JP3708946B2 - 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子 - Google Patents
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Classifications
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Description
本発明は、工業用酵素として有用な超耐熱性プロテアーゼをコードする遺伝子および該酵素の遺伝子工学的製造方法に関する。
プロテアーゼは蛋白質中のペプチド結合を切断する酵素であり、動物、植物、微生物より数多くの酵素が見い出されている。その用途は研究用試薬、医薬の他、洗剤への添加、食品の加工、逆反応を利用した化学合成といった工業的分野にも及び、産業上、極めて重要な酵素と言える。工業的分野で使用されるプロテアーゼには物理的、化学的に高い安定性を要求されることから、特に耐熱性の酵素が好んで使用されている。バチルス(Bacillus)属細菌の生産するプロテアーゼは割合に高い耐熱性を示すことから、現在、産業的に利用されているプロテアーゼの主流を占めている。
しかし、さらに優れた酵素が望まれており、高温で生育する微生物、例えば、好熱性バチルス属細菌より酵素を取得しようとする試みもなされている。
これら超好熱菌の生産するプロテアーゼは高い耐熱性を持つことから、これまでの酵素にない用途へも応用が期待されるが、上記の文献においては無細胞抽出液、あるいは培養液上清より得られた粗酵素液中に耐熱性のプロテアーゼ活性が存在することが示されているだけであり、精製、純化された酵素の性質等については明らかにされていない。また、これら超好熱菌からの酵素の取得には高温での微生物培養操作を要するため、工業的な酵素製造方法としては問題を有している。
本発明者らは超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を取得するため、独自にピロコッカス・フリオサスDSM3638菌体および培養液上清よりプロテアーゼを精製し、酵素の部分アミノ酸配列を決定することを試みた。しかし、菌体、培養液上清のどちらの場合もプロテアーゼの精製は極めて困難であり、部分アミノ酸配列を決定し得る純度の酵素標品を得ることはできなかった。
これにより、上記の熱処理に耐性のプロテアーゼを発現する、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むコスミドクローンを得ることができる。
プラスミドp2F−4Rの制限酵素地図を図13に示す。図中太実線がプラスミドベクターpUC18への挿入DNA断片である。
図14にプラスミドpTC1の制限酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターpUC119への挿入DNA断片である。
本発明で得られる酵素はゼラチンを分解し、短鎖ポリペプチドを生成する。さらに、カゼインを分解し、短鎖ポリペプチドを生成する。
酵素活性の検出は、酵素によるゼラチンの分解をSDS−ポリアクリルアミドゲル上で確認する方法により行った。すなわち、酵素活性を検出しようとする酵素標本を適度に希釈し、その試料溶液10μlに2.5μlの試料用緩衝液(50mM トリス−HCl pH7.6、5%SDS、5% 2−メルカプトエタノール、0.005% ブロモフェノールブルー、50% グリセロール)を加えて100℃、5分間熱処理を行った後、0.05%のゼラチンを含む0.1%SDS−10%ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。泳動終了後、ゲルを50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中に浸して95℃、2時間保温して酵素反応を行い、ついで、ゲルを2.5%クーマシーブリリアントブルーR−250、25%エタノール、10%酢酸中で30分間染色し、さらに、25%メタノール、7%酢酸中にゲルを移し、3〜15時間かけて余分の色素を除いた。プロテアーゼによってペプチドに分解されたゼラチンは酵素反応中にゲル外へ拡散し、その部分がクーマシーブリリアントブルーで染色されなくなることからプロテアーゼ活性の存在を検出した。本発明により得られる酵素標品、PF−13、PF−36およびPF−BS13は95℃においてゼラチン分解活性を有していた。
酵素の安定性は、熱処理した酵素標品中の残存活性を上記(2)に示したゼラチンを含むSDS−ポリアクリルアミドゲルを用いる方法により検出し、調べた。すなわち、酵素標品を95℃で3時間保温した後、そのうちの適当量をとって酵素活性の検出を行い、95℃での処理を行わなかったものと比較した。95℃、3時間の保温により、プロテアーゼ活性の泳動位置が若干変化したが、酵素活性の低下はほとんど見られなかった。本発明により得られる酵素標品、PF−13、PF−36およびPF−BS13は95℃、3時間の熱処理に対して安定であった。
酵素標品をゼラチンを含むSDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、2mM EDTAまたは2mM フェニルメタンスルホニルフルオライド(PMSF)を含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中で酵素反応を行い、両試薬の酵素活性への影響を調べた。本発明により得られる酵素標品、PF−13、PF−36およびPF−BS13の示す酵素活性は2mM EDTAを含む緩衝液を用いた場合には50mMリン酸カリウム緩衝液のみを用いた場合と差は見られなかった。一方、2mM PMSFを含む緩衝液を用いた場合にはどの標品においてもゲル中のゼラチンの分解量が減少しており、これらの標品中の酵素活性がPMSFによって阻害されることが示された。
