JPH06245768A - アルカリプルラナーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アルカリプルラナーゼをコードする約６．３
Kbの塩基対からなり、図２に示す制限酵素地図を有する
ＤＮＡ断片を含有する組換えベクターにより形質転換さ
れた形質転換体を培養してアルカリプルラナーゼを製造
する方法。 【効果】 この方法を用いれば、洗浄剤の配合成分とし
て有用なアルカリプルラナーゼを大量かつ安価に製造す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子組換え技術により
得られる洗浄剤の配合成分として有用なアルカリプルラ
ナーゼ及びその製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】プルラナーゼは、プルラン分子中に存在
するα−１，６グルコシド結合のみを切断し、最終的に
マルトトリオースを生成する酵素で、ＢｅｎｄｅｒとＷ
ａｌｌｅｎｆｅｌｓ〔Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｚ．，３３
４，７９（１９６１）〕により、アエロバクター アエ
ロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅ
ｓ）から初めて発見された。その後、バチルス エスピ
ー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）〔Ｊ． Ｊｐｎ． Ｓ
ｏｃ． Ｓｔａｒｃｈ Ｓｃｉ．，３０，２００（１９
８３）〕、バチルス アシドプルリティカス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）〔Ａ
ｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，５２，２２９３
（１９８４）〕、バチルス ステアロサーモフィラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）〔Ｅｕｒ． Ｊ． Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７，２４（１９８
３）〕、ストレプトコッカス ミティス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．，１０，３３（１９６８）〕、ラクトバチルス（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）〔澱粉科学，２８，７２
（１９８７）〕、クロストリジウム サーモヒドロスル
フリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｈｙ
ｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）〔Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉ
ｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂ．，４９，５（１９８５）；Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，２４６，１９３（１９８
７）〕、サーマス エスピー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓ
ｐ．）〔Ｊ． Ｊｐｎ． Ｓｏｃ． Ｓｔａｒｃｈ Ｓ
ｃｉ．，３４，１（１９８７）〕、クロストリジウムサ
ーモスルフロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅ
ｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ）〔Ａｐｐｌ． Ｍｉ
ｃｒｏｂ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３，５１１
（１９９０）〕等の微生物がプルラナーゼを生産するこ
とが報告されている。

【０００３】プルラナーゼはプルランのみならず、澱
粉、グリコーゲン、アミロペクチンやこれらの部分分解
により生じた分岐オリゴ糖中のα−１，６グルコシド結
合に対しても水解活性を有することが知られており、
「枝切り酵素」と呼ばれている。本酵素は、エンド型ア
ミラーゼ及びエキソ型アミラーゼと併用することによ
り、澱粉からグルコースやマルトース、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルト
ヘキサオースなどのマルトオリゴ糖を高収率で生産する
ことも見出されており、澱粉製造工業で近年注目されて
いる。

【０００４】一方、本発明者は、上述のプルラナーゼの
性質を利用し、プルラナーゼをα−アミラーゼと共に食
器用洗浄剤及び衣料用洗浄剤に配合することにより、主
に澱粉汚れに対して洗浄力が飛躍的に向上することを見
出し先に特許出願した（特開平２−１３２１９３号公
報）。

【０００５】しかしながら、自然界において従来見出さ
れているプルラナーゼのほとんどが、中性ないし酸性領
域において最大かつ安定な酵素活性を示す、いわゆる中
性若しくは酸性プルラナーゼに分類されるものであり、
食器用洗浄剤及び衣料用洗浄剤組成物としての必要条件
である、アルカリ領域で最大活性を示すか、又はアルカ
リ耐性を有するプルラナーゼ、いわゆるアルカリプルラ
ナーゼ或いはアルカリ耐性プルラナーゼの存在は、極め
て少ない。なお、ここでアルカリプルラナーゼとは、至
適pHをアルカリ領域に有するものをいい、アルカリ耐性
プルラナーゼとは、至適pHを中性から酸性領域に有する
が、アルカリ領域においても至適pHにおける活性に比較
して充分な活性を有し、かつ安定性を保持するものをい
う。また、中性とはpH６〜８の範囲をいい、アルカリ性
とはそれ以上のpH範囲をいう。

