断片がプローブとハイブリダイズしており、この約９kb断片を単離して、プラスミドベクターpＵＣ１１９のＫpnＩサイトに導入した組換えプラスミドを得ることができる。該プラスミドはプラスミドpＴＣ１と命名され、また、該、プラスミドで形質転換されたイー・コリＪＭ１０９はEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＣ１と命名されている。
図１４にプラスミドpＴＣ１の制限酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターpＵＣ１１９への挿入ＤＮＡ断片である。
さらに、該プラスミドpＴＣ１より、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含まない約４kbのＤＮＡ断片を除くことができる。すなわち、プラスミドpＴＣ１をＫpnＩおよびプラスミドpＴＣ１の挿入ＤＮＡ断片内を切断するいくつかの制限酵素で消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、上記ファージＤＮＡの場合と同様にプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の検出を行う。プラスミドpＴＣ１をＫpnＩとＢamＨＩで消化した場合には約５kbのＤＮＡ断片がプローブとハイブリダイズしており、この約５kb断片を単離してプラスミドベクターpＵＣ１１９のＫpnＩ−ＢamＨＩサイト間に導入した組換えプラスミドを作製することができる。該プラスミドはプラスミドpＴＣ３と命名され、該プラスミドで形質転換されたイー・コリＪＭ１０９はEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＣ３と命名されている。図１５にプラスミドpＴＣ３の制限酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターpＵＣ１１９への挿入ＤＮＡ断片である。
該プラスミドpＴＣ３に挿入されたＤＮＡ断片に含まれる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列は、特異的プライマー、すなわち、配列表の配列番号１０および１１に示された塩基配列をもとに合成した適当なオリゴヌクレオチドをプライマーに用いることによって決定することができる。配列表の配列番号１２、１３、１４、１５、１６および１７に超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列決定にプライマーとして用いたオリゴヌクレオチド、ＴＣＥ−２、ＴＣＥ−４、ＳＥＦ−３、ＳＥＲ−１、ＳＥＲ−３およびＴＣＥ−６Ｒの塩基配列を示す。また、配列表の配列番号７に、こうして得られた超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列の一部を示す。すなわち、配列表の配列番号７は本発明により得られる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の一例の塩基配列である。さらに、配列表の配列番号１８に、配列表の配列番号７に示された塩基配列より推定される遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。すなわち、配列表の配列番号１８は、本発明によって得られる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子にコードされる酵素の１例のアミノ酸配列である。プラスミドpＴＣ３の挿入ＤＮＡ断片中において、配列表の配列番号７に示される塩基配列には、その５′−側にラムダＧＥＭ−１１ベクター由来の配列が隣接しており、プロテアーゼ遺伝子の５′−側領域の一部を欠いていることがわかる。また、該塩基配列を配列表の配列番号１０および１１に示される塩基配列と比較することにより、プラスミドpＴＣ３の挿入ＤＮＡ断片には配列表の配列番号１０に示される塩基配列のうちの４１番目以降の配列と、配列表の配列番号１１に示される塩基配列の全体を含んでいることがわかる。
このサーモコッカス・セラーより得られた超耐熱性プロテアーゼ遺伝子はその一部分を欠いてはいるが、当業者に自明のとおり、（１）ゲノムＤＮＡのライブラリーのスクリーニングをやり直す、（２）ゲノムＤＮＡを用いたサザンハイブリダイゼーションを行う、（３）カセット（宝酒造社製）およびカセットプライマー（宝酒造社製）を用いるＰＣＲで、５’−上流領域のＤＮＡ断片を取得する（宝酒造遺伝子工学製品ガイド、１９９４−１９９５年版、第２５０−２５１頁）等の方法により、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
本発明により得られる、ピロコッカス・フリオサス由来の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を組み込んだ組換えプラスミドを導入した形質転換体、例えば、Escherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１３あるいはEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ３６は通常の培養条件、例えば、１００μg／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮaＣl ５ｇ／リットル、pＨ７．２）中、３７℃で培養することにより、培養物中に超耐熱性プロテアーゼを発現させることができる。培養終了後、培養菌体を集菌し、得られた菌体の超音波処理後の遠心上清について１００℃、５分間の熱処理による夾雑蛋白質の変性除去を行うことにより、粗酵素標品を得ることができる。こうしてEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１３およびEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ３６より得られる粗酵素標品はそれぞれＰＦ−１３およびＰＦ−３６と命名されている。
さらに、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を組み込んだ組換えプラスミドを導入した形質転換体、Bacillus subtilis ＤＢ１０４／pＵＢＰ１３は通常の培養条件、例えば、１０μg／mlのカナマイシンを含むＬＢ培地中、３７℃で培養することにより、培養物中に超耐熱性プロテアーゼを発現させることができる。培養終了後、培養菌体を集菌し、得られた菌体の超音波処理後の遠心上清について１００℃、５分間の熱処理による夾雑蛋白質の除去、硫安塩析処理および透析処理を行って粗精製酵素標本を得ることができる。こうして、Bacillus subtilis ＤＢ１０４／pＵＢＰ１３より得られた粗精製酵素標品はＰＦ−ＢＳ１３と命名されている。
本発明により得られるピロコッカス・フリオサス由来の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を組み込んだ組換えプラスミドを導入された形質転換体が生産する超耐熱性プロテアーゼ標品、例えば、ＰＦ−１３、ＰＦ−３６およびＰＦ−ＢＳ１３の酵素化学的および理化学的性質はつぎのとおりである。
（１）作用
本発明で得られる酵素はゼラチンを分解し、短鎖ポリペプチドを生成する。さらに、カゼインを分解し、短鎖ポリペプチドを生成する。
（２）酵素活性検出方法