本発明で得られる酵素標品のゼラチンを含むSDS−ポリアクリルアミドゲル上における分子量を調べた。酵素標品PF−13では95kDa〜51kDaに複数の活性バンドが出現した。試料の適用量等により泳動距離が変化するが主バンドは84kDa、79kDa、66kDa、54kDaおよび51kDaであった。酵素標品を最終濃度0.1%のSDS存在下、95℃で3時間保温した後に泳動すると、63kDaおよび51kDaのバンドが強くなった。酵素標品PF−BS13では上記の酵素標品PF−13と同じ結果が得られた。また、酵素標品PF−36の場合には63kDaおよび59kDaに主バンドが見られる他、いくつかの弱いバンドが認められた。
本発明で得られる酵素標品、PF−13およびPF−36の至適pHを調べた。酵素標品をゼラチンを含むSDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、各種のpHの緩衝液中にゲルを浸して酵素反応を行い、至適pHを調べた。緩衝液には、pH4.0〜6.0においては50mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH6.0〜8.0においては50mM リン酸カリウム緩衝液、pH9.0〜10.0においては50mM ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いた。両酵素標品ともpH6.0〜10.0でゼラチン分解活性を示し、その至適pHはpH8.0〜9.0であった。
ピロコッカス・フリオサスのゲノムDNAの調製
ピロコッカス・フリオサスDSM3638の培養は以下のとおりに行った。
トリプトン1%、酵母エキス0.5%、可溶性デンプン1%、ジャマリンS・ソリッド(ジャマリンラボラトリー)3.5%、ジャマリンS・リキッド(ジャマリンラボラトリー)0.5%、MgSO4 0.003%、NaCl 0.001%、FeSO4・7H2O 0.0001%、CoSO4 0.0001%、CaCl2・7H2O 0.0001%、ZnSO4 0.0001%、CuSO4・5H2O 0.1ppm、KA1(SO4)2 0.1ppm、H3BO3 0.1ppm、Na2MoO4・2H2O 0.1ppm、NiCl2・6H2O 0.25ppmの組成の培地を2リットル容のメディウムボトルに入れ、120℃、20分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み、溶存酸素を除去した後、これに上記菌株を接種して95℃、16時間静置培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集めた。
ピロコッカス・フリオサスDSM3633のゲノムDNA400μgをSau3AIで部分消化し、密度勾配超遠心法により、35〜50kbにサイズ分画した。つぎに、トリプルヘリックスコスミドベクター1μgをXbaI消化した後、アルカリホスファターゼ(宝酒造社製)を用いて脱リン酸化し、さらに、BamHI消化して上記の分画された35〜50kbのDNA140μgと混合してライゲーションを行い、ガイガーパック・ゴールド(ストラタジーン社製)を用いたイン・ビトロ・パッケージング法によってピロコッカス・フリオサスのゲノムDNAのフラグメントをラムダファージ粒子中にパッケージングし、ライブラリーを調製した。ついで、得られたライブラリーの一部を用いてイー・コリDH5αMCRに形質導入し、得られた形質転換体のうち数個を選んでコスミドDNAを調製し、適当な大きさの挿入断片があることを確認したのち、改めて、上記のライブラリー中から約500個の形質転換体を選び、それぞれ別個に100μg/mlのアンピシリンを含む150mlのLB培地(トリプトン10g/リットル、酵母エキス5g/リットル、NaClの5g/リットル、pH7.2)中で培養した。該培養物を遠心し、回収した菌体を20mMトリス−HCl、pH8.0 1mlに懸濁し、100℃で10分間熱処理した。続いて超音波処理を行い、さらに、もう一度100℃、10分間熱処理した。遠心後の上清として得られるライゼートをコスミドプロテインライブラリーとした。
プロテアーゼ活性は、ポリアクリルアミドゲル内におけるゼラチンの分解を調べることにより、確認した。
すなわち、上記コスミドプロテインライブラリーからライゼート5μlずつをとり、0.05%ゼラチンを含む0.1%SDS−10%ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。泳動終了後のゲルを50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中、95℃で2時間保温した後、ゲルを2.5%クーマシーブリリアントブルーR−250、25%エタノール、10%酢酸中で30分間染色し、さらに25%メタノール、7%酢酸中にゲルを移し3〜15時間脱色した。ゼラチンが加水分解されたために、クーマシーブリリアントブルーR250でゲルが染色されなくなった部分の位置からプロテアーゼ活性を示す8つのコスミドクローンを選択した。