【０００６】従来知られているアルカリプルラナーゼ及
びアルカリ耐性プルラナーゼの生産方法としては、好ア
ルカリ性バチルス属細菌の培養によってアルカリプルラ
ナーゼを生産する方法が堀越ら（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ．２０２−１）〔特公昭５３−２７７８６号公報〕及
び本発明者ら（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−１８
７６）〔特開平３−８７１７６号公報〕により報告され
ているのみである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】好アルカリ性バチルス
属細菌が生産するアルカリプルラナーゼの遺伝子は未だ
取得されておらず、大量に生産させるべき遺伝子工学的
手段を講じることや、蛋白質工学的手法による当該酵素
の改良を行うことが困難であった。従って、本発明の目
的は遺伝子工学的手段によりアルカリプルラナーゼを大
量に生産する方法及びこれにより得られるアルカリプル
ラナーゼを提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは鋭
意検討した結果、好アルカリ性バチルス属細菌の染色体
を原料として用い、遺伝子組換えの手法によりアルカリ
プルラナーゼ遺伝子のクローニングに成功し、この遺伝
子を用いれば全く新しいアルカリプルラナーゼが大量に
製造できることを見出し、本発明を完成した。

【０００９】すなわち、本発明はアルカリプルラナーゼ
をコードする約６．３Kbの塩基対からなり、図２に示す
制限酵素地図を有するＤＮＡ断片を含有する組換えベク
ターによって形質転換された形質転換体微生物を培養
し、当該培養物よりアルカリプルラナーゼを採取するこ
とを特徴とするアルカリプルラナーゼの製造法、及び当
該方法により得られるアルカリプルラナーゼを提供する
ものである。

【００１０】本発明において、アルカリプルラナーゼ遺
伝子の供与体となる微生物としては、例えばアルカリバ
チルス属細菌の一種、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ａ
Ｐ１３７８が挙げられる。本菌株は、本発明者らが栃木
県栃木市の土壌より、菌体外に著量のα−アミラーゼ活
性を有するアルカリプルラナーゼＹを生産する菌株とし
て分離したものであり、微工研菌寄第１０８８６号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１０８８６）として寄託されている。当該
菌株の分類学的特性については、本発明者らによる特許
出願に係る特開平３−１０８４８２号公報に詳述されて
いる。

【００１１】ＤＮＡ供与菌体バチルス エスピー ＫＳ
Ｍ−１３７８から染色体ＤＮＡを得る方法としては、Ｍ
ａｒｍｕｒの方法〔Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，３，
２０８（１９６１）〕やＳａｉｔｏとＭｉｕｒａの方法
〔Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ，７
２，６１９（１９６３）〕等が挙げられるが、その他の
類似な方法を用いることもできる。

【００１２】調製された染色体ＤＮＡを制限酵素で切断
することによって、アルカリプルラナーゼ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を得ることができるが、用いる制限酵素の種
類としては、アルカリプルラナーゼ生産遺伝子に切断部
位が無い制限酵素であればいかなるものでも使用可能で
ある。また、部分的にしか切断を起こさない反応条件を
用いるのであれば、すべての制限酵素が使用可能であ
る。このように、制限酵素は用いる条件に応じて種々の
ものが選択可能である。

【００１３】一方、遺伝子組換えに用いる宿主・ベクタ
ー系としては、宿主菌株がアルカリプルラナーゼ遺伝子
を発現させることができ、また、ベクターが宿主菌中で
複製可能であり、組み込んだ当該遺伝子を安定に保持出
来るものであれば、いかなるものも使用することができ
る。例えば、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２系統株を宿主とするＥＫ系や
バチルス スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）Ｍａｒｂｕｒｇ系統株を宿主とするＢＭ系等が
挙げられる。宿主菌株の具体例として、ＥＫ系では、Ｈ
Ｂ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株等、ＢＭ系で
は、ＢＤ１７０株、ＭＩ１１２株等が挙げられる。ベク
ターとしては、上記に加えて、染色体ＤＮＡを切断した
制限酵素によって唯一箇所で切断されるベクターを用い
れば、染色体ＤＮＡ断片との結合の際に便利である。具
体的には、染色体ＤＮＡをＰｓｔ Ｉで切断した場合、
ＥＫ系ではｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１８等の
ベクター、またＢＭ系ではｐＵＢ１１０、ｐＢＤ８等の
ベクターが挙げられる。なお、染色体ＤＮＡの切断に用
いた制限酵素による切断点を持たない他のベクターで
も、結合の際にホモポリマー結合法〔Ｎｅｌｓｏｎ，
Ｔ．ａｎｄ Ｂｒｕｔｌａｇ，Ｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８，４１（１９８０）〕等
を用いることによって、利用することができる。上記の
染色体ＤＮＡ断片と制限酵素によって切断したベクター
ＤＮＡを結合させ、組換えプラスミドを作製するが、結
合の方法としては、ＤＮＡリガーゼを用いる方法やホモ
ポリマー結合法等が挙げられる。ＤＮＡリガーゼの例示
としては、大腸菌のＤＮＡリガーゼ及びＴ４ファージの
ＤＮＡリガーゼを挙げることが出来る。