酵素活性の検出は、酵素によるゼラチンの分解をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で確認する方法により行った。すなわち、酵素活性を検出しようとする酵素標本を適度に希釈し、その試料溶液１０μlに２．５μlの試料用緩衝液（５０mＭ トリス−ＨＣl pＨ７．６、５％ＳＤＳ、５％ ２−メルカプトエタノール、０．００５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）を加えて１００℃、５分間熱処理を行った後、０．０５％のゼラチンを含む０．１％ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。泳動終了後、ゲルを５０mＭリン酸カリウム緩衝液（pＨ７．０）中に浸して９５℃、２時間保温して酵素反応を行い、ついで、ゲルを２．５％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０、２５％エタノール、１０％酢酸中で３０分間染色し、さらに、２５％メタノール、７％酢酸中にゲルを移し、３〜１５時間かけて余分の色素を除いた。プロテアーゼによってペプチドに分解されたゼラチンは酵素反応中にゲル外へ拡散し、その部分がクーマシーブリリアントブルーで染色されなくなることからプロテアーゼ活性の存在を検出した。本発明により得られる酵素標品、ＰＦ−１３、ＰＦ−３６およびＰＦ−ＢＳ１３は９５℃においてゼラチン分解活性を有していた。
また、カゼインに対する分解活性は、０．０５％のカゼインを含む０．１％ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲルを用いる以外は上記の方法とまったく同じ方法によって検出した。本発明により得られる酵素標品、ＰＦ−１３、ＰＦ−３６およびＰＦ−ＢＳ１３は９５℃においてカゼイン分解活性を有していた。
さらに、本発明により得られる酵素標品、ＰＦ−ＢＳ１３のカゼイン分解活性を以下に示す方法で測定した。０．２％カゼインを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pＨ７．０）１００μlに適度に希釈した酵素標品１００μlを加え、９５℃で１時間保温した。１００μlの１５％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止した後、遠心分離して得られる上清中に含まれる酸可溶性の短鎖ポリペプチド量を２８０nmにおける吸光度から測定し、酵素標品を加えずに保温したものと比較して酵素活性を調べた。本発明により得られる酵素標品、ＰＦ−ＢＳ１３は測定されたpＨ７．０、９５℃においてカゼイン分解活性を有していた。
（３）安定性
酵素の安定性は、熱処理した酵素標品中の残存活性を上記（２）に示したゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いる方法により検出し、調べた。すなわち、酵素標品を９５℃で３時間保温した後、そのうちの適当量をとって酵素活性の検出を行い、９５℃での処理を行わなかったものと比較した。９５℃、３時間の保温により、プロテアーゼ活性の泳動位置が若干変化したが、酵素活性の低下はほとんど見られなかった。本発明により得られる酵素標品、ＰＦ−１３、ＰＦ−３６およびＰＦ−ＢＳ１３は９５℃、３時間の熱処理に対して安定であった。
また、本発明により得られる酵素標品、ＰＦ−１３およびＰＦ−３６について界面活性剤存在下での安定性を調べた。すなわち、酵素標品に最終濃度０．１％のトライトンＸ−１００、ＳＤＳあるいは塩化ベンザルコニウムを加えて９５℃で３時間保温した後、そのうちの適当量をとって酵素活性の検出を行った。いずれの界面活性剤を加えた場合も、界面活性剤を加えなかった場合に比べて大きな差は見られず、本発明により得られる酵素標品、ＰＦ−１３およびＰＦ−３６は上記の界面活性剤の存在下、９５℃、３時間の処理に対して安定であった。
さらに、本発明により得られる酵素標品、ＰＦ−ＢＳ１３について以下に示す方法で安定性を調べた。すなわち、酵素標品をそのまま、あるいは最終濃度０．１％のＳＤＳを加えて９５℃で種々の時間保温した後、残存する酵素活性を上記（２）に示した酸可溶性ポリペプチド量の増加に基づく分光光学的方法により測定した。図１６は本発明により得られる酵素標品、ＰＦ−ＢＳ１３の熱安定性を示す図であり、縦軸は残存活性（％）、横軸は保温時間（hr）を示す。また、図中白丸印はＳＤＳ無添加、図中黒丸印は０．１％ＳＤＳ存在下で得られた結果を示す。酵素標品、ＰＦ−ＢＳ１３は図１６に示すように０．１％ＳＤＳの有無にかかわらず、９５℃、４時間の保温後においてもほぼ１００％の活性を保持していた。
（４）各種試薬の影響
酵素標品をゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、２mＭ ＥＤＴＡまたは２mＭフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む５０mＭリン酸カリウム緩衝液（pＨ７．０）中で酵素反応を行い、両試薬の酵素活性への影響を調べた。本発明により得られる酵素標品、ＰＦ−１３、ＰＦ−３６およびＰＦ−ＢＳ１３の示す酵素活性は２mＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液を用いた場合には５０mＭリン酸カリウム緩衝液のみを用いた場合と差は見られなかった。一方、２mＭ ＰＭＳＦを含む緩衝液を用いた場合にはどの標品においてもゲル中のゼラチンの分解量が減少しており、これらの標品中の酵素活性がＰＭＳＦによって阻害されることが示された。
（５）分子量
本発明で得られる酵素標品のゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上における分子量を調べた。酵素標品ＰＦ−１３では９５kＤa〜５１kＤaに複数の活性バンドが出現した。試料の適用量等により泳動距離が変化するが主バンドは８４kＤa、７９kＤa、６６kＤa、５４kＤaおよび５１kＤaであった。酵素標品を最終濃度０．１％のＳＤＳ存在下、９５℃で３時間保温した後に泳動すると、６３kＤaおよび５１kＤaのバンドが強くなった。酵素標品ＰＦ−ＢＳ１３では上記の酵素標品ＰＦ−１３と同じ結果が得られた。また、酵素標品ＰＦ−３６の場合には６３kＤaおよび５９kＤaに主バンドが見られる他、いくつかの弱いバンドが認められた。
（６）至適pＨ
本発明で得られる酵素標品、ＰＦ−１３およびＰＦ−３６の至適pＨを調べた。酵素標品をゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、各種のpＨの緩衝液中にゲルを浸して酵素反応を行い、至適pＨを調べた。緩衝液には、pＨ４．０〜６．０においては５０mＭ 酢酸ナトリウム緩衝液、pＨ６．０〜８．０においては５０mＭ リン酸カリウム緩衝液、pＨ９．０〜１０．０においては５０mＭ ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いた。両酵素標品ともpＨ６．０〜１０．０でゼラチン分解活性を示し、その至適pＨはpＨ８．０〜９．０であった。
また、本発明で得られる酵素標品、ＰＦ−ＢＳ１３の至適pＨを上記（２）に示した酸可溶性ポリペプチド量の増加に基づく分光光学的方法により調べた。活性測定に用いる０．２％カゼイン溶液を、pＨ４．０〜６．０においては０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、pＨ６．０〜８．０においては０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、pＨ９．０〜１０．０においては０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、pＨ１１．０においては０．１Ｍリン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を用いて調製し、活性測定に用いた。図１７は本発明により得られる酵素標品ＰＦ−ＢＳ１３のカゼイン分解活性とpＨの関係を示す図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸はpＨを示す。また、図中、白丸印は０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、図中、黒丸印は０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、図中、白四角印は０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、図中、黒四角印は０．１Ｍリン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液で調製された基質溶液を用いて得られた結果を示す。図１７に示すように酵素標品ＰＦ−ＢＳ１３はpＨ５．０〜１１．０の間でカゼイン分解活性を示し、その至適pＨはpＨ９．０〜１０．０であった。