プロテアーゼ活性を示す8つのコスミドクローンのうちの1つ(コスミドNo.304)を選んでコスミドDNAを調製し、SphIで消化した後、プラスミドベクターpUC119のSphIサイトにライゲーションした。この組換えプラスミドをイー・コリJM109に導入した後、得られた形質転換体についてコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べた。プロテアーゼ活性が認められた形質転換体からプラスミドを調製し、得られた組換えプラスミドをプラスミドpTPR1と命名した。該プラスミドによって形質転換されたイー・コリJM109をEscherichia coli JM109/pTPR1と命名した。
図1にプラスミドpTPR1の制限酵素地図を示す。
上記プラスミドpTPR1をXbaIで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約2.5kb、約3.3kb、約4.3kbの3つのDNA断片のうち、約3.3kb、約4.3kbの2つの断片を回収した。約4.3kbのDNA断片をアルカリホスファターゼ(宝酒造社製)を用いて脱リン酸化した後、約3.3kbのDNA断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリJM109に導入した。得られた形質転換体のプロテアーゼ活性をコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法で調べ、活性を示した形質転換体よりプラスミドを調製した。該プラスミドをプラスミドpTPR9と命名し、該プラスミドによって形質転換されたイー・コリJM109はEscherichia coli JM109/pTPR9と命名した。
図2にプラスミドpTPR9の制限酵素地図を示す。
上記プラスミドpTPR1の調製に用いたコスミドDNAをNotIで消化後、さらに、BamHI、BlnI、EcoT22I、Nsp(7524)V、PvuII、SalI、SmaIおよびSpeIでそれぞれ消化し、0.8%アガロースゲルを用いて電気泳動した。泳動後のゲルを、1.5M NaClを含む0.5N NaOHに浸してゲル内のDNA断片を変性し、ついで、3M NaClを含む0.5Mトリス−HCl(pH7.5)中でゲルを中和した後、サザンブロッティング法によりゲル内のDNA断片をハイボンド−N+ナイロンメンブレン(アマシャム社製)にブロッティングした。ブロッティング後のメンブレンは6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0を示す)で洗浄し、風乾後、UVトランスイルミネーター上で3分間紫外線照射してDNAを固定した。
上記プラスミドpTPR1の調製に用いたコスミドDNAをNotIおよびPvuIIで消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動を行った後、約7〜8kbに相当するDNA断片を一緒に回収した。これらのDNA断片を、あらかじめHincIIサイトにNotIリンカーを導入したうえ、NotIおよびSmaIで消化したプラスミドベクターpUC19と混合し、ライゲーションを行った。この組換えプラスミドをイー・コリJM109に導入し、得られた形質転換体について、コスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べ、活性を示した形質転換体よりプラスミドを調製した。該プラスミドを、プラスミドpTPR12と命名し、該プラスミドによって形質転換されたイー・コリJM109をEscherichia coli JM109/pTPR12と命名した。
図3にプラスミドpTPR12の制限酵素地図を示す。
上記プラスミドpTPR12をXbaIで消化し、1%アガロースゲル電気泳動を行った後、分離された約3.3kbおよび約7kbの2つのDNA断片をそれぞれ回収した。ついで、回収された約7kbのDNA断片をKpnIで消化し、再度、1%アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約3.2kbおよび約3.8kbの2つの断片のうち、約3.2kbのDNA断片を回収し、XbaIおよびKpnIで消化したプラスミドベクターpUC19とライゲーションして、イー・コリJM109に導入した。得られた形質転換体に保持されているプラスミドを調べ、上記3.2kb断片1分子だけが挿入されたプラスミドを選び、これをpTPR14と命名した。
図5にプラスミドpTPR14の制限酵素地図を示す。
図6にプラスミドpTPR15の制限酵素地図を示す。
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列の決定
上記プラスミドpTPR15に挿入された超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列を決定するために、キロ シークエンス用デレーションキット(宝酒造社製)を用いて、該プラスミドの挿入DNA断片部分を種々の長さ欠失させたデレーションミュータントを作製した。これらのうち、適当な長さの欠失が起こったものを幾つか選び、ブカベスト(BcaBEST)ジデオキシシークエンシングキット(宝酒造社製)を用いたジデオキシ法によりそれぞれの挿入DNA断片部分の塩基配列を解読したうえ、これらの結果を総合してプラスミドpTPR15に含まれる挿入DNA断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列のうち、2つのDraIサイトにはさまれた4765bpの断片の配列を配列表の配列番号8に示す。さらに、該塩基配列に含まれるオープンリーディングフレームがコードし得る超耐熱性プロテアーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号9に示す。