【００１４】このようにして調製された組換えベクター
による宿主菌株の形質転換の方法は特に限定されない
が、例えば、ＥＫ系宿主菌株の場合、塩化カルシウム法
〔Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０）〕や
塩化ルビジウム法〔Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｆ．ａｎｄ Ｂａ
ｃｋｍａｎ，ｋ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ，６８，２５３（１９７９）〕等、またＢＭ系宿主
菌株の場合には、コンピテントセル法〔Ｃｏｎｔｅｎｔ
ｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｄａｂｎａｕ，Ｄ．，Ｍｏｌ． Ｇｅ
ｎ． Ｇｅｎｅｔ．，１７７，４５９（１９７９）〕や
プロトプラスト法〔Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ Ｃｏｈｅ
ｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．，１
６８，１１１（１９７８）〕等を用いることができる。

【００１５】形質転換株から目的とするアルカリプルラ
ナーゼ生産性遺伝子又はアルカリプルラナーゼ生産性遺
伝子を含む供与染色体ＤＮＡ断片が導入された微生物を
選択、分離する方法は特に限定されないが、ベクターが
有する抗生物質耐性等のマーカー発現を利用し第一次的
に選択し、次いで宿主のアルカリプルラナーゼ活性を指
標とする第二次的選択をする方法が好適である。具体的
には、例えばベクタープラスミドとしてＥＫ系のｐＢＲ
３２２を用い、このＰｓｔ Ｉ切断部位に染色体ＤＮＡ
のＰｓｔ Ｉ切断断片を挿入した場合には、本切断部位
を含むアンピシリン耐性遺伝子が失活することから、遺
伝子中にＰｓｔ Ｉ切断部位を持たないテトラサイクリ
ン耐性を指標として一次選択を行えばよい。次いで第二
次選択としては、着色プルラン〔Ｋａｎｎｏ，Ｍ．ａｎ
ｄ Ｔｏｍｉｕｒａ，Ｅ．，Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，４９．１５２９（１９８５）〕を含む適
当な寒天培地にレプリカ法によって移植し、培養を行
い、コロニーが出現した後にコロニー周辺のプルランを
分解し透明帯を形成する菌株を目的の形質転換体として
選択することができる。

【００１６】かくして得られた形質転換体の組換えプラ
スミドは、通常のプラスミド或いはファージＤＮＡ調製
法〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，（１９８２）〕を用いて調
製することができ、得られた組換えプラスミドの各種制
限酵素による切断パターンを電気泳動法等によって解析
することより、得られた組換えプラスミドがベクタープ
ラスミドとアルカリプルラナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断
片が結合したものであることを確認することができる。
本発明におけるアルカリプルラナーゼ遺伝子は、図１に
示したようにその両端がＰｓｔ Ｉ切断部位である約
６．３KbのＤＮＡ断片中に含まれている。

【００１７】本発明のアルカリプルラナーゼ遺伝子を含
む組換えベクターの好適な例としては、組換えプラスミ
ドｐＢＰ１０１（図１）が挙げられる。上記のプラスミ
ドは、ベクタープラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ Ｉ切
断部位に図１で示したアルカリプルラナーゼ遺伝子を含
む約６．３KbのＤＮＡ断片が挿入された約１０．７Kbの
組換えプラスミドである。得られた染色体ＤＮＡのＰｓ
ｔ Ｉ断片の詳細な制限地図を図２に示す。