以上、詳細に説明したように、本発明により超耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝子が提供され、該遺伝子を用いた超耐熱性プロテアーゼの工業的製造方法が提供される。該酵素は高い耐熱性を有するとともに界面活性剤に対しても耐性を示し、高温下での蛋白分解処理において特に有用である。
また、本発明により単離された遺伝子、もしくはその塩基配列の一部をプローブとしたハイブリダイゼーションによって得られたＤＮＡ断片を適当な微生物に導入し、上記のコスミドプロテインライブラリーと同様の方法で調製した熱処理ライゼート中のプロテアーゼ活性を適当な方法で調べることにより、本酵素の配列と同一ではないが同様の酵素活性を持つ本酵素類似の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を得ることができる。
上記のハイブリダイゼーションは以下の条件で行うことができる。すなわち、ＤＮＡを固定したメンブレンを０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮaＣl，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pＨ７．０を示す）中で、５０℃にて１２〜２０時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベート終了後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は０．１×までの範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固定されたＤＮＡ由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまで洗浄する。
さらに、本発明により単離された遺伝子、もしくはその塩基配列の一部をプライマーに用いた遺伝子増幅反応で得られたＤＮＡ断片、あるいは該断片をプローブとしたハイブリダイゼーションによって得られたＤＮＡ断片を適当な微生物に導入し、上記と同様にプロテアーゼ活性を調べることにより、本酵素の活性と同一ではないが、同様の活性を持つ、本酵素類似の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を得ることができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、実施例中の％は重量％を意味する。
実施例１
ピロコッカス・フリオサスのゲノムＤＮＡの調製
ピロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３８の培養は以下のとおりに行った。
トリプトン１％、酵母エキス０．５％、可溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー）０．５％、ＭgＳＯ₄ ０．００３％、ＮaＣl ０．００１％、ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０００１％、ＣoＳＯ₄ ０．０００１％、ＣaＣl₂・７Ｈ₂Ｏ ０．０００１％、ＺnＳＯ₄ ０．０００１％、ＣuＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．１ppm、ＫＡ１（ＳＯ₄）₂ ０．１ppm、Ｈ₃ＢＯ₃ ０．１ppm、Ｎa₂ＭoＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．１ppm、ＮiＣl₂・６Ｈ₂Ｏ ０．２５ppmの組成の培地を２リットル容のメディウムボトルに入れ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み、溶存酸素を除去した後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６時間静置培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集めた。
つぎに、集菌体を２５％スクロースを含む０．０５Ｍトリス−ＨＣl（pＨ８．０）４mlに懸濁し、この懸濁液に０．８mlのリゾチーム［５mg／ml、０．２５Ｍトリス−ＨＣl（pＨ８．０）］、２mlの０．２Ｍ ＥＤＴＡを加えて、２０℃で１時間保温した後、２４mlのＳＥＴ溶液［１５０mＭ ＮaＣl、１mＭ ＥＤＴＡ、２０mＭトリス−ＨＣl（pＨ８．０）］を加え、さらに、５％ＳＤＳ４ml、プロティナーゼＫ（１０mg／ml）４００μlを加え、３７℃、１時間反応させた。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈澱を行い、約３．２mgのゲノムＤＮＡを調製した。
コスミドプロテインライブラリーの作製
ピロコッカス・フリオサスＤＳＭ３６３３のゲノムＤＮＡ４００μgをＳau３ＡＩで部分消化し、密度勾配超遠心法により、３５〜５０kbにサイズ分画した。つぎに、トリプルヘリックスコスミドベクター１μgをＸbaＩ消化した後、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化し、さらに、ＢamＨＩ消化して上記の分画された３５〜５０kbのＤＮＡ１４０μgと混合してライゲーションを行い、ガイガーパック・ゴールド（ストラタジーン社製）を用いたイン・ビトロ・パッケージング法によってピロコッカス・フリオサスのゲノムＤＮＡのフラグメントをラムダファージ粒子中にパッケージングし、ライブラリーを調製した。ついで、得られたライブラリーの一部を用いてイー・コリＤＨ５αＭＣＲに形質導入し、得られた形質転換体のうち数個を選んでコスミドＤＮＡを調製し、適当な大きさの挿入断片があることを確認したのち、改めて、上記のライブラリー中から約５００個の形質転換体を選び、それぞれ別個に１００μg／mlのアンピシリンを含む１５０mlのＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮaＣlの５ｇ／リットル、pＨ７．２）中で培養した。該培養物を遠心し、回収した菌体を２０mＭトリス−ＨＣl、pＨ８．０ １mlに懸濁し、１００℃で１０分間熱処理した。続いて超音波処理を行い、さらに、もう一度１００℃、１０分間熱処理した。遠心後の上清として得られるライゼートをコスミドプロテインライブラリーとした。
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むコスミドの選択
プロテアーゼ活性は、ポリアクリルアミドゲル内におけるゼラチンの分解を調べることにより、確認した。
すなわち、上記コスミドプロテインライブラリーからライゼート５μlずつをとり、０．０５％ゼラチンを含む０．１％ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。泳動終了後のゲルを５０mＭリン酸カリウム緩衝液（pＨ７．０）中、９５℃で２時間保温した後、ゲルを２．５％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０、２５％エタノール、１０％酢酸中で３０分間染色し、さらに２５％メタノール、７％酢酸中にゲルを移し３〜１５時間脱色した。ゼラチンが加水分解されたために、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０でゲルが染色されなくなった部分の位置からプロテアーゼ活性を示す８つのコスミドクローンを選択した。
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドpＴＰＲ１の調製