上記プラスミドpTPR15をDraIで消化し、1%アガロースゲル電気泳動を行った後、分離された約4.8kbのDNA断片を回収した。ついで、プラスミドベクターpUC19をSmaIで消化し、アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した後、上記約4.8kb DNA断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリJM109に導入した。得られた形質転換体についてコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べ、活性を示した形質転換体よりプラスミドを調製した。該プラスミドをpTPR13と命名し、該プラスミドによって形質転換されたイー・コリJM109をEscherichia coli JM109/pTPR13と命名した。
図7にプラスミドpTPR13の制限酵素地図を示す。
上記プラスミドpTPR13をKpnI、BamHIで消化して1%アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約4.8kbのDNA断片を回収した。ついで、プラスミドベクターpUB18−P43をKpnIおよびBamHIで消化し、上記の約4.8kbのDNA断片と混合してライゲーションを行った後、バチルス・サブチリスDB104に導入した。得られたカナマイシン耐性の形質転換体についてコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べ、活性を示した形質転換体よりプラスミドを調製した。該プラスミドをプラスミドpUBP13と命名し、該プラスミドによって形質転換されたバチルス・サブチリスDB104をBacillus subtilis DB104/pUBP13と命名した。
図8にプラスミドpUBP13の制限酵素地図を示す。
上記プラスミドpTPR13をEcoRIで消化し、生じた末端をDNAブランティングキット(宝酒造社製)を用いて平滑化し、さらに、KpnI消化して1%アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約2.8kbのDNA断片を回収した。次にプラスミドベクターpUC119をXbaIで消化し、生じた末端を同様に平滑化し、さらに、KpnI消化を行った後に上記の2.8kbのDNA断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリJM109に導入した。得られた形質転換体についてコスミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた方法でプロテアーゼ活性を調べ、活性を示した形質転換体よりプラスミドを調製した。該プラスミドをプラスミドpTPR36と命名し、該プラスミドによって形質転換されたイー・コリJM109をEscherichia coli JM109/pTPR36と命名した。
図9にプラスミドpTPR36の制限酵素地図を示す。プラスミドpTPR36の挿入DNA断片の塩基配列を配列表の配列番号2に示す。また、該塩基配列がコードし得る超耐熱性プロテアーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号1に示す。
超耐熱性プロテアーゼ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドの作製
実施例2で得られた本発明の超耐熱性プロテアーゼの推定アミノ酸配列と、既知の微生物由来アルカリ性セリンプロテアーゼのアミノ酸配列との比較から、これらに共通して存在する相同アミノ酸配列が明らかとなった。このうち3つの領域を選び、PCRによる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の検出にプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計を行った。
ドイッチェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルチュウレンGmbHより入手したサーモコッカス・セラー DSM2476培養液10mlより遠心分離にて菌体を集め、25%スクロースを含む50mMトリス−HCl(pH8.0)100μlに懸濁した。この懸濁液に20μlの0.5M EDTA、10μlのリゾチーム(10mg/ml)を加えて20℃、1時間保温した後、800μlのSET溶液(150mM NaCl、1mM EDTA、20mM トリス−HCl、pH8.0)、50μlの10%SDS、10μlのプロティナーゼK(20mg/ml)を加え、さらに、37℃、1時間保温した。フェノール−クロロホルム抽出を行って反応を停止した後、エタノール沈澱を行い、回収したDNAを50μlのTE緩衝液に溶かしてゲノムDNA溶液とした。