【００１８】形質転換体の培養には、選ばれた宿主微生
物の培養に通常用いられる培地及び培養条件が用いられ
る。培地としては合成培地、天然培地のいずれも用いる
ことができる。例えば炭素源としては、グルコース、フ
ラクトース、マルトース、ラクトース、シュークロース
等が用いられる。窒素源としては、ＮＨ₄Ｃｌ、（Ｎ
Ｈ₄)₂ＳＯ₄ 、カザミノ酸、酵母エキス、マルトエキ
ス、ペプトン、肉エキス、バクトトリプトン、コーン・
スティープリカーなどが用いられる。その他の栄養源と
しては、Ｋ₂ＨＰＯ₄ 、ＫＨ₂ＰＯ₄ 、ＮａＣｌ、ＭｇＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ、ビタミンＢ₁ 、ＭｇＣｌ₂・７Ｈ₂Ｏなど
が使用できる。培養はpH４〜８、温度２８〜４０℃で５
〜９０時間通気攪拌培養により行うのが好ましい。

【００１９】培養物からのアルカリプルラナーゼの採取
は、培養菌体を遠心分離により集菌後、緩衝液にて洗浄
した菌体を、通常用いられる菌体破砕法、例えば超音波
破砕法、フレンチプレス法、ガラスビーズ法、リゾチー
ム処理法等を用いて菌体を完全に破壊することにより粗
酵素液が得られる。更に得られた粗酵素液は、通常酵素
精製に用いられる方法、例えば塩析、透析、イオン交換
クロマトグラフィー法、ゲル濾過法、ハイドロキシアパ
タイト等を用いた吸着溶出法などを組み合わせることに
より精製酵素とすることができる。

【００２０】前記の組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物の例としては、エシェリヒア コリ
ＨＢ１０１（ｐＢＰ１０１）株が挙げられる。本菌株
は、エシェリヒア コリ ＨＢ１０１に組換えプラスミ
ドｐＢＰ１０１を導入したものであり、エシェリヒア属
細菌の培養に用いられる培地、例えばＬＢ培地等で培養
することによりアルカリプルラナーゼを生産することが
できる。次にこの菌体からアルカリプルラナーゼを採取
する方法について詳述する。

【００２１】得られた培養液から菌体を集菌後、トリス
−塩酸緩衝液（pH８．０）に懸濁し、超音波破砕を行
い、再度遠心分離により不溶物を取り除き、上清液を得
る。次いで、該上清液に硫安を８０％飽和濃度になる様
に加え、上清液中のプルラナーゼを完全に沈澱させた。
次いで、１０mMトリス／塩酸緩衝液（pH９．０）で透析
後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール ６５
０Ｓカラムに吸着させ、１０mMトリス／塩酸緩衝液（pH
９．０）を用いて０〜１Ｍの食塩の濃度勾配により溶出
し、その活性画分を集め、平均分画分子量１０，０００
の限外濾過膜を用いて濃縮した後、０．１Ｍ食塩を含む
１０mMトリス／塩酸緩衝液（pH９．０）で一夜透析す
る。透析後、０．１Ｍ食塩を含む１０mMトリス／塩酸緩
衝液（pH９．０）で平衡化したセファクリルＳ−２００
カラムに吸着後、０．１Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶出
し、その活性画分を集める。得られた精製酵素はポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル１０％）及びソジウム
ドデシル硫酸（ゲル１０％）電気泳動で単一のバンドを
与え、活性収率は約４％であった。

【００２２】得られた本発明のアルカリプルラナーゼの
酵素化学的性質について、以下に説明する。尚、酵素活
性の測定法は次の緩衝液（各々１０mM宛）を用い、以下
の方法に従って行った。 pH４〜６ ：酢酸緩衝液 pH６〜８ ：トリス−塩酸緩衝液 pH８〜１１ ：グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝
液 pH１１〜１２：塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液