プロテアーゼ活性を示す８つのコスミドクローンのうちの１つ（コスミドＮo.３０４）を選んでコスミドＤＮＡを調製し、ＳphＩで消化した後、プラスミドベクターpＵＣ１１９のＳphＩサイトにライゲーションした。この組換えプラスミドをイー・コリＪＭ１０９に導入した後、得られた形質転換体についてコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べた。プロテアーゼ活性が認められた形質転換体からプラスミドを調製し、得られた組換えプラスミドをプラスミドpＴＰＲ１と命名した。該プラスミドによって形質転換されたイー・コリＪＭ１０９をEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１と命名した。
図１にプラスミドpＴＰＲ１の制限酵素地図を示す。
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドpＴＰＲ９の調製
上記プラスミドpＴＰＲ１をＸbaＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約２．５kb、約３．３kb、約４．３kbの３つのＤＮＡ断片のうち、約３．３kb、約４．３kbの２つの断片を回収した。約４．３kbのＤＮＡ断片をアルカリホスファターゼ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化した後、約３．３kbのＤＮＡ断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体のプロテアーゼ活性をコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法で調べ、活性を示した形質転換体よりプラスミドを調製した。該プラスミドをプラスミドpＴＰＲ９と命名し、該プラスミドによって形質転換されたイー・コリＪＭ１０９はEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ９と命名した。
図２にプラスミドpＴＰＲ９の制限酵素地図を示す。
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片の検出
上記プラスミドpＴＰＲ１の調製に用いたコスミドＤＮＡをＮotＩで消化後、さらに、ＢamＨＩ、ＢlnＩ、ＥcoＴ２２１、Ｎsp（７５２４）Ｖ、ＰvuＩＩ、ＳalＩ、ＳmaＩおよびＳpeＩでそれぞれ消化し、０．８％アガロースゲルを用いて電気泳動した。泳動後のゲルを、１．５Ｍ ＮaＣlを含む０．５Ｎ ＮaＯＨに浸してゲル内のＤＮＡ断片を変性し、ついで、３Ｍ ＮaＣlを含む０．５Ｍトリス−ＨＣl（pＨ７．５）中でゲルを中和した後、サザンブロッティング法によりゲル内のＤＮＡ断片をハイボンド−Ｎ⁺ナイロンメンブレン（アマシャム社製）にブロッティングした。ブロッティング後のメンブレンは６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮaＣl，０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、pＨ７．０を示す）で洗浄し、風乾後、ＵＶトランスイルミネーター上で３分間紫外線照射してＤＮＡを固定した。
一方、プラスミドpＴＰＲ９をＰstＩおよびＸbaＩで消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約０．７kbのＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡ断片を鋳型とし、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキットＶer２（宝酒造社製）および［α−³²Ｐ］dＣＴＰ（アマシャム社製）を用いて³²Ｐ−標識されたＤＮＡプローブを作製した。
上記のＤＮＡを固定したメンブレンをハイブリダイゼーション緩衝液（０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ）中、６８℃で２時間処理した後、³²Ｐ−標識したＤＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液に移し、６８℃で１４時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを０．５％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で洗浄し、続いて０．５％のＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、６８℃で洗浄した。さらに、メンブレンを０．１×ＳＳＣですすいだ後、風乾し、Ｘ線フィルムを当てて−８０℃、６０時間露光した後、フィルムを現像してオートラジオグラムを作製した。このオートラジオグラムより、コスミドＤＮＡをＮotＩおよびＰvuＩＩで消化することにより得られる約７．５kbのＤＮＡ断片にプロテアーゼ遺伝子が存在することが示された。
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子全長を含むプラスミドpＴＰＲ１２の調製上記プラスミドpＴＰＲ１の調製に用いたコスミドＤＮＡをＮotＩおよびＰvuＩＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行った後、約７〜８kbに相当するＤＮＡ断片を一緒に回収した。これらのＤＮＡ断片を、あらかじめＨincＩＩサイトにＮotＩリンカーを導入したうえ、ＮotＩおよびＳmaＩで消化したプラスミドベクターpＵＣ１９と混合し、ライゲーションを行った。この組換えプラスミドをイー・コリＪＭ１０９に導入し、得られた形質転換体について、コスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べ、活性を示した形質転換体よりプラスミドを調製した。該プラスミドを、プラスミドpＴＰＲ１２と命名し、該プラスミドによって形質転換されたイー・コリＪＭ１０９をEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１２と命名した。
図３にプラスミドpＴＰＲ１２の制限酵素地図を示す。
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子全長を含むプラスミドpＴＰＲ１５の調製
上記プラスミドpＴＰＲ１２をＸbaＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行った後、分離された約３．３kbおよび約７kbの２つのＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。ついで、回収された約７kbのＤＮＡ断片をＫpnＩで消化し、再度、１％アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約３．２kbおよび約３．８kbの２つの断片のうち、約３．２kbのＤＮＡ断片を回収し、ＸbaＩおよびＫpnＩで消化したプラスミドベクターpＵＣ１９とライゲーションして、イー・コリＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体に保持されているプラスミドを調べ、上記３．２kb断片１分子だけが挿入されたプラスミドを選び、これをpＴＰＲ１４と命名した。
図５にプラスミドpＴＰＲ１４の制限酵素地図を示す。
つぎに、上記プラスミドpＴＰＲ１４をＸbaＩで消化し、アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した後、上記約３．３kb断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体についてコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べ、活性を示した形質転換体よりプラスミドを調製した。該プラスミドをプラスミドpＴＰＲ１５と命名し、該プラスミドによって形質転換されたイー・コリＪＭ１０９をEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１５と命名した。