上記のサーモコッカス・セラーのゲノムDNAとオリゴヌクレオチドPRO−1FおよびPRO−2R、あるいはオリゴヌクレオチドPRO−2FおよびPRO−4Rを含むPCR反応液を調製し、94℃、1分〜55℃、1分〜72℃、1分、35サイクルの反応を行った。この反応液の一部を用いてアガロースゲル電気泳動を行うと、オリゴヌクレオチドPRO−1FおよびPRO−2Rを用いたもので3種類、オリゴヌクレオチドPRO−2FおよびPRO−4Rを用いたもので1種類のDNA断片の増幅が認められた。これらの増幅断片をアガロースゲルより回収し、DNAブランティングキットを用いてDNAの末端を平滑化した後、さらに、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造社製)を用いて末端をリン酸化した。ついで、プラスミドベクターpUC18をHincIIで消化し、アルカリホスファターゼ処理して脱リン酸化した後、上記のPCR増幅DNA断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリJM109に導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、適当なDNA断片を挿入されているものを選んでジデオキシ法により挿入DNA断片の塩基配列を調べた。これらのプラスミドのうち、オリゴヌクレオチドPRO−1FとPRO−2Rを用いて増幅された約150bpのDNA断片を含むプラスミドp1F−2R(2)およびオリゴヌクレオチドPRO−2FとPRO−4Rを用いて増幅された約550bpのDNA断片を含むプラスミドp2F−4Rについて得られた塩基配列より推定されるアミノ酸配列には、本発明のピロコッカス・フリオサス由来の超耐熱性プロテアーゼおよびサブチリシン等のアミノ酸配列と相同性のある配列が含まれていた。
図13にプラスミドp2F−4Rの制限酵素地図を示す。
上記のサーモコッカス・セラーのゲノムDNAをSau3AIで部分消化し、dATP、dGTP存在下でクレノウ・フラグメント(宝酒造社製)を作用させてDNA末端を部分修復した。このDNA断片をラムダGEM−11 XhoI ハーフサイトアームベクター(プロメガ社製)と混合してライゲーションを行った後、ガイガーパックゴールドを用いたイン・ビトロ・パッケージングを行い、サーモコッカス・セラーのゲノムDNA断片を含むラムダファージライブラリーを作製した。このライブラリーの一部をイー・コリLE392に形質導入してプレート上にプラークを形成させた後、プラークをハイボンド−N+メンブレン上にトランスファーした。トランスファー後のメンブレンを1.5M NaClを含む0.5N NaOH、ついで、3M NaClを含む0.5M トリス−HCl(pH7.5)で処理し、さらに、6×SSCで洗浄後、風乾し、UVトランスイルミネーター上で紫外線照射してファージDNAをメンブレンに固定した。
(0.5%SDS、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%フィコール400、0.01%変性サケ精子DNAを含む6×SSC)中、50℃で2時間処理した後、32P−標識したDNAプローブを含む同緩衝液に移し、50℃で15時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを0.5%のSDSを含む2×SSC中、室温で洗浄し、ついで、0.5%のSDSを含む1×SSC中、50℃で洗浄した。さらに、メンブレンを1×SSCですすいだ後、風乾し、X線フィルムを当てて−80℃で6時間露光し、オートラジオグラムを作製した。約4000個のファージクローンをスクリーニングした結果、プロテアーゼ遺伝子を含む1つのファージクローンを得た。オートラジオグラム上のシグナルからこのファージクローンの位置を調べ、メンブレンのトランスファーに用いたプレート上の対応するプラークを1%のクロロホルムを含む1mlのSM緩衝液(50mM トリスーHCl、0.1M NaCl、8mM MgSO4、0.01%ゼラチン(pH7.5))中に単離した。
上記のファージクローンを用いて形質導入したイー・コリLE392をNZCYM培地(Bio 101社製)中、37℃、15時間培養して得られる培養液より上清を集め、キアゲン−ラムダキット(DIAGEN社製)を用いてファージDNAを調製した。得られたファージDNAをBamHI、EcoRI、EcoRV、HincII、KpnI、NcoI、PstI、SacI、SalI、SmaIおよびSphI(以上、宝酒造社製)でそれぞれ消化し、1%アガロースゲルを用いて電気泳動した後、実施例1の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子全長を含むDNA断片の検出に用いられた方法でDNA断片を固定したメンブレンを調製した。このメンブレンをハイブリダイゼーション緩衝液中、50℃で4時間処理した後、上記のサーモコッカス・セラー由来プロテアーゼ遺伝子のスクリーニングに用いられたものと同じ32P−標識したDNAプローブを含む同緩衝液に移し、50℃で18時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、メンブレンを0.5%のSDSを含む1×SSC中、50℃で洗浄し、ついで、1×SSCですすいだ。このメンブレンを風乾後、X線フィルムに当てて−80℃で2時間露光し、オートラジオグラムを作製した。このオートラジオグラムより、KpnIで消化したファージDNAでは約9kbのDNA断片にプロテアーゼ遺伝子が含まれていることが示された。