【００２３】酵素活性測定法：各種緩衝液中にプルラン
（反応系における最終濃度は０．２５％）を溶解させた
基質溶液０．９mlに、酵素液０．１mlを加え、５０℃
で、３０分間反応させた。反応後、３，５−ジニトロサ
リチル酸（ＤＮＳ）法にて還元糖の定量を行った。即
ち、反応液１．０mlにＤＮＳ試薬１．０mlを加え、５分
間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、４．０mlの脱イ
オン水を加えて希釈し、波長５３５nmで比色定量した。
酵素の力価は、１分間に１μmol のグルコースに相当す
る還元糖を生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とした。

【００２４】（酵素化学的諸性質） １）作用 プルラン及びアミロペクチンのα−１，６−グルコシド
結合を分解する。また、本酵素は表１に示す如く、澱粉
又はこれらの部分分解物のα−１，６−グルコシド結合
も加水分解する。

【００２５】

【表１】

【００２６】２）作用pH及び至適pH pH７．０から１０．０のpH範囲で作用し、至適pHをpH
８．５から９．５の範囲に有する。pH７．５〜１０．０
の範囲においても、至適pHにおける活性の４０％以上の
相対活性を有する。尚、アルカリプルラナーゼの活性は
０．２５％プルラン、１０mM酢酸緩衝液（pH４〜６）、
トリス−塩酸緩衝液（pH６〜８）、グリシン−食塩−水
酸化ナトリウム緩衝液（pH８〜１１）及び塩化カリウム
−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１１〜１２）の反応系を
用い、５０℃３０分間反応させて測定した結果を図３に
示す。

【００２７】３）pH安定性 pH６．０から１０．０で極めて安定であり、pH５．５〜
１０．０においても約３０％以上の活性を維持する。
尚、各pHにおけるプルラナーゼ活性を０．２５％プルラ
ン、１０mM酢酸緩衝液（pH４〜６）、トリス−塩酸緩衝
液（pH６〜８）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩
衝液（pH８〜１１）及び塩化カリウム−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（pH１１〜１２）の反応系を用い、５０℃で１
５分間反応させた結果を図４に示す。

【００２８】４）作用温度範囲及び最適温度 ４０〜６０℃の広範囲で作用し、その最適作用温度は約
５０℃に認められる（図５）。

【００２９】５）温度安定性 本酵素についてpH９．０の条件で温度を変化させ、各温
度で３０分間処理することにより失活の条件を調べると
５０℃までは極めて安定である（図６）。

【００３０】６）分子量 ソジウムドデシル硫酸電気泳動法による分子量は約１１
５，０００±５，０００である。

【００３１】７）金属イオンの影響 １mMのHg²⁺及びCd²⁺で強く、Zn²⁺でも若干阻害される。

【００３２】８）界面活性剤の影響 各種界面活性剤（例えば、アルキル硫酸エステルナトリ
ウム塩（ＡＳ）、ポリオシキエチレンアルキル硫酸エス
テルナトリウム塩（ＥＳ）、α−オレフィンスルフォン
酸ナトリウム（ＡＯＳ）、α−スルフォン化脂肪酸エス
テルナトリウム（α−ＳＦＥ）、アルキルスルフォン酸
ナトリウム（ＳＡＳ）、ＳＤＳ、石鹸及びソフタノー
ル）の０．０５％溶液で５０℃、１５分間処理しても殆
ど活性阻害は受けない。

【００３３】９）キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ（１０mM）、ＥＧＴＡ（１０
mM）、クエン酸（０．０．５％）及びゼオライト（０．
０５％）で殆ど活性阻害を受けない。

【００３４】

【発明の効果】本発明のアルカリプルラナーゼは、従来
のプルラナーゼに比較してアルカリ性側に（pH８．５〜
９．５）に至適pHを有し、更に広いpH範囲に於いても極
めて安定である。また、至適温度も５０℃であり、熱安
定性も５０℃までは極めて安定である。更に、界面活性
剤、キレート剤等の洗浄剤配合成分によっても殆ど阻害
を受けない。従って、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分
として、有利に使用することができるものであり、工業
的に極めて大きな意義を有するものである。更に本発明
によりアルカリプルラナーゼの安定な大量供給が可能に
なった。