図６にプラスミドpＴＰＲ１５の制限酵素地図を示す。
実施例２
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列の決定
上記プラスミドpＴＰＲ１５に挿入された超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列を決定するために、キロ シークエンス用デレーションキット（宝酒造社製）を用いて、該プラスミドの挿入ＤＮＡ断片部分を種々の長さ欠失させたデレーションミュータントを作製した。これらのうち、適当な長さの欠失が起こったものを幾つか選び、ブカベスト（BcaBEST）ジデオキシシークエンシングキット（宝酒造社製）を用いたジデオキシ法によりそれぞれの挿入ＤＮＡ断片部分の塩基配列を解読したうえ、これらの結果を総合してプラスミドpＴＰＲ１５に含まれる挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列のうち、２つのＤraＩサイトにはさまれた４７６５bpの断片の配列を配列表の配列番号８に示す。さらに、該塩基配列に含まれるオープンリーディングフレームがコードし得る超耐熱性プロテアーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号９に示す。
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドpＴＰＲ１３の調製
上記プラスミドpＴＰＲ１５をＤraＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行った後、分離された約４．８kbのＤＮＡ断片を回収した。ついで、プラスミドベクターpＵＣ１９をＳmaＩで消化し、アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した後、上記約４．８kbＤＮＡ断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体についてコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べ、活性を示した形質転換体よりプラスミドを調製した。該プラスミドをpＴＰＲ１３と命名し、該プラスミドによって形質転換されたイー・コリＪＭ１０９をEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１３と命名した。
図７にプラスミドpＴＰＲ１３の制限酵素地図を示す。
バチルス・サブチリスを形質転換するための超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドpＵＢＰ１３の調製
上記プラスミドpＴＰＲ１３をＫpnＩ、ＢamＨＩで消化して１％アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約４．８kbのＤＮＡ断片を回収した。ついで、プラスミドベクターpＵＢ１８−Ｐ４３をＫpnＩおよびＢamＨＩで消化し、上記の約４．８kbのＤＮＡ断片と混合してライゲーションを行った後、バチルス・サブチリスＤＢ１０４に導入した。得られたカナマイシン耐性の形質転換体についてコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べ、活性を示した形質転換体よりプラスミドを調製した。該プラスミドをプラスミドpＵＢＰ１３と命名し、該プラスミドによって形質転換されたバチルス・サブチリスＤＢ１０４をBacillus subtilis ＤＢ１０４／pＵＢＰ１３と命名した。
図８にプラスミドpＵＢＰ１３の制限酵素地図を示す。
後半部分を欠いた超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドpＴＰＲ３６の調製
上記プラスミドpＴＰＲ１３をＥcoＲＩで消化し、生じた末端をＤＮＡブランティングキット（宝酒造社製）を用いて平滑化し、さらに、ＫpnＩ消化して１％アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約２．８kbのＤＮＡ断片を回収した。次にプラスミドベクターpＵＣ１１９をＸbaＩで消化し、生じた末端を同様に平滑化し、さらに、ＫpnＩ消化を行った後に上記の２．８kbのＤＮＡ断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体についてコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べ、活性を示した形質転換体よりプラスミドを調製した。該プラスミドをプラスミドpＴＰＲ３６と命名し、該プラスミドによって形質転換されたイー・コリＪＭ１０９をEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ３６と命名した。
図９にプラスミドpＴＰＲ３６の制限酵素地図を示す。プラスミドpＴＰＲ３６の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。また、該塩基配列がコードし得る超耐熱性プロテアーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
実施例３
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドの作製
実施例２で得られた本発明の超耐熱性プロテアーゼの推定アミノ酸配列と、既知の微生物由来アルカリ性セリンプロテアーゼのアミノ酸配列との比較から、これらに共通して存在する相同アミノ酸配列が明らかとなった。このうち３つの領域を選び、ＰＣＲによる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の検出にプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計を行った。
図１０、１１および１２に上記の３つの領域にあたる本発明の超耐熱性プロテアーゼのアミノ酸配列、その部分をコードする本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列およびそれをもとに合成したオリゴヌクレオチドＰＲＯ−１Ｆ、ＰＲＯ−２Ｆ、ＰＲＯ−２ＲおよびＰＲＯ−４Ｒの塩基配列の関係を示す。また、配列表の配列番号３、４、５および６にオリゴヌクレオチドＰＲＯ−１Ｆ、ＰＲＯ−２Ｆ、ＰＲＯ−２ＲおよびＰＲＯ−４Ｒの塩基配列を示す。
サーモコッカス・セラーのゲノムＤＮＡの調製
ドイッチェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルチュウレンＧmbＨより入手したサーモコッカス・セラーＤＳＭ２４７６培養液１０mlより遠心分離にて菌体を集め、２５％スクロースを含む５０mＭトリス−ＨＣl（pＨ８．０）１００μlに懸濁した。この懸濁液に２０μlの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１０μlのリゾチーム（１０mg／ml）を加えて２０℃、１時間保温した後、８００μlのＳＥＴ溶液（１５０mＭ ＮaＣl、１mＭ ＥＤＴＡ、２０mＭ トリス−ＨＣl、pＨ８．０）、５０μlの１０％ＳＤＳ、１０μlのプロティナーゼＫ（２０mg／ml）を加え、さらに、３７℃、１時間保温した。フェノール−クロロホルム抽出を行って反応を停止した後、エタノール沈澱を行い、回収したＤＮＡを５０μlのＴＥ緩衝液に溶かしてゲノムＤＮＡ溶液とした。
ＰＣＲによる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の検出