上記のプロテアーゼ遺伝子を含むファージDNAをKpnIで消化し、1%アガロースゲル電気泳動を行った後、約9kbのDNA断片をゲルより回収した。ついで、プラスミドベクターpUC119をKpnIで消化し、アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した後、上記の約9kbのDNA断片と混合してライゲーションを行い、イー・コリJM109に導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、上記の約9kbのDNA断片1分子のみが含まれているものを選んで、これをプラスミドpTC1と命名し、また、該プラスミドによって形質転換されたイー・コリJM109をEscherichia coli JM109/pTC1と命名した。
図14にプラスミドpTC1の制限酵素地図を示す。
上記プラスミドpTC1をKpnIで消化後、さらに、BamHI、PstI、SphIでそれぞれ消化し、1%アガロースゲルを用いて電気泳動した後、上記のプロテアーゼ遺伝子を含むファージDNA断片の検出と全く同じ操作により、メンブレンへのDNA断片のトランスファーおよび超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含むDNA断片の検出を行った。得られたオートラジオグラム上のシグナルより、プラスミドpTC1をKpnIとBamHIで消化して得られる約5kbのDNA断片に超耐熱性プロテアーゼ遺伝子が含まれていることが示された。
図15にプラスミドpTC3の制限酵素地図を示す。
上記プラスミドpTC3に含まれる超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列を決定するために、配列表の配列番号10および11に示される塩基配列をもとに、プライマーとして用いる6種のオリゴヌクレオチドを合成した。配列表の配列番号12、13、14、15、16および17に合成したオリゴヌクレオチドTCE−2、TCE−4、SEF−3、SER−1、SER−3およびTCE−6Rの塩基配列を示す。上記のオリゴヌクレオチドをプライマーに、プラスミドpTC3を鋳型に用いたジデオキシ法により得られた結果を総合して、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
酵素標品の調製
実施例2で得られた、本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を含有するプラスミドpTPR36を導入したイー・コリJM109、Escherichia coli JM109/pTPR36を100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地(トリプトン10g/リットル、酵母エキス5g/リットル、NaCl 5g/リットル、pH7.2)5ml中で37℃で14時間振とう培養した。1リットル容の三角フラスコに同様の培地200mlを準備し、上記の培養液2mlを接種して37℃で10時間振とう培養した。培養液を遠心分離して得られた湿重量1.6gの菌体を2mlの20mM トリス−HCl、pH8.0に懸濁した後、超音波処理を行い、遠心分離して上清を得た。この上清を100℃で5分間処理した後、再度遠心分離して得た上清を粗酵素液(酵素標品PF−36)とした。
図16に本発明により得られる超耐熱性プロテアーゼの熱安定性を、また図17に本発明により得られる超耐熱性プロテアーゼの至適pHを示す。さらに、図18は各サンプル(酵素標品 PF−36、酵素標品 PF−13、酵素標品 PF−BS13およびライゼート)のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の活性染色の結果を示す図であり、各サンプル共にSDSの存在下、95℃で活性を示した。
Claims (2)
- 配列表の配列番号3、4、5および6で表される塩基配列から選択されるDNAをプライマーとし、ピロコッカス・フリオサスまたはサーモコッカス・セラーの染色体DNAを鋳型としたPCRによって増幅されるDNAに0.5%SDS、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%フィコール400、0.01%変性サケ精子DNAを含む6×SSC中、50℃で12〜20時間インキュベートした後、0.5%SDSを含む0.1×SSC、50℃で洗浄する条件においてハイブリダイズ可能なDNAを単離する工程を包含することを特徴とする、超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の単離方法。
- 配列表の配列番号3、4、5および6で表される塩基配列から選択されるDNAをプライマーとし、ピロコッカス・フリオサスまたはサーモコッカス・セラーの染色体DNAを鋳型としたPCRによって増幅されるDNAをプローブに用いて、0.5%SDS、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%フィコール400、0.01%変性サケ精子DNAを含む6×SSC中、50℃で12〜20時間インキュベートした後、0.5%SDSを含む0.1×SSC、50℃で洗浄する条件下、超好熱菌のゲノムDNAのライブラリーとのハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする、請求項1記載の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の単離方法。
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