【００３５】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではないて。

【００３６】実施例１ アルカリプルラナーゼを生産する好アルカリ性バチルス
属細菌の一種、バチルス エスピーＫＳＭ−ＡＰ１３７
８（ＦＥＲＭ Ｐ−１０８８６）より染色体ＤＮＡを調
製するにあたり、次に示す培地Ｉを用い、２００ml中
で、３０℃、３０時間、本菌株を好気的に生育させた。

【表２】 （培地１） プルラン ０．５ ％ 可溶性澱粉 ０．５ ％ トリプトン ０．２ ％ 酵母エキス ０．１ ％ ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．０３ ％ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０．１ ％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２ ％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．０２ ％ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．００１ ％ ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ ０．０００１％ Ｎａ₂ＣＯ₃ ０．５ ％ pH １０．０ （重量％）

【００３７】集菌後、ＳａｉｔｏとＭｉｕｒａの方法
〔Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ，７
２，６１９（１９６３）〕に従って、精製ＤＮＡを約２
mg得た。

【００３８】実施例２ 実施例１で得られた染色体ＤＮＡ１０μｇとベクタープ
ラスミドｐＢＲ３２２（ベーリンガー マンハイム社
製）１．５μｇを別々に制限酵素反応液（１０mMトリス
−塩酸緩衝液（pH７．５）、５mM ＭｇＣｌ₂・７Ｈ
₂Ｏ，１００mM ＮａＣｌ，１mM メルカプトエタノー
ル）に溶解し、これに制限酵素Ｐｓｔ Ｉ（ベーリンガ
ー マンハイム社製）１０単位を加え、３７℃で２．５
時間反応を行った。なお、プラスミドｐＢＲ３２２は、
更にアルカリフォスファターゼ処理により、５′−リン
酸残基を切除した。反応後、フェノール処理によって制
限酵素を除去した後、エタノール沈澱を行い、得られた
ＤＮＡの沈澱及び切断したベクタープラスミドｐＢＲ３
２２をリガーゼ反応液（２０mM トリス−塩酸緩衝液
（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ₂・７Ｈ₂Ｏ，１０mM
ジチオスレイトール、１mMＡＴＰ）５０μ１に溶解し
た。これにＴ₄ ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー マンハ
イム社製）２単位を加え、１６℃で１６時間反応を行
い、染色体ＤＮＡとベクタープラスミドの結合反応を行
った。

【００３９】実施例３ 実施例２で作製した組換えプラスミドによる大腸菌の形
質転換は、塩化カルシウム法〔Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎ
ｄ Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，
１５９（１９７０）〕に従って行った。宿主菌として
は、エシェリヒアコリ ＨＢ１０１株（Ｆ^- ｈｓｄＳ
２０ ｒｅｃＡ１３ ａｒａ−１４ ｐｒｏＡ２ ｌａ
ｃＹ１ ｇａｌＫ２ ｒｐｓＬ２０ ｘｙｌ−５ ｍｅ
ｔｌ−１ｓｕｐＥ４４ ｌｅｕＢ６ ｔｈｉ−１）を用
いた。形質転換処理を行った菌懸濁液をテトラサイクリ
ン（シグマ社製）２０μｇ／mlを含むＬＢ寒天培地
〔１．０％トリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母
エキス（ディフコ社製）、０．５％ＮａＣｌ、１．５％
寒天（和光純薬社製）〕に塗抹し３７℃で１６時間培養
した。次に、出現した約１０，０００個の形質転換体の
コロニーをＬＢ寒天培地（テトラサイクリン添加）にレ
プリカして増殖させた後、０．２％プルラン、０．８％
レッドプルラン〔Ｋａｎｎｏ，Ｍ．ａｎｄ Ｔｏｍｉｕ
ｒａ，Ｅ．，Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，
４９，１５２９（１９８５）〕、１mg／mlのリゾチーム
を含む寒天を重層し、３７℃にて５時間反応させた。目
的のアルカリプルラナーゼ遺伝子を有する株は、着色プ
ルラン簡易判定法により、本プレート上で透明なハロー
をコロニー周辺に形成する。こうしてアルカリプルラナ
ーゼ生産性を有するクローン１株を得た。