上記のサーモコッカス・セラーのゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチドＰＲＯ−１ＦおよびＰＲＯ−２Ｒ、あるいはオリゴヌクレオチドＰＲＯ−２ＦおよびＰＲＯ−４Ｒを含むＰＣＲ反応液を調製し、９４℃、１分〜５５℃、１分〜７２℃、１分、３５サイクルの反応を行った。この反応液の一部を用いてアガロースゲル電気泳動を行うと、オリゴヌクレオチドＰＲＯ−１ＦおよびＰＲＯ−２Ｒを用いたもので３種類、オリゴヌクレオチドＰＲＯ−２ＦおよびＰＲＯ−４Ｒを用いたもので１種類のＤＮＡ断片の増幅が認められた。これらの増幅断片をアガロースゲルより回収し、ＤＮＡブランティングキットを用いてＤＮＡの末端を平滑化した後、さらに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を用いて末端をリン酸化した。ついで、プラスミドベクターpＵＣ１８をＨincIIで消化し、アルカリホスファターゼ処理して脱リン酸化した後、上記のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、適当なＤＮＡ断片を挿入されているものを選んでジデオキシ法により挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を調べた。これらのプラスミドのうち、オリゴヌクレオチドＰＲＯ−１ＦとＰＲＯ−２Ｒを用いて増幅された約１５０bpのＤＮＡ断片を含むプラスミドp１Ｆ−２Ｒ（２）およびオリゴヌクレオチドＰＲＯ−２ＦとＰＲＯ−４Ｒを用いて増幅された約５５０bpのＤＮＡ断片を含むプラスミドp２Ｆ−４Ｒについて得られた塩基配列より推定されるアミノ酸配列には、本発明のピロコッカス・フリオサス由来の超耐熱性プロテアーゼおよびサブチリシン等のアミノ酸配列と相同性のある配列が含まれていた。
配列表の配列番号１０にプラスミドp１Ｆ−２Ｒ（２）の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列とそれから推定されるアミノ酸配列を、また、配列表の配列番号１１にプラスミドp２Ｆ−４Ｒの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列とそれから推定されるアミノ酸配列をそれぞれ示す。配列表の配列番号１０に示された塩基配列のうち１番目から２１番目にかけてと１１３番目から１４５番目にかけての配列および配列表の配列番号１１に示された塩基配列のうち１番目から３２番目にかけてと５３２番目から５６４番目にかけての配列はＰＣＲに用いられたプライマー（それぞれオリゴヌクレオチドＰＲＯ−１Ｆ、ＰＲＯ−２Ｒ、ＰＲＯ−２ＦおよびＰＲＯ−４Ｒに相当）の塩基配列である。
図１３にプラスミドp２Ｆ−４Ｒの制限酵素地図を示す。
サーモコッカス・セラー由来プロテアーゼ遺伝子のスクリーニング
上記のサーモコッカス・セラーのゲノムＤＮＡをＳau３ＡＩで部分消化し、dＡＴＰ、dＧＴＰ存在下でクレノウ・フラグメント（宝酒造社製）を作用させてＤＮＡ末端を部分修復した。このＤＮＡ断片をラムダＧＥＭ−１１ ＸhoＩ ハーフサイトアームベクター（プロメガ社製）と混合してライゲーションを行った後、ガイガーパックゴールドを用いたイン・ビトロ・パッケージングを行い、サーモコッカス・セラーのゲノムＤＮＡ断片を含むラムダファージライブラリーを作製した。このライブラリーの一部をイー・コリＬＥ３９２に形質導入してプレート上にプラークを形成させた後、プラークをハイボンド−Ｎ⁺メンブレン上にトランスファーした。トランスファー後のメンブレンを１．５Ｍ ＮaＣlを含む０．５Ｎ ＮaＯＨ、ついで、３Ｍ ＮaＣlを含む０．５Ｍ トリス−ＨＣl（pＨ７．５）で処理し、さらに、６×ＳＳＣで洗浄後、風乾し、ＵＶトランスイルミネーター上で紫外線照射してファージＤＮＡをメンブレンに固定した。
一方、プラスミドp２Ｆ−４ＲをＰmaＣＩ（宝酒造社製）およびＳtuＩ（宝酒造社製）で消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約０．５kbのＤＮＡ断片を回収した。該断片を鋳型とし、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキットＶer２および［α−³²Ｐ］dＣＴＰを用いて³²Ｐ−標識されたＤＮＡプローブを作製した。
上記のＤＮＡを固定したメンブレンをハイブリダイゼーション緩衝液（０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ）中、５０℃で２時間処理した後、³²Ｐ−標識したＤＮＡプローブを含む同緩衝液に移し、５０℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを０．５％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で洗浄し、ついで、０．５％のＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中、５０℃で洗浄した。さらに、メンブレンを１×ＳＳＣですすいだ後、風乾し、Ｘ線フィルムを当てて−８０℃で６時間露光し、オートラジオグラムを作製した。約４０００個のファージクローンをスクリーニングした結果、プロテアーゼ遺伝子を含む１つのファージクローンを得た。オートラジオグラム上のシグナルからこのファージクローンの位置を調べ、メンブレンのトランスファーに用いたプレート上の対応するプラークを１％のクロロホルムを含む１mlのＳＭ緩衝液（５０mＭ トリス−ＨＣl、０．１Ｍ ＮaＣl、８mＭ ＭgＳＯ₄、０．０１％ゼラチン（pＨ７．５））中に単離した。
プロテアーゼ遺伝子を含むファージＤＮＡ断片の検出
上記のファージクローンを用いて形質導入したイー・コリＬＥ３９２をＮＺＣＹＭ培地（Ｂio １０１社製）中、３７℃、１５時間培養して得られる培養液より上清を集め、キアゲン−ラムダキット（ＤＩＡＧＥＮ社製）を用いてファージＤＮＡを調製した。得られたファージＤＮＡをＢamＨＩ、ＥcoＲＩ、ＥcoＲＶ、ＨincII、ＫpnＩ、ＮcoＩ、ＰstＩ、ＳacＩ、ＳalＩ、ＳmaＩおよびＳphＩ（以上、宝酒造社製）でそれぞれ消化し、１％アガロースゲルを用いて電気泳動した後、実施例１の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片の検出に用いられた方法でＤＮＡ断片を固定したメンブレンを調製した。このメンブレンをハイブリダイゼーション緩衝液中、５０℃で４時間処理した後、上記のサーモコッカス・セラー由来プロテアーゼ遺伝子のスクリーニングに用いられたものと同じ³²Ｐ−標識したＤＮＡプローブを含む同緩衝液に移し、５０℃で１８時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを０．５％のＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中、５０℃で洗浄し、ついで、１×ＳＳＣですすいだ。このメンブレンを風乾後、Ｘ線フィルムに当てて−８０℃で２時間露光し、オートラジオグラムを作製した。このオートラジオグラムより、ＫpnＩで消化したファージＤＮＡでは約９kbのＤＮＡ断片にプロテアーゼ遺伝子が含まれていることが示された。
プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドpＴＣ１の調製
上記のプロテアーゼ遺伝子を含むファージＤＮＡをＫpnＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行った後、約９kbのＤＮＡ断片をゲルより回収した。ついで、プラスミドベクターpＵＣ１１９をＫpnＩで消化し、アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した後、上記の約９kbのＤＮＡ断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、上記の約９kbのＤＮＡ断片１分子のみが含まれているものを選んで、これをプラスミドpＴＣ１と命名し、また、該プラスミドによって形質転換されたイー・コリＪＭ１０９をEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＣ１と命名した。