【００４０】実施例４ 実施例３で得られた形質転換株をＬＢ液体培地（テトラ
サイクリン添加）に接種し、３７℃で一夜前培養した
後、これを５００ｍｌのＭ９ＣＡ培地〔０．６％Ｎａ₂
ＨＰＯ₄ , ０．３％ＫＨ₂ＰＯ₄，０．０５％ＮａＣｌ，
０．１％ＮＨ₄Ｃｌ，０．２％カザミノ酸（ディフコ社
製），２mM ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．２％グルコー
ス，２０μｇ／mlテトラサイクリン）に移植し、３７℃
で４〜５時間振盪培養した。これにクロラムフェニコー
ル１７０mgを添加し、更に３７℃で１５時間振盪培養し
た。この培養液より遠心分離によって菌体を集め、アル
カリ溶菌法〔Ｂｉｒｎｂｏｉｍ, Ｈ．Ｃ．ａｎｄ Ｄｏ
ｌｙ, Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
７，１５１３（１９７９）〕とセシウム クロライド−
エチジウムブロマイド密度勾配遠心法〔Ｒａｄｌｏｆ
ｆ, Ｒ．，Ｂａｕｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｖｉｎｏｇｒａ
ｄ，Ｊ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，５７，１５１４（１９６７）〕を組み
合わせた方法〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，（１９８２）〕
に従って、組換えプラスミドを調製した（図１）。さら
に、詳細に解析を行うために、本プラスミドに各種制限
酵素を作用させた後、アガロースゲル電気泳動法によっ
て切断パターンの解析を行った。その結果に基づき、制
限酵素地図（図２）を作成したところ、本プラスミド
は、現在まで知られているプルラナーゼ遺伝子、例えば
バチルス ステアロサーモフィラス耐熱性プルラナーゼ
（特開平２−２３８７２号公報）等と異なる制限酵素地
図を示す新規なものであることが判明した。そこで、本
プラスミドをｐＢＰ１０１と命名し、またこれによっ
て、形質転換されたエシェリヒア コリ ＨＢ１０１株
をエシェリヒア コリ ＨＢ１０１（ｐＢＰ１０１）と
命名した。

【００４１】実施例５ エシェリヒア コリ ＨＢ１０１（ｐＢＰ１０１）をＬ
Ｂ液体培地（テトラサイクリン添加）にて培養後、集菌
した菌体をトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に懸濁後、
超音波破砕を行った。再度、遠心分離によって不溶物を
沈澱として取り除き、得られた上清液を無細胞抽出液と
した。対照として、ＨＢ１０１（ｐＢＲ３２２）株につ
いても同様に無細胞抽出液を調製し、これらのプルラナ
ーゼ活性を測定した。プルラナーゼ活性測定法は、４０
mMグリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．
０）とプルラン（終濃度０．２５％）を溶解させた基質
溶液０．９mlに酵素溶液０．１mlを加え、４０℃３０分
間反応させ、前記のＤＮＳ法にて還元糖の定量を行っ
た。この結果、表３に示したようにＨＢ１０１（ｐＢＰ
１０１）株の無細胞抽出液にはアルカリプルラナーゼ活
性が認められた。

【００４２】

【表３】

【００４３】実施例６ 実施例５で得られた無細胞抽出液を用い、生産されたプ
ルラナーゼについて（１）硫安沈澱（８０％飽和）、
（２）ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ（東洋曹逹社
製）クロマトグラフィー、（３）セファクリル Ｓ２０
０（ファルマシア社製）クロマトグラフィーにより精製
を行い、アルカリプルラナーゼを得た。得られたアルカ
リプルラナーゼについてデービス（Ｄａｖｉｓ Ｄ．
Ｊ．，Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，
１２１，４０４（１９６４））の方法に従って電気泳動
を行った後、クイック ＣＢＢ（和光純薬社製）で染色
して単一のバンドを与えることを確認した（図７）。

【００４４】実施例７ 実施例６で得られたアルカリプルラナーゼについて、常
法に従ってＳＤＳ電気泳動を行った（図８）。この結果
から、本酵素の分子量は１１５，０００±５，０００で
あった。

【００４５】実施例８ 実施例６で得られた精製酵素を用い、生産されたプルラ
ナーゼの至適pHを測定した。その結果、本酵素における
プルラナーゼ活性はpH９．２に最適作用pHを有するアル
カリプルラナーゼであることが明らかとなった（図
３）。また、この精製酵素は、前記の酵素化学的性質を
有することを確認した。

【００４６】

【図面の簡単な説明】

【図１】ベクタープラスミドｐＢＲ３２２を用いて調製
した組換えプラスミドｐＢＰ１０１の構築法を示す図で
ある。図中太線で示した６．３KbのＰｓｔ Ｉ断片に相
当する部分は、バチルス エスピー ＫＳＭ １３７８
株由来のアルカリプルラナーゼ遺伝子を含む部分であ
る。

【図２】ｐＢＰ１０１の制限酵素地図を示す図である。

【図３】組換えエシェリヒア コリ ＨＢ１０１（ｐＢ
Ｐ１０１）株の生産するプルラナーゼ活性の作用pH及び
至適pHを示す図である。

【図４】組換えエシェリヒア コリ ＨＢ１０１（ｐＢ
Ｐ１０１）株の生産するアルカリプルラナーゼ活性のpH
安定性を示す図である。

【図５】組換えエシェリヒア コリ ＨＢ１０１（ｐＢ
Ｐ１０１）株の生産するアルカリプルラナーゼ活性の作
用温度及び最適作用温度を示す図である。

【図６】組換えエシェリヒア コリ ＨＢ１０１（ｐＢ
Ｐ１０１）株の生産するアルカリプルラナーゼ活性の温
度安定性を示す図である。

【図７】組換えエシェリヒア コリ ＨＢ１０１（ｐＢ
Ｐ１０１）株の生産するアルカリプルラナーゼの電気泳
動の結果を示す図である。

【図８】組換えエシェリヒア コリ ＨＢ１０１（ｐＢ
Ｐ１０１）株の生産するアルカリプルラナーゼのソジウ
ムドデシル硫酸電気泳動の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/44 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/56 Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルカリプルラナーゼをコードする約
   ６．３Kbの塩基対からなり、図２に示す制限酵素地図を
   有するＤＮＡ断片を含有する組換えベクターによって形
   質転換された形質転換体微生物を培養することにより得
   られる下記性質を有するアルカリプルラナーゼ。 １）作用 プルランのα−１，６−グルコシド結合を分解してマル
   トトリオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン
   又はこれらの部分分解物のα−１，６−グルコシド結合
   を加水分解する。 ２）基質特異性 α−１，６−グルコシド結合で分岐した枝分れ構造を有
   する糖のうち、マルトトリオース以上の重合度を有する
   枝分れ構造を加水分解する。 ３）作用pH及び至適pH 作用pHは６．５〜１０．５の範囲であり、至適pHは８．
   ５〜９．５の範囲である。 ４）pH安定性 pH６．０から１０．０の範囲で極めて安定であり、pH
   ５．５〜１０．５の範囲においても、３０％以上の相対
   活性を有する（５０℃、１０分処理による）。 ５）作用温度範囲及び最適温度 ３５〜６０℃の範囲で作用し、その最適作用温度は約５
   ０℃である。 ６）温度安定性 ５０℃までは極めて安定である（pH９の１０mMグリシン
   −食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、３０分処理によ
   る）。 ７）分子量 ソジウムドデシル硫酸電気泳動法による分子量は１１
   ５，０００±５，０００である。 ８）金属イオンの影響 Hg²⁺及びCd²⁺で阻害される。 ９）界面活性剤の影響 アルキル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレ
   ンアルキル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィン
   スルフォン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エス
   テルナトリウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、ソ
   ジウムドデシル硫酸、石鹸又はソフタノールによって殆
   ど活性阻害を受けない。 １０）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸及びゼオライトで殆ど活
   性阻害を受けない。
2. 【請求項２】 アルカリプルラナーゼをコードする約
   ６．３Kbの塩基対からなり、図２に示す制限酵素地図を
   有するＤＮＡ断片を含有する組換えベクターによって形
   質転換された形質転換体微生物を培養し、当該培養物よ
   りアルカリプルラナーゼを採取することを特徴とするア
   ルカリプルラナーゼの製造法。