図１４にプラスミドpＴＣ１の制限酵素地図を示す。
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドpＴＣ３の調製
上記プラスミドpＴＣ１をＫpnＩで消化後、さらに、ＢamＨＩ、ＰstＩ、ＳphＩでそれぞれ消化し、１％アガロースゲルを用いて電気泳動した後、上記のプロテアーゼ遺伝子を含むファージＤＮＡ断片の検出と全く同じ操作により、メンブレンへのＤＮＡ断片のトランスファーおよび超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の検出を行った。得られたオートラジオグラム上のシグナルより、プラスミドpＴＣ１をＫpnＩとＢamＨＩで消化して得られる約５kbのＤＮＡ断片に超耐熱性プロテアーゼ遺伝子が含まれていることが示された。
そこで、プラスミドpＴＣ１をＫpnＩおよびＢamＨＩで消化した後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約５kbのＤＮＡ断片を単離した。ついで、プラスミドベクターpＵＣ１１９をＫpnＩおよびＢamＨＩで消化し、上記の約５kbのＤＮＡ断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、上記の約５kbのＤＮＡ断片が含まれているものを選んでこれをプラスミドpＴＣ３と命名し、また、該プラスミドによって形質転換されたイー・コリＪＭ１０９をEscherichia coli ＪＭ１０９／pＴＣ３と命名した。
図１５にプラスミドpＴＣ３の制限酵素地図を示す。
プラスミドpＴＣ３に含まれる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列の決定
上記プラスミドpＴＣ３に含まれる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列を決定するために、配列表の配列番号１０および１１に示される塩基配列をもとに、プライマーとして用いる６種のオリゴヌクレオチドを合成した。配列表の配列番号１２、１３、１４、１５、１６および１７に合成したオリゴヌクレオチドＴＣＥ−２、ＴＣＥ−４、ＳＥＦ−３、ＳＥＲ−１、ＳＥＲ−３およびＴＣＥ−６Ｒの塩基配列を示す。上記のオリゴヌクレオチドをプライマーに、プラスミドpＴＣ３を鋳型に用いたジデオキシ法により得られた結果を総合して、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
配列表の配列番号７に、得られた塩基配列のうちの一部を示す。また、配列表の配列番号１８に、該塩基配列がコードしていると推定されるアミノ酸配列を示す。
実施例４
酵素標品の調製
実施例２で得られた、本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含有するプラスミドpＴＰＲ３６を導入したイー・コリＪＭ１０９、Escherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ３６を１００μg／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮaＣl５ｇ／リットル、pＨ７．２）５ml中で３７℃で１４時間振とう培養した。１リットル容の三角フラスコに同様の培地２００mlを準備し、上記の培養液２mlを接種して３７℃で１０時間振とう培養した。培養液を遠心分離して得られた湿重量１．６ｇの菌体を２mlの２０mＭ トリス−ＨＣl、pＨ８．０に懸濁した後、超音波処理を行い、遠心分離して上清を得た。この上清を１００℃で５分間処理した後、再度遠心分離して得た上清を粗酵素液（酵素標品ＰＦ−３６）とした。
また、本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含有するプラスミドpＴＰＲ１３を導入したイー・コリＪＭ１０９、Escherichia coli ＪＭ１０９／pＴＰＲ１３を用い、同様な操作により粗酵素液（酵素標品ＰＦ−１３）を調製した。
さらに、本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含有するプラスミドpＵＢＰ１３を導入したバチルス サブチリスＤＢ１０４、Bacillus subtilis ＤＢ１０４／pＵＢＰ１３を１０μg／mlのカナマイシンを含むＬＢ培地５ml中で３７℃で１４時間振とう培養した。２リットル容の３角フラスコ２本に同様の培地６００mlずつを準備し、それぞれに上記の培養液２mlずつを接種して３７℃で２６時間培養した。培養液を遠心分離して得られた菌体を１５mlの２０mＭ トリス−ＨＣl、pＨ８．０に懸濁した後、超音波処理を行い、遠心分離して上清を得た。この上清を１００℃で５分間処理した後、再度、遠心分離し、得られた上清に５０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを加え、生じた沈澱物を遠心分離によって回収した。回収した沈澱物を２mlの２０mＭ トリス−ＨＣl、pＨ８．０に懸濁した後、同緩衝液に対して透析し、得られた透析内液を粗精製酵素標品（酵素標品 ＰＦ−ＢＳ１３）とした。
これらの酵素標品およびプラスミドの調製に用いたコスミドクローンのライゼートを用いて上記のゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いる酵素活性検出方法でプロテアーゼ活性を調べた。
図１６に本発明により得られる超耐熱性プロテアーゼの熱安定性を、また図１７に本発明により得られる超耐熱性プロテアーゼの至適pＨを示す。さらに、図１８は各サンプル（酵素標品 ＰＦ−３６、酵素標品 ＰＦ−１３、酵素標品 ＰＦ−ＢＳ１３およびライゼート）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の活性染色の結果を示す図であり、各サンプル共にＳＤＳの存在下、９５℃で活性を示した。
以上記載したとおり、本発明により、９５℃で活性を示す超耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝子が得られた。該遺伝子を用いて超耐熱性プロテアーゼを高純度かつ大量に供給することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１はプラスミドpＴＰＲ１の制限酵素地図である。
図２はプラスミドpＴＰＲ９の制限酵素地図である。
図３はプラスミドpＴＰＲ１２の制限酵素地図である。
図４はプラスミド中に含有されるピロコッカス フリオサス由来のＤＮＡの制限酵素地図を比較する図である。
図５はプラスミドpＴＰＲ１４の制限酵素地図である。
図６はプラスミドpＴＰＲ１５の制限酵素地図である。
図７はプラスミドpＴＰＲ１３の制限酵素地図である。
図８はプラスミドpＵＢＰ１３の制限酵素地図である。
図９はプラスミドpＴＰＲ３６の制限酵素地図である。
図１０はオリゴヌクレオチドＰＲＯ−１Ｆの設計を示す図である。
図１１はオリゴヌクレオチドＰＲＯ−２ＦおよびＰＲＯ−２Ｒの設計を示す図である。
図１２はオリゴヌクレオチドＰＲＯ−４Ｒの設計を示す図である。
図１３はプラスミドp２Ｆ−４Ｒの制限酵素地図である。
図１４はプラスミドpＴＣ１の制限酵素地図である。
図１５はプラスミドpＴＣ３の制限酵素地図である。
図１６は本発明により得られる超耐熱性プロテアーゼの熱安定性を示す図である。
図１７は本発明により得られる超耐熱性プロテアーゼの至適pＨを示す図である。
図１８は本発明により得られる超耐熱性プロテアーゼのゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の活性染色のパターンを示す図である。
配列番号：1
配列の長さ：903
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：

配列番号：2
配列の長さ：2835
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：

配列番号：3
配列の長さ：35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 DNA）
配列：

配列番号：4
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 DNA）
配列：

配列番号：5
配列の長さ：33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 DNA）
配列：

配列番号：6
配列の長さ：34
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 DNA）
配列：

配列番号：7
配列の長さ：898
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：

配列番号：8
配列の長さ：4765
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：

配列番号：9
配列の長さ：1398
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：

配列番号：10
配列の長さ：145
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（PCR断片）
アンチセンス：NO
配列：

配列番号：11
配列の長さ：564
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（PCR断片）
アンチセンス：NO
配列：

配列番号：12
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 DNA）
配列：

配列番号：13
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 DNA）
配列：

配列番号：14
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 DNA）
配列：

配列番号：15
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 DNA）
配列：

配列番号：16
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 DNA）
配列：

配列番号：17
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成 DNA）
配列：

配列番号：18
配列の長さ：237
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：

Claims (4)

1. 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする超耐熱性プロテアーゼ遺伝子であって、
   下記に示す制限酵素地図で表されるピロコッカス フリオサス由来の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を除く該遺伝子。
   

   
2. 配列表の配列番号２で表される塩基配列を有することを特徴とする請求項１記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子。
3. 請求項２記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子に０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中、５０℃で１２〜２０時間インキュベートした後、０．５％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ、５０℃で洗浄する条件においてハイブリダイズ可能な超耐熱性プロテアーゼ遺伝子であって、
   下記に示す制限酵素地図で表されるピロコッカス フリオサス由来の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子
   

   

   に厳密な条件下においてハイブリダイズ可能な超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を除く該遺伝子。
4. 請求項１〜３のいずれか１項記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を組込んだ組換えプラスミドで形質転換した形質転換体を培養し、該培養物から超耐熱性プロテアーゼを採取することを特徴とする超耐熱性プロテアーゼの製造方法。

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